水蒸氣蒸餾與乙醇提取化橘紅葉成分的GC-MS分析

韓寒冰，王明陽，劉杰鳳，馬超，李海航

（1.廣東石油化工學院化學與生命科學學院，廣東茂名525000；2.茂名出入境檢驗檢疫局，廣東茂名525000；3.華南師范大學生命科學學院，廣東省植物發育生物工程重點實驗室，廣東廣州510631）

水蒸氣蒸餾與乙醇提取化橘紅葉成分的GC-MS分析

韓寒冰1，王明陽2，劉杰鳳1，馬超1，李海航3

（1.廣東石油化工學院化學與生命科學學院，廣東茂名525000；2.茂名出入境檢驗檢疫局，廣東茂名525000；3.華南師范大學生命科學學院，廣東省植物發育生物工程重點實驗室，廣東廣州510631）

分析比較水蒸汽蒸餾法與乙醇提取化橘紅葉化學成分的差異。通過水蒸汽蒸餾提取和無水乙醇超聲輔助提取化橘紅葉中的化學成分，運用GC-MS技術對其成分進行分離鑒定，用峰面積歸一化法進行定量分析。水蒸汽蒸餾提取法共分離出58種成分，鑒定出其中的18種，主要成分是：β-蒎烯（19.44%）、β-月桂烯（6.95%）、D-檸檬烯（10.49%）、γ-萜品烯（19.30%）和石竹烯（20.46%）等；乙醇提取法共分離出80種成分，鑒定出其中的43種，主要成分是亞油酸（16.8%）、硬脂酸（6.57%）、菜油甾醇（5.82%）、豆甾烯醇（7.12%）和扶桑甾醇氧化物（14.28%）等，同時鑒定了甲氧基香豆素、補骨脂素、佛手柑內酯、前胡內酯和橙皮油內酯等香豆素類化合物，以及柚皮素、角鯊烯和VE等活性成分。兩種不同的提取法共分離鑒定了18種相同的化學成分，乙醇提取法多分離鑒定25種成分。

GC-MS；化橘紅葉；水蒸氣蒸餾法；乙醇提取法

化橘紅為蕓香科植物化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）或柚［Citrus grandis（L.）osbeck］的未成熟果實的外果皮，是治療風寒咳嗽、健脾消食之常用中藥［1-2］。化橘紅主要有效成分為黃酮化合物和揮發油，目前，常采用水蒸氣蒸餾法［3］、蒸餾萃取法［4］、超臨界CO2萃取法［5］和溶劑提取法［6-8］等提取揮發油，但由于水蒸氣蒸餾過程中溫度高，揮發油成分容易丟失或發生氧化，其他方法原材料也要在50℃～60℃條件下烘干，極易造成揮發油成分中單萜或倍半萜烯類化合物散失或氧化，因此，鑒定的有效成分種類和含量出入較大。本實驗采用水蒸氣蒸餾法和乙醇提取法對化橘紅葉化學成分進行提取，采用GC-MS法對其成分進行分離鑒定，對比兩種方法提取的成分和含量的差別，為化橘紅葉資源的綜合開發利用和質量控制研究提供科學依據。

1材料與儀器

化橘紅原植物材料在2012年6月期間采自化州市林塵鎮祥秀化橘紅實業有限公司生產基地，植株經廣東省農業科學院果樹研究所向旭研究員鑒定為化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）的假西洋品種。樣品為30天葉齡的嫩葉，鮮材料磨成漿狀，經冷凍干燥后，再用研缽磨成粉末作提取用。

島津GCMS-QP2010plus型氣質聯用儀：日本島津公司；XY-FD-8L冷凍干燥機：上海欣諭儀器有限公司；無水乙醇和無水硫酸鈉等試劑均為分析純。

2方法

2.1水蒸汽蒸餾法

稱取500g化橘紅葉樣品粉末，置2000mL圓底燒瓶中，按2010年版中國藥典一部附錄XD揮發油測定法項下甲法操作［9］，提取5 h，經無水硫酸脫水得到淺黃綠色具濃郁香氣透明液體1.2 mL，取揮發油0.5 mL，用無水乙醇定容到5 mL，溶液過0.22 μm濾膜供測試用。

2.2乙醇提取法

準確稱取化橘紅葉樣品粉末1g置10mL的提取管中，加入10mL無水乙醇，在30℃超聲提取0.5h，離心，上清液于4℃冰箱中經無水硫酸鈉脫水24h，6000r/min低溫離心10min，上清液過0.22 μm濾膜供測試用。

2.3氣相色譜-質譜條件

HP-5石英毛細管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；升溫程序（起始溫度50℃，5℃/min升至150℃，8℃/min升至250℃，保持6.5 min）；進樣口溫度250℃；載氣（He）流速1.0 mL/min，進樣量0.2 μL；分流比5∶1。E I離子源，電子能量70 eV，掃描范圍m/z40～450。NIST 2010標準譜庫自動檢索，參考有關文獻資料，鑒定化學成分，按面積歸一化法計算各組分的相對含量。

3結果與討論

在上述GC-MS色譜-質譜分析條件下，測得葉提取成分GC-MS總離子流色譜圖見圖1。

圖1　水蒸氣蒸餾法（A）和乙醇提取法（B）提取成分的總離子流圖Fig.1Total ion chromatogram（TIC）of the extracts by steam distillation（A）and ethanol extraction（B）

