三七渣總黃酮提取及其抗氧化活性的研究

林曉，于恩江，劉珊珊，張萊娣，典靈輝

（廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808）

三七渣總黃酮提取及其抗氧化活性的研究

林曉，于恩江，劉珊珊，張萊娣，典靈輝*

（廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808）

采用超聲波輔助提取三七渣中總黃酮，并對其抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)。通過單因素試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間和提取功率對總黃酮提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化最佳提取工藝，得到三七總黃酮最佳提取工藝。結(jié)果表明，采用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇按照1∶10（g/mL）料液比在70℃下超聲提取1.5 h，超聲功率為70 W，總黃酮提取率為1.408%。三七總黃酮對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，并與總黃酮質(zhì)量濃度呈一定的量效關(guān)系，結(jié)果顯示三七總黃酮具有較好的抗氧化活性，作為一種天然的抗氧化劑具有較好的應(yīng)用前景。

三七；總黃酮；超聲波；提取工藝；抗氧化活性

三七（Panax notoginsen（Burk）F.H.Chen），又名田七，金不換，參三七，為五加科人參屬植物，是我國名貴的中藥材，以根、根狀莖入藥，具有化瘀止痛、消腫定痛的功效［1］。它的主要活性成分包括三七皂苷、黃酮皂苷、三七素、揮發(fā)油、多糖、甾醇類、常量和微量元素，氨基酸、蔗糖、無機(jī)鹽等［2］。近年來對三七活性成分的研究主要集中在皂苷類成分上，研究表明三七總皂苷具有心肌保護(hù)作用［3］、預(yù)防血栓和抗血栓作用［4］等。而關(guān)于三七總黃酮的研究則相對較少，尤其是三七渣中總黃酮的研究沒有相關(guān)報(bào)道。三七渣是某制藥廠用80%乙醇冷浸提三七提取總皂苷后剩余的藥渣。制藥廠對三七的用量非常大，大量三七渣被棄掉，為了將其變廢為寶，本研究對其總黃酮進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取三七渣中的總黃酮，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳提取工藝，同時(shí)對其提取物進(jìn)行抗氧化活性研究。本研究為三七渣的回收利用提供了新的方向，也為食用天然抗氧劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1原料與試劑

三七渣經(jīng)程紀(jì)倫老師鑒定為三七根（Panax notoginsen（Burk），某制藥有限公司提供；

F.H.Chen）；二苯代苦味酸自由基（DPPH）：Sigma公司；蘆丁對照品：上海生科試劑有限公司；無水乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器

KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器：蘇州江東精密儀器有限公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1三七總黃酮提取及含量測定

稱取藥材粉1.00 g于50 mL的三角瓶中，加入一定量體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，超聲提取一定時(shí)間，過濾，得濾液，用60%乙醇定容為10 mL。

精確稱取蘆丁對照品20 mg，加70%乙醇，超聲使其完全溶解，置于100 mL的容量瓶，搖勻，得到濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。分別精密吸取0.2mg/mL的蘆丁對照液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00置于10 mL容量瓶分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，以試劑作空白參比，參照《中國藥典》2010年版一部附錄VA紫外-可見分光光度法，于510 nm處測吸光度，以吸光度A和濃度C進(jìn)行回歸。得到回歸方程為：A=8.860 0C+0.012 4，R2=0.998 5。在0.02 mg/mL～0.10 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量。

1.3.2三七總黃酮的最佳提取條件的考察

以單因素試驗(yàn)考察提取條件，在此基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化三七總黃酮的最佳提取工藝。

1.3.3三七總黃酮對DPPH自由基清除的測定［5-6］

取各不同濃度提取液2.00 mL，加入DPPH乙醇溶液2.00 mL，搖勻后放置30 min，分別測定在517 nm處的樣品的吸光度值A(chǔ)i。2.00 mL DPPH乙醇溶液與2.00 mL乙醇溶液混合后在517 nm處的空白吸光度值A(chǔ)c。以95%乙醇溶劑為對照，根據(jù)以下公式計(jì)算提取液自由基的清除率：

式中：Ac為DPPH乙醇溶液與乙醇溶液混合后吸光度；Ai為待測樣品加入DPPH乙醇溶液后的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g三七渣粉末5份，分別加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為75%、80%、85%、90%、95%的乙醇，在60℃下超聲提取總黃酮。其結(jié)果見圖1。

圖1　乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.1Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of total flavonoids

由圖1可知，總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加呈先增加后減少的趨勢，乙醇濃度在90%時(shí)總黃酮的提取率最大。可能是由于三七黃酮類成分的極性較小，乙醇的體積分?jǐn)?shù)增加，對極性小的成分提取率高。

2.2提取溫度對總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g三七渣粉末5份，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇，分別在40、50、60、70、80℃下超聲提取總黃酮。其結(jié)果見圖2。

圖2　提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.2Effect of extraction temperature on extraction efficiency of total flavonoids

從圖2可知，在提取溫度從40℃上升到80℃的過程中，總黃酮提取率隨著溫度的上升呈先增加后減少的趨勢。溫度60℃時(shí)總黃酮提取率最大，因此，提取三七渣總黃酮的最佳溫度為60℃。黃酮溶解度隨著溫度升高而增大，但是溫度較高時(shí)，黃酮結(jié)構(gòu)容易破壞，因此，在溫度超過60℃時(shí)黃酮提取率降低。

