HPLC法分析測(cè)定“黑美人”馬鈴薯中原花青素

楊曉輝，汪嶺，蔡慧珍，逯莉莉

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，寧夏銀川750004）

HPLC法分析測(cè)定“黑美人”馬鈴薯中原花青素

楊曉輝，汪嶺，蔡慧珍，逯莉莉

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，寧夏銀川750004）

建立高效液相色譜法分離測(cè)定“黑美人”馬鈴薯中原花青素含量的分析方法。實(shí)驗(yàn)采用C18柱（Phenomenex 5 μm；250 mm×4.6 mm）；V（甲醇）∶V（0.5%冰醋酸水溶液）=30∶70為流動(dòng)相；柱溫：25℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：287 nm。結(jié)果表明：原花青素在80 μg/mL～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.995 7，方法的精密度RSD為2.86%，平均回收率為100.1%，原花青素的平均含量為51.805 mg/g。本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于“黑美人”馬鈴薯中原花青素的含量的測(cè)定。

HPLC；“黑美人”馬鈴薯；原花青素

原花青素（Proanthocyanidins，簡(jiǎn)稱PC）是廣泛存在于植物界和食品中的一大類多酚化合物［1］，是近年來不斷研究開發(fā)的一種較強(qiáng)的體內(nèi)活性功能因子。據(jù)資料報(bào)道［2-6］，PC擁有強(qiáng)有力的抗氧化，清除自由基以及改善體循環(huán)的特殊功效，并能預(yù)防80多種因自由基而引起的疾病，包括心血管疾病、抗腫瘤、抗輻射、防血小板凝結(jié)的作用，其在人體內(nèi)的抗氧化和清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍。

PC來源廣泛，毒副作用低，遂成為具有廣闊發(fā)展前景的天然色素［7］。目前，PC已作為主要活性成分用于藥品及食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中，尤其是其中一些聚合程度較低的PC（簡(jiǎn)稱OPC）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了較充分的商業(yè)開發(fā)和應(yīng)用。目前大多數(shù)研究報(bào)道中都是利用甘蔗、葡萄皮、葡萄籽、蠶豆皮等提取PC的［2，5，8］，而且PC的提取方法已較為成熟。然而，由于PC組成和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其測(cè)定方法還無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因而在相關(guān)產(chǎn)品中含量的準(zhǔn)確表征始終是困擾市場(chǎng)的一個(gè)技術(shù)難題。

寧夏新大地黑土豆發(fā)展專業(yè)合作社所引進(jìn)的“黑美人”馬鈴薯是利用航天技術(shù)育種研發(fā)出馬鈴薯家族中的新品種?！昂诿廊恕瘪R鈴薯外形與普通馬鈴薯無異，但果皮呈黑紫色，富有光澤，最為奇特的是其果肉為深紫色，顏色誘人。據(jù)資料報(bào)道，“黑美人”馬鈴薯是一種集食用、藥用、保健于一體的特殊薯類新品種，其內(nèi)富含原花青素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，但其中原花青素的提取與測(cè)定方法文獻(xiàn)較少報(bào)道。本文以乙醇為提取劑，超聲波震蕩提取“黑美人”馬鈴薯中的PC，并利用HPLC法分離、鑒定并測(cè)定其含量，旨在確定快速、準(zhǔn)確、可靠的分離分析“黑美人”馬鈴薯中PC的方法，同時(shí)為更好的開發(fā)和綜合利用“黑美人”馬鈴薯資源和開發(fā)新品種的天然色素提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

“黑美人”馬鈴薯（購(gòu)自寧夏新大地黑土豆發(fā)展專業(yè)合作社）；PC標(biāo)準(zhǔn)品（北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院）；甲醇（色譜純）；無水乙醇（分析純）；冰醋酸（分析純）；超純水。

1.2儀器與設(shè)備

L-2000型高效液相色譜儀：日立公司；AL-204梅特勒分析天平：瑞士梅特勒；JYL-C012九陽(yáng)料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；KQ 3200DA型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市儀器廠；HP-01無油真空泵：天津市瑞森特儀器儀表商行；Neofuge 15R型高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；Heal Force超純水凈化儀：力新儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取干燥的PC標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用色譜純甲醇溶解后，準(zhǔn)確定容至50 mL，搖勻，制得濃度為200 μg/mL的PC標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。分別精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液4、5、6、7.5、10 mL至10 mL容量瓶中，用色譜純甲醇準(zhǔn)確定容至刻度，得到濃度分別為80、100、120、150、200 μg/mL的PC標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.2樣品的預(yù)處理

將“黑美人”馬鈴薯清洗干凈后，晾干，用榨汁機(jī)榨汁（在榨汁過程中不加入任何溶液）成勻漿后，分別準(zhǔn)確稱取10.0 g于6個(gè)燒杯中，按料液比1∶7.5加入75%的乙醇，在超聲振蕩器（功率為80%）中于60℃提取30 min。最后，將各燒杯中提取后的溶液在離心沉淀機(jī)上以1 000 r/min～3 000 r/min遞增的速度離心5 min，各取其上清液1 mL，用色譜純甲醇稀釋后，即得供試品溶液，待測(cè)。

