刺參內臟蛋白酶解液抗氧化活性研究

陶海英，閆鳴艷，尹利端

（1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東濟南250100；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003；3.煙臺新時代健康產業有限公司，山東煙臺264006）

刺參內臟蛋白酶解液抗氧化活性研究

陶海英1，閆鳴艷2，*，尹利端3

（1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東濟南250100；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003；3.煙臺新時代健康產業有限公司，山東煙臺264006）

采用小鼠D-半乳糖致衰老模型，通過測定小鼠肝臟和心臟中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量，進一步研究了刺參內臟蛋白酶解物酶解物的抗氧化活性。表明灌胃200 mg/kg·d酶解物可明顯提高小鼠肝臟和心臟中SOD和GSH-Px活力，并顯著降低MDA含量。說明刺參內臟蛋白酶解物在一定程度上能夠提高D-半乳糖模型衰老小鼠的抗氧化能力。

刺參；內臟，；酶解液，；抗氧化活性

刺參是一種高蛋白、低脂肪的無脊椎動物，具有很高的營養和藥用價值，被列為海產“八珍”之一，深受人們的喜愛［1］。近年來，隨著人們生活水平和保健意識的提高，其養殖、生產和銷售規模逐漸擴大，由此產生大量的下腳料，如內臟（腸、卵等）。研究發現這些下腳料含有豐富的蛋白質［2］，是制備生物活性肽的理想原料，然而這些下腳料并未得到有效利用，大部分被丟棄，造成環境污染和資源的浪費。目前已有由海參加工下腳料制備多肽的研究報道，閆鳴艷等以刺參內臟蛋白為原料通過菠蘿蛋白酶以及菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶復配的方法制備了抗氧化肽，并研究了其脫色脫腥工藝［3-5］；楊濤等利用堿性蛋白酶酶解海參內臟，發現其多肽具有較好的清除羥自由基和超氧陰離子自由基能力［6］；曹榮、李冬燕等對海參腸的酶解工藝及多肽的體外抗氧化活性進行了研究［7-8］。然而這些研究大多集中在多肽的制備工藝上，關于多肽的生物活性方面甚少全面研究。因此，本文以菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶復配的方法制備刺參內臟蛋白酶解液，通過研究小鼠D-半乳糖模型動物實驗，評價酶解液的體內抗氧化活性，為海參內臟多肽在食品、化妝品等領域的應用提供參考和依據。

1材料與方法

1.1材料儀器

刺參內臟：山東東方海洋科技股份有限公司提供，-20℃保存，實驗時4℃解凍。

食品級堿性蛋白酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司；食品級胰蛋白酶：湖北康寶泰精細化工有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH·）、D-半乳糖：Sigma；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、蛋白測定試劑盒（考馬斯亮藍法）：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。實驗動物昆明種小白鼠60只，清潔級，30日齡～35日齡，體重28 g～31 g，雄性，由山東綠葉制藥有限公司提供。

高速臺式冷凍離心機（TGL-16M）：長沙湘儀離心機儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S24）：上海精宏實驗設備有限公司；精密增力電動攪拌器（JJ-1）：江蘇金壇市雙捷實驗儀器廠；電子天平（AL204-IC）：梅特勒-托利多儀器有限公司；紫外可見分光光度計（721E）：上海光譜儀器有限公司；pH計（PHS-3C）：上海虹益儀器儀表有限公司；DY89-1電動玻璃均漿機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1刺參內臟蛋白酶解液的制備

刺參內臟蛋白酶解液制備方法參照文獻［4］。精確稱取一定量的刺參內臟，用6倍的蒸餾水勻漿，混合均勻，用1 mol/L的HCl或NaOH溶液調節至pH 6.3，加入菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶（總加酶量8 000U/g，二者酶活力配比為1∶3），在35℃條件下攪拌，水解2 h。水解結束后，沸水浴滅酶10 min，終止反應，然后冷卻至室溫，置于離心機中，8 000 r/min離心30 min，收集上清液，通過10 kDa的賽多利斯超濾膜后減壓濃縮，凍干得到刺參內臟蛋白酶解物。

