紫蘇葉多糖純化工藝的研究

沈萃，謝三都，徐芳，高寧，林曉燕

（福建師范大學閩南科技學院，福建泉州362332）

紫蘇葉多糖純化工藝的研究

沈萃，謝三都*，徐芳，高寧，林曉燕

（福建師范大學閩南科技學院，福建泉州362332）

研究了Seveage法對紫蘇葉多糖的脫蛋白工藝。結果表明，氯仿與正丁醇的體積比為4∶1，樣液與Seveage試劑的體積比為1∶1，時間為30 min，次數為4次，紫蘇葉多糖的脫蛋白率為72.1%，多糖損失率為17.3%。紫蘇葉多糖提取液經活性炭脫色、Seveage脫蛋白后通過DEAE-纖維素柱層析，采用蒸餾水、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl洗脫液進行洗脫，分離得到紫蘇葉多糖Ⅰ（PLPⅠ）3.18μg/mL、紫蘇葉多糖Ⅱ（PLPⅡ）4.64 μg/mL、紫蘇葉多糖Ⅲ（PLPⅢ）12.22 μg/mL、紫蘇葉多糖Ⅳ（PLPⅣ）26.36 μg/mL、紫蘇葉多糖Ⅴ（PLPⅤ）32.63 μg/mL、紫蘇葉多糖Ⅵ（PLPⅥ）62.52 μg/mL六個紫蘇葉多糖組分。

紫蘇葉；多糖；脫蛋白；DEAE-纖維素；柱層析

紫蘇［Perilla frutescens（L.）Britt.］，又名白蘇、赤蘇、紅蘇、野蘇等，屬雙子葉植物綱、唇形科、紫蘇屬的一年生草本植物，被劃入中國衛生部首次頒布的藥食兩用的60種中藥之一［1-3］?，F代藥理學研究結果表明，紫蘇已經分離鑒定出百余種化學成分［4］，歸結為揮發油類［5］、脂肪酸類［6］、黃酮類［7］、酚酸類［8］、甾醇類［7］、維生素類［9］、苷類［10］、色素類［11］和萜類化合物［12］等，具有解熱鎮靜［13］、抗炎［14］、抗過敏［15］、止血［16］、降血糖［16］、降血脂［17］、抑菌［18］、止嘔［17］、抗微生物［19］、抗氧化［20］、促進記憶［21］等多方面的生物活性。張衛明等［3］的研究結果表明，紫蘇成熟葉片中含有17.68%的粗蛋白，幼葉中的粗蛋白含量高達28.14%。

本文以紫蘇葉多糖脫色液為原料，以紫蘇葉多糖脫蛋白率和多糖損失率為指標，在單因素的基礎上，采用正交試驗優化Seveage法對紫蘇葉多糖脫蛋白的最佳工藝條件；在此基礎上，為進一步提高紫蘇葉多糖的純度，采用DEAE-纖維素層析柱對紫蘇葉多糖進行柱層析分離，獲得較高純度的紫蘇葉多糖。本研究結果可為紫蘇葉多糖的進一步研究提供技術參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

紫蘇，采摘自泉州南安市野生紫蘇。

正丁醇、氯仿、牛血清蛋白標準品、考馬斯亮藍G-250、無水乙醇、葡萄糖標準品、檸檬酸緩沖液、苯酚、濃硫酸、氯化鈉等均為分析純；DEAE-Cellulose：上海恒信化學試劑有限公司。

1.2主要儀器

UV-2802S紫外可見分光光度計：龍尼柯上海儀器有限公司；HH-8型數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TDL-40B型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；PHS-3C型pH計：上海精密科學儀器有限公司；EG823LC-NA型微波爐：佛山市順德區美的微波電器制造有限公司；SBS-160自動收集器、HL-2S恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；1.6× 50 cm中壓特制玻璃層析柱：福州鑫裕華實驗儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1紫蘇葉多糖的提取工藝流程

