護心康對動脈粥樣硬化大鼠核轉錄因子-κB、血管細胞黏附分子-1及單核細胞趨化蛋白-1表達的影響

郭　樂　潘　坤　尹　勝　楊軍輝.湖南中醫藥大學圖書館，湖南長沙4008；.湖南中醫藥大學實驗室，湖南長沙4008；.湖南中醫藥大學動物中心，湖南長沙4008

護心康對動脈粥樣硬化大鼠核轉錄因子-κB、血管細胞黏附分子-1及單核細胞趨化蛋白-1表達的影響

郭樂1潘坤2尹勝3楊軍輝1
1.湖南中醫藥大學圖書館，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學實驗室，湖南長沙410208；3.湖南中醫藥大學動物中心，湖南長沙410208

目的研究護心康對大鼠動脈粥樣硬化防治的作用機制。方法采用高脂喂飼及一次性腹腔注射維生素D3復制大鼠動脈粥樣硬化模型，將護心康分為低、中、高3個不同劑量組進行干預治療，通過免疫組化法檢測給藥后主動脈中核轉錄因子-κB（NF-κB）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）及單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達情況。結果護心康低、中、高劑量組均有較好的降低動脈粥樣硬化大鼠主動脈中NF-κB、VCAM-1及MCP-1表達的作用（P＜0.01），其中NF-κB、VCAM-1的表達顯示出護心康中、高劑量組作用優于低劑量組，差異有統計學意義［NF-κB：（0.236 00±0.015 17）、（0.172 00±0.024 90）比（0.406 00±0.070 21）；VCAM-1：（0.462 00±0.085 56）、（0.410 00±0.047 43）比（0.622 00±0.085 56）］（P＜0.05）。結論護心康具有降低動脈粥樣斑塊中炎癥因子NF-κB、VCAM-1及MCP-1表達的功效，從而抑制大鼠動脈粥樣硬化的炎性反應，來達到對動脈粥樣硬化的保護作用。

護心康；動脈粥樣硬化；核轉錄因子-κB；血管細胞黏附分子-1；單核細胞趨化蛋白-1；大鼠

動脈粥樣硬化是許多心腦血管疾病的基礎性病理表現，嚴重威脅人類健康，冠心病是引起臨床上心絞痛、心肌梗死等一系列嚴重病癥的心血管疾病，其主要病理變化涉及的正是供應心肌血液的動脈發生的粥樣硬化。而隨著我國經濟的發展，雖然生活水平提高，但生活方式卻并沒有優化，運動漸少，壓力漸長，飲食不規律，且偏食已成為大多數人的生活常態，我國人群血壓、血脂、血糖等心腦血管危險指標均呈上升趨勢，例如冠心病的激增，應引起足夠重視。近年來隨著國內外學者的深入研究，動脈粥樣硬化的發病機制也越發清晰，產生了多個新的學說。其中炎性反應學說占據重要的位置，動脈硬化斑塊的發生、發展及不穩定性變化均證實與炎性反應有關［1］。本文觀察了護心康對動脈粥樣硬化大鼠核轉錄因子-κB（NF-κB）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）及單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）炎癥因子的干預作用?，F將實驗方法及結果報道如下：

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物

清潔級SD大鼠50只，雄性，體重270～290 g。由湖南中醫藥大學動物房提供，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2藥物

護心康片劑由湖南省中醫藥研究院附屬醫院制劑室生產，批號為（湘）衛藥劑20131104，由瓜蔞殼、茯苓、旋覆花、茜草、生蒲黃、遠志、山楂、玉竹等中藥精制加工而成，每片含生藥0.3 g，粉碎后制備成含生藥0.2 g/mL的混懸液。膽固醇、膽酸鈉（鄭州利偉生物化工廠）；丙基硫氧嘧啶（上海朝暉藥業有限公司）；維生素D3注射液（上海通用藥業股份有限公司）；市售白糖、豬油。

1.1.3試劑

NF-κB p65，VCAM-1，MCP-1兔源性單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供；二抗：SP-9000免疫組化試劑盒通用型（K122319A）由中山金橋有限公司提供；SP試劑盒由北京中山生物制劑公司生產；顯色劑：濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9018）由中山金橋有限公司提供。

1.1.4儀器

BX43研究型顯微鏡奧林巴斯；KD2258輪轉式石蠟切片機金迪；TP-8組織攤片機久圣醫療；202型電熱恒溫干燥箱中興；Forma Scientific電熱恒溫培養箱；BCD-222KSA冰箱海爾；微波爐海爾；MI動脈粥樣硬化醫學圖像分析管理系統麥克奧迪。

1.2方法

1.2.1造模

按文獻［2］的方法進行造模，每日給予高脂飼料3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎飼料，連續8周，并在喂食高脂飼料前一次性腹腔注射維生素D36×105U/kg，以建立動脈粥樣硬化模型。喂養8周后通過隨機抽樣，經蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠主動脈病理解剖，以確認動脈粥樣硬化斑塊是否造模成功，驗證模型復制成功后，將抽樣動物及死亡動物分別從相關組的統計學分析中剔除。