2.3提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g三七渣粉末5份，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇，分別在60℃下超聲提取總黃酮0.5、1、1.5、2、2.5 h。其結(jié)果見圖3。

圖3　提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響Fig.3Effect of extraction time on extraction efficiency of total flavonoids

從圖3可知，當(dāng)超聲提取時(shí)間從0.5 h延長到2.5 h時(shí)，總黃酮的提取率先隨時(shí)間的延長而增加，后隨時(shí)間的延長而減少最后趨于平緩，并在1.5 h提取率最大。因此，三七渣總黃酮提取的最佳時(shí)間為1.5 h。

2.4提取功率對總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g三七渣粉末5份，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇，60℃下，分別于功率為60、70、80、90、100 W條件下超聲提取總黃酮。其結(jié)果見圖4。

圖4　提取功率對總黃酮提取率的影響Fig.4Effect of extraction power on extraction efficiency of total flavonoids

從圖4可知，在超聲提取功率從60W上升到100W的過程中，總黃酮的提取率先隨功率的增加而增加，后隨功率的增加而減少。在70 W時(shí)，總黃酮的提取率最大。因此，提取三七渣總黃酮的最佳功率為70 W。

2.5正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

為全面考察影響三七總黃酮的提取因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對影響總黃酮的提取的主要因素乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）和提取功率（D）進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果表明，4個(gè)因素對提取效果影響與前面單因素的試驗(yàn)結(jié)果相同，各因素水平之間的極差大小依次為C＞B＞A＞D，表明對總黃酮提取效果影響由大到小依次為提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇濃度＞超聲功率。由正交試驗(yàn)得最佳提取條件為A2B2C3D2。即乙醇濃度為90%，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為70℃，超聲功率為70 W。

表1　L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平Table 1Factors and levels of orthogonal test L9（34）

表2　L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of orthogonal test L9（34）

續(xù)表2L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2Results of orthogonal test L9（34）

2.6最佳工藝的驗(yàn)證

精確稱取3份1.00 g三七渣粉末，按照A2B2C3D2工藝重復(fù)3次，得總黃酮提取率為1.408%、1.396%和1.410%，RSD為0.62%，結(jié)果表明，此工藝穩(wěn)定、可行。

2.7對DPPH自由基的清除作用

不同濃度三七總黃酮提取液為10、20、30、40、50、60 μg/mL分別標(biāo)示為樣品1～6。

測得A空白=0.580，根據(jù)清除率公式計(jì)算清除率，其結(jié)果如表3。

表3　不同濃度三七總黃酮提取液對DPPH的清除作用Table 3Effect of different density total flavonoids on scavenging efficiency of DPPH from Panax notoginsen（Burk）F.H.Chen

由表3可知，三七總黃酮提取液對DPPH具有較好的清除作用，且三七總黃酮清除DPPH的能力隨著總黃酮量的增加而上升，即清除率與總黃酮的用量存在著一定的量效關(guān)系，且在提取液濃度為60 μg/mL時(shí)，清除效果最好，達(dá)到78.3%。

3結(jié)論

1）采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對三七渣總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到三七渣總黃酮超聲輔助最佳提取工藝條件：乙醇濃度為90%，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為70℃，超聲功率為70 W。在此條件下，三七渣粉末總黃酮的提取率為1.407 7%。

2）三七渣總黃酮對DPPH有較強(qiáng)的清除能力，且清除能力與質(zhì)量濃度呈一定量效關(guān)系。三七總黃酮較好的抗氧化活性，作為一種天然的抗氧化劑具有較好的應(yīng)用前景。

［1］蒲清榮，稅王先.三七藥理作用研究概述［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（24）：304-305

［2］張繼，趙朝偉，趙睿.三七的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2003，12（11）：76-77

［3］祖金濤.三七對心血管疾病的防治作用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1999，1（3）：36-39

［4］許軍，王階，溫林軍.三七總皂苷干預(yù)血栓形成研究概況［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2003，24（5）：46-47

［5］譚萍，方玉梅，張春生，等.苦蕎種子黃酮類化合物清除DPPH自由基的作用［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（12）：20-23

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Study on Extraction of Total Flavonids from Panax Notoginsen（Burk）F.H.Chen and Antioxidative Activity

LIN Xiao，YU En-jiang，LIU Shan-shan，ZHANG Lai-di，DIAN Ling-hui*
（Guangdong Medical College，Dongguan 523808，Guangdong，China）

Total flavones from the slag of Panax notoginsen（Burk）F.H.Chen were extracted by ultrasonic technology.Its antioxidative activity was assessed.L9（34）orthogonal design was applied on base of single factor to study the effects of ethanol concentration，temperature，treatment time，and ultrasound power on the yield of total flavones.Results showed that total flavones yield was 1.408%under the following optimum conditions 90%alcohol solution as solvent，temperature 70℃，time 1.5 h，ultrasonic power 70 W，extracting for one times.The total flavones had a remarkable scavenging effect on DPPH radical in a dose-dependent manner. Therefore total flavones from the slag of Panax notoginsen（Burk）F.H.Chen has a good application prospect as a natural antioxidant.

Panax notoginsen（Burk）F.H.Chen；total flavonoids；ultrasonic wave；extracting process；antioxidative activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.010

2014-07-21

東莞市國際合作項(xiàng)目（201350815200121）；東莞市醫(yī)療衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（201410515200139）

林曉（1981—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，本科，主要從事中藥有效成分的研究。