1.3.3色譜條件

色譜柱：C18柱（Phenomene×5 μm；250 mm× 4.6 mm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：V（甲醇）∶V（0.5%冰醋酸水溶液）=30∶70；檢測(cè)波長(zhǎng)：287 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1 mL/min。

2結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)相的選擇

取1.3.1和1.3.2中制備好的標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品試液用0.45 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，流動(dòng)相的變化對(duì)“黑美人”馬鈴薯中PC的分離效果影響很大。實(shí)驗(yàn)中參照相關(guān)文獻(xiàn)［9-10］，分別嘗試用甲醇-水（10∶90）、甲醇-水（20∶80）、甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（20∶80）、甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（30∶70）、甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（25∶75）作為流動(dòng)相，根據(jù)分離情況，最后選定甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（30∶70）為流動(dòng)相，結(jié)果如圖1所示。

圖1　PC標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）及供試品（B）色譜圖Fig.1HPLC chromatograms of PC reference substance（A），and sample extract（B）

由圖1可知，此條件下“黑美人”馬鈴薯中PC與其他成分能很好的分離，且基線平穩(wěn)。采用此色譜條件測(cè)定“黑美人”馬鈴薯中PC的含量，結(jié)果較為滿意。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

繪制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2　PC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2The standard curve of PC

結(jié)果表明，所測(cè)PC在80 μg/mL～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，符合比爾定律，其回歸方程為A=59 742.52+2 098.49C，R=0.995 7。

2.3方法的精密度

按照1.3.2進(jìn)行樣品提取處理，在1.3.3色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定PC組分峰的峰面積，此法平行做6次，測(cè)定結(jié)果見表1，6次測(cè)定的RSD=2.86%，說明本方法的精密度良好。

表1　方法的精密度實(shí)驗(yàn)（n=6）Table 1Precision test of the method（n=6）

2.4樣品的加標(biāo)回收率

取1號(hào)、5號(hào)供試品做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)：平行取3份1 mL供試品，分別加入20、30、50 μL PC標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL），測(cè)定其含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2　樣品加標(biāo)回收率（n=3）Table 2The results of recovery test（n=3）

由表2可見，平均回收率在92.3%～108.9%之間，平均回收率為100.1%，符合分析方法要求。

2.5測(cè)定結(jié)果

在上述同樣條件下測(cè)定“黑美人”馬鈴薯中PC的含量，平行做6次，取平均值。測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3　“黑美人”馬鈴薯中PC含量（mg/g）Table 3Content of PC in“hei mei ren”potatoes（mg/g）

由表3可知，此方法下測(cè)得“黑美人”馬鈴薯中PC的平均含量為51.805 mg/g，較文獻(xiàn)所報(bào)道的其他類物質(zhì)中PC含量為高［9-10］，由于PC豐富的生理功效，“黑美人”馬鈴薯中PC適合于作為食品色素，可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、保健品等領(lǐng)域，值得進(jìn)一步研究。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法分離鑒定“黑美人”馬鈴薯中PC并測(cè)定其含量，所選用的色譜分析條件可使“黑美人”馬鈴薯中PC與其他成分很好的分離，該方法線性關(guān)系、精密度、重現(xiàn)性均良好，所測(cè)樣品的平均回收率為100.1%，“黑美人”馬鈴薯中PC含量為51.805 mg/g。測(cè)定結(jié)果表明，該方法可行，專屬性好，雜質(zhì)干擾小，可用于“黑美人”馬鈴薯中PC的分離、鑒定及含量的測(cè)定。

［1］北京醫(yī)學(xué)院，北京中醫(yī)學(xué)院.中草藥成分化學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1980：115

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［3］呂麗爽.天然抗氧化劑低聚原花青素的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2002，23（2）：147-150

［4］凌志群，張曉輝，謝筆鈞.原花青素的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（1）：9-12

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Analysis and Determination of Proanthocyanidins in“Heimeiren”Potatoes by HPLC

YANG Xiao-hui，WANG Ling，CAI Hui-zhen，LU Li-li
（College of Public Health，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

Proanthocyanidins in“Heimeiren”Potatoes was determined by HPLC.Phenomenex C18 column（5 μm；250 mm×4.6 mm）was used with the mobile phase of 30%methanol and 70%water（with 0.5%acetic acid）.The column temperature，flow rate and detection wavelength were 25℃，1 mL/min and 287 nm，respectively.The results showed that there was a good linear relationship between peak area and proanthocyanidins content within the range of 80 μg/mL-200 μg/mL.Linear correlation was 0.995 7，RSD of precision was 2.86%，the average recovery rate was 100.1%and the average content of proanthocyanidins was 51.805 mg/g.This method is simple，fast，accurate and reliable，suitable for determination of proanthocyanidins content in“Heimeiren”Potatoes.

HPLC；“Heimeiren”potatoes；proanthocyanidins

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.028

2013-12-06

寧夏醫(yī)科大學(xué)面上項(xiàng)目（XM2012015）

楊曉輝（1979—），女（漢），講師，碩士，研究方向：分析化學(xué)和衛(wèi)生檢驗(yàn)。