紫蘇葉→清洗、瀝干→干燥→粉碎、過篩→提取→紫蘇葉多糖溶液

1.3.2紫蘇葉多糖損失率的測定

以葡萄糖標準樣為基準，采用苯酚-硫酸法［22］測定紫蘇葉多糖含量。所得標準曲線為Y=0.002 2X+0.023，Y表示吸光度OD490nm值；X表示葡萄糖溶液濃度，（μg/mL），R2=0.999 3，表明在0 μg/mL～40 μg/mL范圍內葡萄糖溶液濃度與吸光度呈良好的線性關系。

參照葡萄糖標準曲線繪制的測定方法測定紫蘇葉多糖提取液脫蛋白前后多糖含量，并按下列公式計算紫蘇多糖損失率：

式中：M0表示脫蛋白前紫蘇葉多糖質量，g；M1表示脫蛋白后紫蘇葉多糖質量，g。

1.3.3紫蘇葉多糖脫蛋白率的測定

1.3.3.1蛋白質含量的測定

以牛血清蛋白作為標準品，參照張永彬［23］等的方法，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量，所得標準曲線方程為：Y=568.2X-0.000 5，R2=0.999 2，表明在0～100 μg范圍內牛血清白蛋白質量與吸光度OD值呈良好的線性關系。式中：X表示牛血清蛋白質量，μg；Y表示吸光度值。

1.3.3.2紫蘇葉多糖脫蛋白率的測定

將經微波輔助提取獲得的紫蘇葉多糖提取液經活性炭脫色后，采用Seveage試劑進行脫蛋白，參照1.3.3.3中蛋白質含量測定方法并根據以下公式計算紫蘇葉多糖脫蛋白率：

式中：G0表示脫蛋白前紫蘇葉多糖的蛋白質質量，μg；G1表示脫蛋白后紫蘇葉多糖的蛋白質質量，μg。

1.3.4紫蘇葉多糖脫蛋白工藝的單因素實驗

以紫蘇葉多糖脫蛋白率和紫蘇葉多糖損失率為測定指標，進行Seveage試劑對紫蘇葉多糖脫蛋白的單因素實驗。

1.3.4.1氯仿∶正丁醇實驗

分別添加氯仿∶正丁醇（體積比）為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的Seveage試劑各100 mL于200 mL紫蘇葉多糖脫色液，在溫度為30℃條件下恒溫振蕩30 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清液；沉淀物重復脫蛋白1次，合并上清液，測定紫蘇葉多糖脫蛋白率和多糖損失率。

1.3.4.2樣液∶Seveage試劑實驗

紫蘇葉多糖脫色液與Seveage試劑（氯仿∶正丁醇=3∶1）的比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，在溫度為30℃條件下恒溫振蕩30min后，3000r/min離心5min，取上清液；沉淀物重復脫蛋白1次，合并上清液，測定紫蘇葉多糖脫蛋白率和多糖損失率。

1.3.4.3脫蛋白時間

紫蘇葉多糖脫色液與Seveage試劑（氯仿∶正丁醇=3∶1）的比例為2∶1，在溫度為30℃條件下分別恒溫振蕩30、40、50、60、70、80 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清液；沉淀物重復脫蛋白1次，合并上清液，測定紫蘇葉多糖脫蛋白率和多糖損失率。

1.3.4.4脫蛋白次數

紫蘇葉多糖脫色液與Seveage試劑（氯仿∶正丁醇=3∶1）的比例為2∶1，在溫度為30℃條件下分別恒溫振蕩30 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清液，測定紫蘇葉多糖脫蛋白率和多糖損失率；沉淀物重復脫蛋白1、2、3、4次，合并上清液，測定紫蘇葉多糖脫蛋白率和多糖損失率。

1.3.5正交試驗優化紫蘇葉多糖脫蛋白工藝

在單因素試驗的基礎上，以紫蘇葉多糖脫蛋白率和紫蘇葉多糖損失率作為指標，選取L9（34）正交表對A氯仿∶正丁醇（mL∶mL）、B樣液：Seveage試劑（mL∶mL）、C時間（min）和D次數進行優化試驗，確定紫蘇葉多糖脫蛋白的最優工藝條件。正交因素水平編碼設計見表1。