1.2.2動物實驗

1.2.2.1昆明種小鼠亞急性衰老模型的建立

將昆明種小鼠60只適應性飼養7 d，隨機分組分為正常對照組，衰老模型組，陽性對照組和酶解物給藥高、中、低劑量組，每組10只。酶解物給藥組、陽性對照組與衰老模型組按100 mg/kg bw·d每日頸背部皮下注射D-半乳糖，注射量為0.1 mL/10g·bw，正常對照組每天注射等量生理鹽水，連續注射42 d。造模同時灌胃給藥。酶解物給藥組每天按200、100、50 mg/kg·d高、中、低3個劑量灌胃給藥，灌胃體積均為25 mL/kg；陽性藥物組（VE）每天50 mg/kg·d灌胃給藥；衰老模型組與正常對照組每日灌服等量生理鹽水。每周根據體重調整給藥量，每日給藥1次，連續42 d。

1.2.2.2一般情況觀察

每天觀察動物外觀體征、被毛、精神狀態、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便性狀、生殖器、死亡等情況并作記錄。每周稱量1次體重。

1.2.2.3抗氧化指標檢測

實驗小鼠于末次給藥后，禁食16 h脫臼處死。迅速取肝臟、心臟置于4℃生理鹽水中，洗凈表面殘留血跡，用濾紙吸干，立即稱濕重，加入預冷的生理鹽水，高速勻漿，離心取上清液，檢測SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

SOD的測定采用黃嘌呤氧化酵法。黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應系統將產生超氧自由基（O2-），后者氧化輕胺形成亞確酸鹽，通過顯色劑的作用呈現出紫紅色。當被測樣品中含超氧氣化物歧化酶時，則對超氧自由基有專一性的抑制作用，減少其亞稍酸鹽的生成，比色時對照管吸光度值高于測定管吸光度值，通過計算公式可得出樣品的SOD活力。將已經處理好的10%組織勻柴上清液，用生理鹽水將其稀釋為1%，根據試劑盒的要求操作，依次加入各試劑、樣品于10 mL的EP管中，禍旋儀混勾。立即放入37℃恒溫水浴鍋中40 min（秒計時），取出后迅速加入顯色劑混勻于室溫靜止10 min后于波長550 nm比色測定其吸光度值。

GSH-Px可促進過氧化氧（H2O2）與還原型谷胱甘肽（GSH）反應生成水（H2O）及氧化型谷胱甘肽，用酶促反應的速度來表示其GSH-Px的活力。測定此酶促反應中還原型谷胱甘肽（GSH）的消耗，則可通過計算得到酶的活力。最佳取樣濃度可分別取用10%、5%、1%、0.5%、0.2%、0.1%的組織勻漿200 μL進行預試驗，按照試劑盒操作說明，從不同的濃度組織上清液中取出0.2 mL進行檢測，得出最佳濃度為1%。制備好最佳濃度1%的各組織上清液，根據試劑盒的操作加入各試劑和樣本，充分混勻，離心（4 000 r/min，10 min），取出上清液1 mL作顯色反應。其顯色反應中需加入GSH標準品應用液及試劑盒的其他各試劑，渦旋儀混勻，于室溫靜止15 min后，412 nm測定各管的吸光度。

MDA的測定釆用TBA法。發生脂質過氧化反應過程中最后產物（MDA）能與硫代巴比妥酸結合，在此過程中產生的紅色產物于532 nm處具有最大吸收峰。根據試劑盒的說明操作，在測定管中加入0.1 mL準備好的組織勻漿的上清液標準管中，加入相同體積的濃度為10 nmol/mL的標準品，其空白管則加入無水乙醇，然后依次加入各試劑，渦旋儀混勻后，蓋上蓋子，放入95℃水浴鍋中40 min（秒表計時），取出各管立即流水冷卻離心（4 000 r/min、10 min）。輕吸上清（請勿吸到沉淀），在532 nm處測定各管的吸光值。

