左旋丁苯酞對慢性腦缺血大鼠海馬β-淀粉樣肽及Tau蛋白磷酸化的影響

羅　超　呂淑英　潘龍瑞　趙萬紅▲.湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北十堰44000；.湖北十堰鐵鋒醫院麻醉科，湖北十堰44000

左旋丁苯酞對慢性腦缺血大鼠海馬β-淀粉樣肽及Tau蛋白磷酸化的影響

羅超1呂淑英2潘龍瑞1趙萬紅1▲
1.湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北十堰442000；2.湖北十堰鐵鋒醫院麻醉科，湖北十堰442000

目的觀察左旋丁苯酞（L-NBP）對慢性腦缺血大鼠認知的改善作用以及對海馬β-淀粉樣肽（Aβ1-42）水平以及Tau蛋白磷酸化的影響，探討其作用機制。方法采用結扎雙側頸總動脈建立慢性腦缺血模型，實驗分四組：假手術組、模型組、L-NBP 30 mg/kg組和L-NBP 120 mg/kg組。假手術組、模型組予植物油灌胃治療，L-NBP 30mg/kg組和L-NBP 120mg/kg組連續給予45 d治療，用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學習和記憶能力。采用酶聯免疫吸附試驗法檢測大鼠海馬組織中Aβ1-42的含量；采用免疫印跡法檢測Tau蛋白的磷酸化水平，HE染色檢測海馬神經元的形態。結果在水迷宮空間探索實驗中，L-NBP 30 mg/kg組和L-NBP 120mg/kg組大鼠在目標象限時間百分比分別為（26.3±6.4）%和（28.6±5.8）%，與模型組［（15.2±5.2）%］比較，差異均有高度統計學意義（P＜0.01）；L-NBP明顯減少了大鼠海馬Aβ1-42含量，L-NBP 30mg/kg組和L-NBP 120mg/kg組分別為（1.07± 0.30）和（0.99±0.18），L-NBP 120mg/kg組與模型組（1.36±0.24）比較差異有高度統計學意義（P＜0.01）；L-NBP 30mg/kg組及L-NBP 120mg/kg組大鼠海馬組織磷酸化Tau蛋白表達水平［（1.72±0.18）、（1.43±0.35）］較模型組（1.82±0.23）明顯降低，L-NBP120mg/kg組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。HE染色觀察到L-NBP可明顯改善海馬神經元的形態異常。結論L-NBP改善慢性腦缺血大鼠的學習記憶缺陷，是通過減少海馬Aβ1-42的水平，減輕Tau蛋白的磷酸化，改善海馬神經元的形態異常，保護了海馬神經元。

左旋丁苯酞；β-淀粉樣肽；P-Tau蛋白；海馬

左旋丁苯酞（L-NBP）是丁苯酞光學異構體。在以往研究發現，3-N-Butylphthalide可以減輕大腦皮質B-淀粉樣肽含量水平，改善腦低灌注引起的血管性癡呆大鼠的學習記憶［1］。但不清楚L-NBP是否與大鼠海馬Tau蛋白的磷酸化和Aβ1-42的表達水平存在一定的關聯。通過結扎大鼠兩側頸總動脈制備慢性腦缺血的模型，觀察L-NBP對其海馬β-淀粉樣肽（Aβ1-42）含量改變、Tau蛋白Ser396位點磷酸化水平改變以及HE染色檢測海馬神經元的形態改變上，研究探討L-NBP的主要作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.2模型制備及給藥分組

大鼠手術前12 h禁食不禁水，麻醉用10%的水合氯醛按300mg/kg腹腔注射。模型組、L-NBP 30mg/kg組、L-NBP 120 mg/kg組游離大鼠兩側頸總動脈并永久性結扎3個月，假手術組游離大鼠兩側頸總動脈后不結扎，術后給予青霉素腹腔注射200 kU/d連續治療3 d。將大鼠分為假手術組、模型組、L-NBP 30mg/kg組、L-NBP 120 mg/kg組，每組各6只。假手術組、模型組給予花生油2 mL/kg灌胃；L-NBP治療兩組把L-NBP溶解于花生油中連續45 d分別給予30mg/kg組和L-NBP 120mg/kg組灌胃治療。

1.3檢測大鼠記憶行為能力

結束灌胃前5 d進行定位航行訓練，Morris水迷宮監測并記錄大鼠的游泳軌跡。在位航行訓練每只大鼠均接受每天2次，間隔10 min訓練尋找平臺。第6天移去平臺，進行空間探索實驗，讓大鼠尋找平臺自由游泳60 s記錄4個象限活動的時間。

1.4測定大鼠海馬Aβ1-42含量

水迷宮實驗結束后，斷頭取腦在冰浴上分離海馬，海馬組織勻漿。采用ELISA方法，對標準品倍比稀釋，Aβ1-42含量的測定方法按照試劑盒說明書進行，測定海馬中Aβ1-42含量。