表1　試驗因素和水平表Table 1Factors and levels of the experiment

1.3.6紫蘇葉多糖的純化

將紫蘇葉多糖提取液經活性炭脫色、Seveage脫蛋白后通過陰離子交換柱DEAE-cellulose（1.6×50 cm），依次采用蒸餾水和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的NaCl溶液梯度各300 mL作為洗脫液對樣品進行洗脫，洗脫速度1.0 mL/min，每管12 mL，分步收集，采用苯酚-硫酸法［22］每隔5管檢測多糖含量，有零管時檢測該管前后兩管的多糖含量。

1.3.7數據處理

采用DPS2.0數據處理軟件對正交試驗結果進行極差分析和方差分析。

2結果與分析

2.1不同氯仿與正丁醇比例對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響

不同氯仿與正丁醇比例對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響見圖1。

圖1　不同比例的氯仿與正丁醇對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響Fig.1Effect of the different chloroform and 1-butanol ratio on deproteinization of perilla leaf polysaccharide

如圖1所示，紫蘇葉多糖的脫蛋白率隨氯仿與正丁醇比例的增加，先增大后減小。當氯仿與正丁醇比例為3∶1時，脫蛋白率達到最大值為55.8%；繼續加大二者比例，脫蛋白率反而下降。這是因為Sevage法是氯仿與正丁醇協同作用而達到脫蛋白的目的，其中，正丁醇起促進蛋白變性的作用；氯仿使變性后的蛋白在氯仿相和水相間形成一層膠狀物通過震搖、離心從而脫除［24］。因此，氯仿比例增加時，紫蘇葉多糖的脫蛋白率隨之增加，但氯仿量增加的同時正丁醇的量在減少導致這種協同作用效果減弱而引起脫蛋白率下降［24］。紫蘇葉多糖損失率隨氯仿與正丁醇比例的增加，先下降后上升。當氯仿與正丁醇比例為4∶1時，多糖損失率達到最小值為12.9%。綜合脫蛋白率和多糖損失率，氯仿與正丁醇比例宜選擇3∶1。

2.2樣液與Sevage試劑不同比例對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響

紫蘇樣液與Sevage試劑不同比例對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響見圖2。

圖2　不同比例的樣液與Seveage試劑對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響Fig.2Effect of the different sample solution and Seveage ratio on deproteinization of perilla leaf polysaccharide

如圖2所示，當樣液與Seveage試劑的比例為2∶1時，紫蘇葉多糖的脫蛋白率最高為57.2%，多糖損失率最低為17.3%，低于其它組。因此，樣液與Seveage試劑的比例為2∶1時脫蛋白效果較佳。

2.3脫蛋白時間對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響

脫蛋白時間對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響見圖3。

圖3　脫蛋白時間對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響Fig.3Effect of the removal time on deproteinization of perilla leaf polysaccharide

如圖3所示，隨著脫蛋白時間的延長，紫蘇葉多糖的脫蛋白率逐漸增加，多糖損失率呈先下降后增加的趨勢。當脫蛋白時間為30 min時，脫蛋白效果較好，此時蛋白脫除率達到55.1%，而多糖損失率僅為11.03%。

2.4脫蛋白次數對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響

脫蛋白次數對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響見圖4。

如圖4所示，紫蘇葉多糖的脫蛋白率隨著脫蛋白次數的增加而增加，當脫蛋白次數達到3次時，脫蛋白率達到62.9%；繼續增加次數，因為Seveage試劑主要脫除溶液中的游離蛋白，當脫蛋白次數達到3時，溶液中的游離蛋白已基本脫除，使得脫蛋白率未有明顯上升。而脫蛋白次數為2次時，多糖損失率最低為3.7%。綜合脫蛋白效果，脫蛋白次數應選擇3次為宜。

圖4　脫蛋白次數對紫蘇葉多糖脫蛋白效果的影響Fig.4Effect of the removal protein cycle numbers re-moving on of perilla leaf polysaccharide

2.5紫蘇葉多糖脫蛋白工藝的確定

紫蘇葉多糖脫蛋白正交試驗結果與分析如表2所示。

表2　正交試驗結果與分析Table 2The results and analysis of orthogonal experiment

根據表2正交試驗結果，對于Seveage試劑對紫蘇葉多糖的脫蛋白而言，脫蛋白率越高越好而多糖損失率越低越好。通過對k值的比較可知，選擇A3、B1、C3、D1為Seveage試劑對紫蘇葉多糖脫蛋白率的最優工藝條件，經測定紫蘇葉多糖脫蛋白率為73.6%；選擇A1、B2、C2、D3為Seveage試劑對紫蘇葉多糖損失最小的工藝條件，經測定紫蘇多糖損失率為9.6%。