1.3數據統計分析

2結果與分析

2.1刺參內臟蛋白酶解物對小鼠生長和體重的影響體重是機體健康的重要指標，它也是反映疾病嚴重程度的重要指標，體重增加或減少過快都說明身體健康指數下降。體重在短期內丟失10%以上，很有可能有潛在的腫瘤發生。試驗期間，所有給藥組動物一般狀態良好，試驗期間，模型組與正常對照組、各給藥組與模型組動物體重比較，未見統計學差異（見表1）。說明刺參內臟蛋白酶解物未影響小鼠的正常生長，沒有任何毒副作用，同時皮下注射D-半乳糖沒有導致小鼠發生嚴重病變，注射劑量合適。

表1　小鼠試驗期間體重變化（±SD）Table 1Weight changes of mice during the experiment（±SD）

表1　小鼠試驗期間體重變化（±SD）Table 1Weight changes of mice during the experiment（±SD）

小鼠體重/g試驗前試驗1周試驗2周試驗3周試驗4周試驗5周試驗6周正常對照組29.24±1.8535.37±1.2639.02±2.0141.76±2.1542.62±1.8444.15±3.1046.26±3.97模型組29.80±2.3535.32±1.1038.80±2.3940.64±1.6942.16±1.8144.24±2.7946.06±2.69酶解物低劑量組30.32±1.6735.27±1.6038.47±1.7440.89±2.8542.23±2.0843.03±2.2845.87±3.50酶解物中劑量組30.15±1.7335.56±1.7638.13±1.9639.97±1.2642.03±2.2943.78±2.8746.04±2.21酶解物高劑量組29.24±2.0034.85±2.2038.19±2.3040.03±2.4341.99±2.4543.49±3.5445.78±4.60陽性對照組30.57±1.9635.36±2.6438.21±3.1239.86±2.8241.66±2.7943.61±3.1545.99±4.28組別

2.2刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器SOD活力的影響

超氧化物歧化酶（SOD）活力可以間接反映機體清除自由基的能力，它是體內重要的抗氧化酶，能專一性清除超氧陰離子自由基，當其活性下降時，會引起自由基產生過量，加速機體衰老［9］。表2為各實驗組小鼠肝臟和心臟中SOD活力測定結果。

表2　刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器SOD活力的影響（±SD）Table 2Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on SOD activities in mice organs（±SD）

表2　刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器SOD活力的影響（±SD）Table 2Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on SOD activities in mice organs（±SD）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

心臟SOD/（U/mg prot）正常對照組67.45±7.7621.62±3.26模型組44.99±5.19##13.14±2.54##酶解物低劑量組42.35±5.5513.03±2.67酶解物中劑量組50.87±6.41*16.36±3.86*酶解物高劑量組57.24±7.29**16.61±3.64*陽性對照組62.97±9.51**17.88±3.20**組別肝臟SOD/（U/mg prot）

可以看出模型組小鼠臟器SOD活力極顯著低于正常對照組（P＜0.01），表明實驗中小鼠衰老模型制備成功。同時酶解物中劑量組小鼠肝臟的SOD活力顯著高于模型組（P＜0.05），高劑量組極顯著高于模型組（P＜0.01），并與陽性對照組相當；另外酶解物中高劑量組小鼠心臟的SOD活力也顯著高于模型組（P＜0.05），表明刺參內臟蛋白酶解物在一定劑量下有提高SOD活力的作用。

2.3刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器GSH-Px活性的影響

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是機體內廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，有清除過氧化物和保護細胞免于氧化損傷的重要作用，其活性的變化可反映機體抗氧化能力的變化［10］。刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器GSH-Px活性的影響如表3所示。

表3　刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器GSH-Px活性的影響（±SD）Table 3Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on GSH-Px activities in mice organs（±SD）

表3　刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器GSH-Px活性的影響（±SD）Table 3Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on GSH-Px activities in mice organs（±SD）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

心臟GSH-Px（活力單位）正常對照組262.99±36.34315.08±34.23模型組180.70±29.83##244.42±25.48##酶解物低劑量組182.72±28.43245.96±20.97酶解物中劑量組200.81±14.02273.64±33.35*酶解物高劑量組228.01±23.15**278.85±38.95*陽性對照組241.46±22.90**286.20±34.85**組別肝臟GSH-Px（活力單位）