1.5測定大鼠海馬磷酸化Tau蛋白表達水平

取海馬組織勻漿方法同上，采用Western blot方法，對蛋白條帶進行半定量分析用圖像分析軟件，磷酸化Tau蛋白的相對含量=磷酸化Tau條帶灰度值/內參Actin灰度值。

1997年，孟晚舟繼續研讀學業，在華中科技大學取得會計碩士學位，回到了華為的財務部門。根據華為官網的介紹，此后，孟晚舟建立了全球統一的華為財務組織，還歷任華為國際會計部總監、華為香港公司首席財務官、賬務管理部總裁。

1.6觀察大鼠腦組織形態

將大鼠4%多聚甲醛灌流后，取腦，用進行固定，然后做石蠟切片，HE染色法對海馬進行HE常規染色，觀察其CA1區形態改變。

1.7統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 L-NBP對慢性腦缺血大鼠學習記憶的影響

在Morris水迷宮空間探索第6天實驗中，撤去平臺后讓大鼠自由游泳60 s尋找平臺，記錄大鼠游泳軌跡，系統自動分析計算大鼠在平臺所在象限活動時間。模型組在目標象限時間百分比僅為（15.2±5.2）%，與假手術組大鼠［（33.5±4.5）%］比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。說明慢性腦缺血的大鼠學習記憶能力已經明顯下降。然而連續45 d L-NBP治療后，L-NBP 30 mg/kg組和L-NBP 120 mg/kg組大鼠在目標象限時間百分比分別為（26.3±6.4）%和（28.6±5.8）%，與模型組比較，L-NBP 120 mg/kg組大鼠的記憶能力有所改善（P＜0.01）。

2.2慢性腦缺血大鼠海馬CA1區形態變化

HE染色以不同顏色顯示細胞質和細胞核，可以清楚地看到細胞的大體形態。本研究中海馬CA1區，與假手術組比較，模型組可見神經元皺縮、深染、核不清晰，但程度略輕。連續給藥45 d，L-NBP 30mg/kg組輕度改善海馬神經元的形態異常。L-NBP 120mg/kg組明顯改善海馬神經元的形態異常（圖1）。表明該藥對慢性腦缺血引起海馬神經元損傷有保護和治療作用。

2.3 L-NBP減少了慢性腦缺血大鼠海馬β-淀粉樣肽含量

大鼠慢性腦缺血3個月后模型組與假手術組比較海馬Aβ-42含量顯著升高（P＜0.01）。L-NBP 30mg/kg組和L-NBP 120 mg/kg組連續藥45 d治療后均降低了海馬的Aβ-42含量，L-NBP 120mg/kg組與模型組比較差異有高度統計學意義（P＜0.01），提示該藥減少了Aβ-42在慢性腦缺血大鼠海馬表達，且呈一定的劑量依賴性。見表1。

圖1　慢性腦缺血海馬CA1區神經元（HE染色，400×）

表1　各組慢性腦缺血大鼠海馬β-淀粉樣肽含量

2.4 L-NBP對慢性腦缺血大鼠海馬Tau蛋白磷酸化水平的影響

大鼠慢性腦缺血3個月后，模型組大鼠海馬組織Tau蛋白相對含量（1.82±0.23）較假手術組（1.23±0.31）顯著升高（P＜0.01）。給藥45 d后，L-NBP 30 mg/kg組及L-NBP120 mg/kg組大鼠海馬組織磷酸化Tau蛋白［（1.72±0.18）、（1.43±0.35）］較模型組明顯降低，L-NBP120 mg/kg組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），表明在慢性腦缺血后L-NBP能有效降低海馬Tau蛋白磷酸化水平，且呈一定的劑量依賴性。見圖2。

圖2　慢性腦缺血海馬磷酸化Tau蛋白表達水平

3　討論

隨著年齡增長，部分老年人會出現動脈硬化狹窄等心血管相關疾病，使大腦處于持續低灌狀態，引起腦毛細血管血流量降低，最后導致近記憶和空間定向力障礙。流行病學調查發現，以長期的慢性腦供血不足引起血管性癡呆占很高的比例［2-3］。

海馬的CA1區神經元與動物的學習記憶力密切相關，缺血CA1區對缺血損傷最為敏感，可出現較為嚴重的神經損害［4］。海馬受損后主要是與近期的記憶有關，并且伴有空間定向障礙，本研究在海馬CA1區形態學可以觀察到L-NBP治療組可明顯的改善了因腦缺血引起的大鼠海馬神經元的形態異常。在行為學實驗Morris水迷宮采用空間探索，發現慢性腦缺血大鼠的記憶和空間辨別力明顯降低，在給予L-NBP治療后的兩個劑量均能不同程度地改善缺陷，并有一定的劑量依賴性。