分析范圍在5 min～39 min之間。從氣相色譜-質譜總離子流色譜圖中，水蒸氣蒸餾法提取的揮發油成分中分離出58個色譜峰，鑒定了18個化合物，占總量的90.99%；從乙醇提取法提取的成分中分離出80個色譜峰，鑒定43個化合物，占總量的88.38%。從圖1中可以看出，兩種提取方法的化學成分的差異很大，具體成分和相對含量分析結果見表1。

表1　水蒸氣蒸餾與乙醇提取化橘紅葉成分的GC-MS分析Table 1GC-MS analysis of the extracts by steam distillation and ethanol extraction from Citrus Grandis leaves

從表1可以看出，水蒸氣蒸餾法提取到的成分絕大部分是低沸點的單萜和倍半萜烯類化合物，主要有β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、γ-萜品烯和石竹烯，它們占分離成分總量的76.64%。乙醇提取法提取得到的化學成分種類多得多，脂肪酸及甾醇物質的含量最高，提取分離鑒定了多種香豆素類化合物、角鯊烯、柚皮素和VE等多種活性物質。

化橘紅葉中的主要成分β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、γ-萜品烯和石竹烯等是很好的香料成分，它們均具有祛痰、止咳、驅風、鎮痛和殺菌消炎等作用［8］，甲氧基香豆素、補骨脂素、佛手柑內酯和橙皮油內酯等香豆素類化合物具有抗氧化、抗菌抗病毒之功效［10］，柚皮素是柚皮苷的苷元，有研究表明它比柚皮苷具有高得多的活性［11］，角鯊烯和VE均為具有較強生物活性的物質，角鯊烯在血液中輸送活性氧的能力很強，VE能抑制脂質過氧化，清除自由基，兩者均可增加機體免疫功能，延緩人體衰老，預防和治療心血管疾病，被廣泛應用在醫療保健品和化妝品等方面［12］?；偌t葉片的資源豐富，每年疏枝帶來的大量葉片通常作為廢物丟棄。因此，深入研究葉的化學成分，對開發利用化橘葉揮發油、化橘紅葉保健茶或其它化痰止咳的藥用產品，有深遠的意義。

實驗結果表明，水蒸氣蒸餾法只能提取到部分的有效成分，乙醇提取法實驗材料用量少，操作過程簡單，樣品制備耗時少，提取得到的化學成分種類多，同時能最大限度減少揮發油成分的散失、氧化和轉化，分析的結果更接近其真實的種類數量和相對含量。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：69

［2］陳志霞，林勵.化橘紅藥材中香豆素類成分的研究［J］.中藥材，2004，27（8）：577-578

［3］黃蘭珍，林勵.化州柚果皮、花、葉有效成分的比較研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，19（3）：213-216

［4］李春，向能軍，沈宏林，等.化橘紅揮發油成分分析研究［J］.精細化工中間體，2009，39（4）：65-67

［5］陳連劍，李婷，李成.化橘紅超臨界CO2萃取物的GC-MS分析［J］.中藥材，2003，26（8）：559-560

［6］Han HB，Li H，Hao RL，et al.One-step column chromatographic extraction with gradient elution followed by automatic separation of volatiles，flavonoids and polysaccharides from Citrus grandis［J］. Food Chemistry，2014，145：542-548

［7］陳曉穎，郭曉玲，梁從慶.氣相色譜-質譜聯用法比較化橘紅胎與化橘紅皮的脂溶性成分［J］.時珍國醫國藥，2007，18（2）：371-372

［8］劉濤，謝功昀.柑橘類精油的提取及應用現狀［J］.包裝與食品機械，2009，27（1）：44-48

［9］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［M］..北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄181

［10］Mokbel M，Suganuma T.Antioxidant and antimicrobial activities of themethanol extracts from pummelo（Citrus grandis Osbeck）fruit albedotissues［J］.European Food Research and Technology，2006，224（1）：39-47

［11］鄧少東，土蓮婧，林勵，等.UPLC法測定酸水解前后化橘紅中四種黃酮類成分的含量［J］.中華中醫藥雜志，2012，27（4）：924-928

［12］毛多斌，賈春曉，孫曉麗，等.幾種功能性植物油中角鯊烯和維生素E分析［J］.中國糧油學報，2007，22（2）：79-82

GC-MS Analysis of the Extracts by Steam Distillation and Ethanol Extraction from Citrus Grandis Leaves

HAN Han-bing1，WANG Ming-yang2，LIU Jie-feng1，MA Chao1，LI Hai-hang3
（1.College of Chemistry and Life Sciences，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China；2.Maoming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Maoming 525000，Guangdong，China；3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development，College of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China）

To analyse the chemical constituent of the extracts from leaves of Exocarpium Citrus Grandis by different extraction methods.The compounds were extracted by steam distillation and ethanol separately，constituents were separated and identified by GC-MS，and were quantified by the accuracy of area percent.58 components were separated，among which 18 were identified，the main components were β-Pinene（19.44%），β-Myrcene（6.95%），Limonene（10.49%），γ-Terpinene（19.30%）and Caryophyllene（20.46%）by steam distillation.80 components were separated，among which 43 were identified，the main components were fatty acids（23.27%）and sterols（27.22%），the main active ingredients were five cumarins（Herniarin，Ficusin，Bergapte，Ammidin and Aurapten），Naringenin，Supraene and Vitamin E in the alcohol extraction.18 chemical components of the extracts were the same by the two extraction methods，but there were more than 25 components in the alcohol extraction.

GC-MS；Citrus Grandis leaves；steam distillation；ethanol extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.029

2014-02-21

廣東省科技計劃項目（2013B020503069）

韓寒冰（1964—），女（漢），教授，碩士研究生，研究方向：天然產物的提取與分離。