從直觀分析發現，單獨分析紫蘇葉多糖的脫蛋白率和多糖損失率的最優工藝條件并不一致。因此，必須根據因素的影響主次，綜合考慮，才能確定最佳工藝條件。Seveage試劑對紫蘇葉多糖的脫蛋白率而言，比較各列的極差結果R值，可以發現RA＞RB＞RC＞RD，即在試驗所設定的因素中，氯仿：正丁醇對紫蘇葉多糖脫蛋白率的影響最大，其次是樣液：Seveage試劑和時間，最后是次數。Seveage試劑脫蛋白對紫蘇葉多糖造成的損失而言，比較各列的極差結果R值，可以發現RC＞RB＞RD＞RA，即在試驗所設定的因素中，時間對紫蘇葉多糖損失率的影響最大，其次是樣液∶Seveage試劑和次數，最后是氯仿∶正丁醇。對于因素A，即氯仿∶正丁醇，其對脫蛋白率的影響排第一位而對多糖損失影響排最后一位，故取A3；對于因素B，即樣液：Seveage試劑，其對脫蛋白率和多糖損失率均排在第二位，此時應取B1或者B2，當取B1時，取A1、B1、C2、D3條件下測定紫蘇葉多糖損失率為25.8%，增加了16.2%；當取B2時，取A3、B2、C3、D1條件下測定紫蘇葉多糖脫蛋白率為47.3%，減少了26.3%。因此，因素B應該取B1。對于因素C，即時間，其對脫蛋白率的影響排最后一位而對多糖損失率影響排第一位，故取C2。對于因素D，即次數，其對脫蛋白率的影響排在最后一位，而對多糖損失率的影響排第三位，故取D3。

綜上述，紫蘇葉多糖脫蛋白的最佳工藝條件應為氯仿與正丁醇比例為4∶1、樣液與Seveage試劑比例為1∶1、脫蛋白時間為30 min、脫蛋白次數為4次，在此條件下紫蘇葉多糖脫蛋白率為72.1%，多糖損失率為17.3%。

為判斷上述4個因素對紫蘇葉多糖脫蛋白率試驗結果的影響程度，根據極差分析結果可知脫蛋白次數對紫蘇葉多糖脫蛋白率的影響最小，故將該因素D當作空白項，應用DPS2.0數據處理系統對正交試驗結果進行方差分析，利用F值和P值來檢驗各因素對試驗指標的影響程度，分析結果見表3。

表3　方差分析表Table 3Table of analysis of variance

由表3可以看出，根據F值和P值的大小，因素A、B的影響極顯著，因素C的影響不顯著，因素D作為空白項。

為判斷上述4個因素對紫蘇葉多糖損失率試驗結果的影響程度，根據極差分析結果可知氯仿與正丁醇的比例對紫蘇葉多糖損失率的影響最小，故將該因素A當作空白項，應用DPS2.0數據處理系統對正交試驗結果進行方差分析，利用F值和P值來檢驗各因素對試驗指標的影響程度，分析結果見表4。

表4　方差分析表Table 4Table of analysis of variance

由表4可以看出，根據F值和P值的大小，因素C的影響顯著，因素B、D的影響不顯著，因素A作為空白項。

2.6紫蘇葉多糖的DEAE-纖維素柱層析分離

紫蘇葉多糖經DEAE-纖維素柱層析分離后，所得結果見圖5。

圖5　紫蘇葉多糖提取液經DEAE-纖維素柱層析的洗脫Fig.5Elution profile of the extraction solution of perilla leaf polysaccharide on DEAE-Cellulose column