APP在酶的作用下，形成的多肽片段，Aβ片段通過積聚、沉淀和纖維化具有毒性，其中Aβ1-42更具有破壞力。Aβ產生、降解和清除是一個動態平衡的過程。本實驗表明，大鼠腦缺血后Aβ表達增多。已有實驗表明在APP突變的轉基因鼠Aβ過度表達，進一步的體外實驗把Aβ注射入恒河猴的腦皮層，發現引起了TAU蛋白的磷酸化，也導致神經細胞的死亡增加［5-6］。Hernandez等［7］研究表明Aβ激活CDK-5途徑通過糖原合成酶激酶-3（GSK-3），使Tau蛋白過度磷酸化。Tau蛋白主要是促進微管的形成，誘導微管成束，保持其穩定性。但TAU蛋白過度磷酸化后導致微管蛋白結合降低喪失導致微管解聚崩解，過度的磷酸化Tau蛋白則自身形成PHF/HFT結構從而發生神經元纖維變性［8-9］，導致微管裂解，神經元營養不良［10］造成臨床癡呆癥狀。同時Aβ過表達能引起多種神經毒性，破壞胞內Ca2+濃度的穩態，誘導氧化應激和上調前凋亡基因bax等［11］。以上各種原因最終導致神經元的調亡，引起臨床患者的癡呆癥狀。這些研究均提示，Aβ量的增加或改變可能是血管性癡呆病理過程啟動因素。在本次實驗中大鼠腦缺血后3個月，海馬的Aβ產量顯著升高，同時Tau蛋白磷酸化水平也升高。大劑量的L-NBP給藥45 d后，可以顯著降低海馬的Aβ含量以及Tau蛋白磷酸化水平。這表明L-NBP可以減少了Aβ產量，同時也降低了Tau蛋白磷酸化水平。因此推測，L-NBP改善了腦缺血大鼠學習記憶功能，可以是通過抑制腦缺血后大鼠海馬Aβ產量，降低TAU蛋白磷酸化，穩定了微管蛋白最終了保護海馬神經元損傷。

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Effect of L-3-N-Butylphthalide on the P-Tau protein level andβ-am yloid peptide content in the hippocam pus of cerebral hypoperfused rats

LUOChao1LU Shuying2PAN Longrui1ZHAOWanhong1▲
1.School of Basic Medicine，Hubei University of Medicine，Hubei Province，Shiyan 442000，China；2.Department of Anesthesiology，Tiefeng Hospital，Hubei Province，Shiyan 442000，China

Objective To investigate the protective effects of L-NBP on the cognitive dysfunction andβ-amyloid peptide content and Tau protein phosphorylation on changes and HE staining morphology of hippocampal neurons in the hippocampus of cerebral hypoperfused rats and explore the possiblemolecularmechanism.M ethods Cerebral ischemic ratmodels were induced by ligating the bilateral common carotid arteries.The rats were divided into four groups of sham group，model group，L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group.The sham group and model group were administered oil，and L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group were with L-NBP for 45 days，and then，the spatial cognition was spatial probe in Morriswatermaze.HE stainingmorphology of hippocampal neurons and theβ-amyloid peptide content and the expression of phosphorylation Tau protein were detected by biochemicalmethod. Resu lts The time spent percentages in the platform-quadrant in L-NBP 30mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group were（26.3±6.4）%and（28.6±5.8）%，compared with L-NBP 120 mg/kg group and themodel group［（15.2±5.2）%］，the differencewas statistically significant（P＜0.01）；the expression of Aβ1-42 was reduced by the L-NBP，the expression of Aβ1-42 in L-NBP 30mg/kg group and L-NBP 120mg/kg group were（1.07±0.30），（0.99±0.18），compared L-NBP 120mg/kg group and themodel group（1.36±0.24），the differencewas statistically significant（P＜0.01）；Tau protein expression level of L-NBP 30 mg/kg group and L-NBP 120 mg/kg group［（1.72±0.18），（1.43±0.35）］were lower than that of themodel group（1.82±0.23），the difference between the L-NBP 120 mg/kg group and the model group was statistically significant（P＜0.05）.L-NBP could significantly improve protected themorphologicalabnormalities in hippocampal neurons.Conclusion L-NBP can improve the damage of cognition and decreaseβ-amyloid peptide content，thereby reduce phosphorylation of Tau protein levels and improvemorphological abnormalities of hippocampalneurons in the hippocampus of cerebral ischemic rats.

L-3-N-Butylphthalide；β-amyloid peptide；P-Tau protein；Hhippocampus

R74

A

1673-7210（2015）05（a）-0011-04

2014-12-02本文編輯：任念）

湖北省教育廳科研項目（D20102101）；湖北醫藥學院研究生啟動基金項目（2013QDJZR15）；湖北醫藥學院重點學科建設項目（2014XKJSXJ02）。