模型組小鼠肝臟和心臟GSH-Px活性極顯著低于正常對照組（P＜0.01），進一步表明實驗中小鼠衰老模型制備成功。酶解物高劑量組小鼠肝臟GSH-Px活性極顯著高于模型組（P＜0.01），并與陽性對照組相當，但均低于正常對照組；同時酶解物中高劑量組小鼠心臟GSH-Px活性顯著高于模型組（P＜0.05），表明刺參內臟蛋白酶解物在一定劑量下可延緩GSH-Px活性的降低。

2.4刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器MDA含量的影響

刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器MDA含量的影響見表4。

3結論

以D-半乳糖誘導的亞急性衰老小鼠為模型進一步驗證了刺參內臟蛋白酶解物的抗氧化活性。每天灌胃200 mg/kg·d的酶解物可明顯提高小鼠肝臟和心臟中SOD和GSH-Px活力，并顯著降低MDA含量。

體內抗氧化實驗證實了刺參內臟蛋白酶解液具有優良的抗氧化活性，有作為活性成分添加到食品、化妝品中的應用前景。

表4　刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器MDA含量的影響（±SD）Table 4Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on MDA contents in mice organs（±SD）

表4　刺參內臟蛋白酶解物對小鼠臟器MDA含量的影響（±SD）Table 4Effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on MDA contents in mice organs（±SD）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

心臟MDA（nmol/mgprot）正常對照組6.21±1.098.44±1.25模型組9.26±1.14##19.59±3.91##酶解物低劑量組9.24±1.0420.12±3.12酶解物中劑量組8.30±0.8816.21±3.42酶解物高劑量組7.84±1.10*13.26±2.08**陽性對照組（VE）7.65±1.49*10.97±1.96**組別肝臟MDA（nmol/mgprot）

丙二醛（MDA）是脂質過氧化的最終產物，是衡量機體衰老過程中脂質過氧化的重要指標，反映了機體受損程度，其含量越高，表明脂質過氧化程度越高［10］。從表4可以看出，模型組小鼠肝臟和心臟中的丙二醛含量明顯高于正常組（P＜0.01），分別增加了49%和132%，說明皮下注射D-半乳糖造成脂質過氧化物的嚴重積累，從而使機體受到損害。灌胃高劑量的酶解物可顯著降低小鼠肝臟和心臟中MDA含量（P＜0.05），并達到了對照物VE的水平，表明在動物體內刺參內臟蛋白酶解物是一種優良的抗氧化劑。

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Studies on Antioxidant Activities of Protein Hydrolysates from Sea Cucumber Viscera

TAO Hai-ying1，YAN Ming-yan2，*，YIN Li-duan3
（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji'nan 250100，Shandong，China；2.Yantai Institute of Coastal Zone，Research China Academy of Sciences，Yantai 264003，Shandong，China；3Yaitai New Age Health Co.，LTD，Yantai 264006，Shandong，China）

D-galactose subacute aging model of mice was built up for further on studying the antioxidant activities of protein hydrolysates from sea cucumber viscerahydrolysates，the capacity of SOD and GSH-Px and MDA content of mice in liver and heart were detected.Results showed that：the levels of SOD and GSH-Px activity were obviously increased in liver and heart of mice after fed hydrolysates 200 mg/kg·d every day，and MDA content was obviously decreased，suggesting that there was a remarkable antioxidant effect of protein hydrolysates from sea cucumber viscera on D-galactose subacute aging model mice.

sea cucumber；viscera；hydrolysates；antioxidant activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.014

2014-11-29

煙臺市科技發展計劃“刺參內臟抗氧化肽制備工藝及活性研究”（2011070）；山東省海洋經濟創新發展區域示范項目“海洋活性蛋白及其功能制品的開發與產業化”

陶海英（1977—），男（漢），畜牧師，大專，研究方向：多肽制備。

閆鳴艷，助理研究員，多肽制備。