如圖5所示，紫蘇葉多糖提取液經活性炭脫色和Seveage試劑脫蛋白后通過DEAE-纖維素柱層析，分別以蒸餾水、0.2、0.4、0.6、0.7、1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，分離得到6個峰，收集各峰對應的洗脫液，分別得到六個紫蘇葉多糖樣品：紫蘇葉多糖Ⅰ（PLPⅠ）、紫蘇葉多糖Ⅱ（PLPⅡ）、紫蘇葉多糖Ⅲ（PLPⅢ）、紫蘇葉多糖Ⅳ（PLPⅣ）、紫蘇葉多糖Ⅴ（PLPⅤ）、紫蘇葉多糖Ⅵ（PLPⅥ）。采用苯酚-硫酸法測定洗脫液中紫蘇葉多糖含量（體積均為1 mL），結果如表5所示。

由表5可知，紫蘇葉多糖提取液經DEAE-Cellulose柱層析分離出來的多糖質量總和與原液中多糖質量相近，說明經不同濃度洗脫液洗脫后，樣液中的多糖已基本流出層析柱；紫蘇葉多糖提取液經不同洗脫液濃度洗脫后分離得到的六個組分中多糖含量分別為PLPⅠ為3.18 μg/mL、PLPⅡ為4.64 μg/mL、PLPⅢ為12.22μg/mL、PLPⅣ為26.36μg/mL、PLPⅤ為32.63μg/mL、PLPⅥ為62.52 μg/mL。

表5　洗脫液中紫蘇葉多糖的質量Table 5The content of perilla leaf polysaccharide in eluant

3結論

Seveage法去除紫蘇葉多糖中的蛋白質的最佳工藝條件為氯仿與正丁醇的體積比為4∶1，樣液與Seveage試劑的體積比為1∶1，時間為30min，次數為4次，紫蘇葉多糖的脫蛋白率為72.1%，多糖損失率為17.3%。

紫蘇葉多糖提取液經活性炭脫色、Seveage脫蛋白后通過DEAE-Cellulose柱層析，再用蒸餾水、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl洗脫液進行洗脫，分離得到紫蘇葉多糖Ⅰ（PLPⅠ）、紫蘇葉多糖Ⅱ（PLPⅡ）、紫蘇葉多糖Ⅲ（PLPⅢ）、紫蘇葉多糖Ⅳ（PLPⅣ）、紫蘇葉多糖Ⅴ（PLPⅤ）、紫蘇葉多糖Ⅵ（PLPⅥ）六個紫蘇葉多糖組分，其多糖含量分別為PLPⅠ為3.18μg/mL、PLPⅡ為4.64μg/mL、PLPⅢ為12.22μg/mL、PLPⅣ為26.36μg/mL、PLPⅤ為32.63 μg/mL、PLPⅥ為62.52 μg/mL。紫蘇葉多糖經柱層析分離所得六個組分仍需進一步純化，其結構特征、分子量、理化特性等有待進一步的測定。

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Study on Purification Process of Perilla Leaf Polysaccharide

SHEN Cui，XIE San-du*，XU Fang，GAO Ning，LIN Xiao-yan
（Minnan Science and Technology Institute，Fujian Normal University，Quanzhou 362332，Fujian，China）

The conditions of deproteinization from perilla leaf polysaccharide were studied by using Seveage method.The result showed that the best operation condition was that，chloroform and1-butanol ratio of 4，sample liquid and Sevage liquid ratio of 1，protein removal time of 30 minutes and protein removal cycle numbers of 4，which the deproteinization rate was 72.1%and the loss ratio of polysaccharide was 17.3%.After decolor by activated charcoal and deproteinizate by Seveage，the extracting solution of perilla leaf polysaccharide could be separated by DEAE-cellulose column chromatography，and gradiantly eluted with distilled water，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L NaCl eluant to all can get six components named PLPⅠ3.18 μg/mL，PLPⅡ4.64 μg/mL，PLPⅢ12.22 μg/mL，PLPⅣ26.36 μg/mL，PLPⅤ32.63 μg/mL，PLPⅥ62.52 μg/mL.

perilla leaf；polysaccharide；deproteinization；DEAE-Cellulose；column chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.026

2013-12-11

國家級大學生創新性實驗計劃項目（201212992006）

沈萃（1990—），女（漢），學士，研究方向：食品科學。

謝三都（1984—），男（漢），講師，碩士。