1.2.2分組與給藥

動物適應性飼養1周后，隨機抽取6只為正常組，予以普通飼料喂養。將剩余44只造模動物依據隨機數字表進行分組，隨機分為四組，分別為模型組、護心康低劑量組、護心康中劑量組、護心康高劑量組，每組11只。用藥組依據動物體重，參照動物與人體體表面積折算的等效劑量計算藥物具體劑量，實驗期間每周稱體重，根據體重變化調整給藥量。具體分組與用藥為：正常組給予蒸餾水灌胃；模型組：從造模后第57天起，蒸餾水灌胃；護心康低劑量組：從造模后第57天起，護心康灌胃給藥用量為0.41 g/（kg·d）；護心康中劑量組：從造模后第57天起，用護心康進行治療，護心康用量為0.81 g/（kg·d）；護心康高劑量組：從造模后第57天起，護心康灌胃給藥，用量為1.62 g/（kg·d）。各組每日灌胃體積10 mL/（kg·d），分2次灌胃，連續4周。

1.2.3取材

實驗8、12周后，用烏拉坦腹腔注射進行麻醉后，將大鼠面部向上固定于解剖板上，沿腹白線剖開腹腔，并向上剪開胸腔，將心臟暴露。隨后一手固定心臟，另一手將灌流針插入左心室，用血管鉗夾閉左心室固定灌流針，分別以生理鹽水和4%多聚甲醛進行灌注，觀察大鼠情況，尾部僵直、肺葉變白時停止灌注，于主動脈瓣至髂動脈分叉處剪斷，取主動脈、髂動脈分支處血管。

1.2.4檢測項目及方法

1.2.4.1 HE染色病理檢測將取材組織用4%多聚甲醛固定，經流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，切片，做HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.4.2動脈免疫組化檢測按免疫組化試劑盒操作要求染色：石蠟切片，常規脫蠟至水。3%雙氧水滅活，PBS洗3min共3次，抗原修復，PBS洗3min共3次，滴加封閉液，室溫（37℃）孵育20min，傾去，勿洗。滴加1∶100稀釋的一抗，37℃孵育2～3 h。PBS洗3 min共3次，滴加生物素化二抗工作液，室溫（37℃）孵育20min，PBS洗3 min共3次，滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液，室溫（37℃）孵育20 min，PBS洗3 min共3次，DAB顯色，自來水洗，蘇木精復染，脫水，透明中性樹膠封片，顯微鏡下見細胞漿或細胞核內有棕黃色或棕褐色顆粒即為陽性表達，每張切片選取細胞分布均勻的5個區域于400倍視野鏡下觀察照像，以MI動脈粥樣硬化醫學圖像分析系統測定其光密度值以進行定量分析，光密度值越高，表示其表達越強。

1.3統計學方法

所有數據經SPSS 16.0軟件進行統計學處理。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，均數間經方差齊性檢驗后，進行單因素方差分析，多重比較采用LSD-t和Dunnett-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組主動脈內膜HE染色病理變化

HE染色切片顯示，正常組血管壁層次結構清晰，主動脈壁內膜表面光滑完整，平滑肌排列整齊，無增厚；模型組動脈內膜可見隆起的斑塊，病灶表層為大量膠原纖維，有纖維帽的形成，可見炎癥細胞的浸潤，內膜下有泡沫細胞的聚集，確定大鼠動脈粥樣硬化模型建立成功。護心康低劑量組動脈壁斑塊厚度相較模型組斑塊厚度薄，病灶內可見一定量的泡沫細胞，護心康高、中劑量組斑塊厚度較低劑量組進一步降低。見圖1（封三）。

2.2護心康對大鼠主動脈VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表達的影響

VCAM-1、MCP-1主要表達于動脈內膜，內皮表面陽性著色為棕黃色反應產物沉積，NF-κB蛋白主要表達于細胞漿及細胞間質，五個組比較正常組主動脈染色較淺，呈淡黃色；模型組動脈內膜呈深棕黃色；3個護心康不同劑量組動脈內膜染色呈棕黃色，均較模型組顏色淺。模型組VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表達比正常組高，差異有高度統計學意義（P＜0.01），提示造模成功后，粥樣斑塊中VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表達升高。NF-κB在護心康高、中、低劑量組均較模型組低，差異有高度統計學意義（P＜0.01），護心康高、中劑量組較低劑量組有明顯降低，差異有高度統計學意義（P＜0.01），護心康高劑量組和中劑量組之間差異無統計學意義（P＞0.05）；VCAM-1在護心康高、中劑量組均較模型組低，差異有高度統計學意義（P＜0.01），護心康低劑量組與模型組之間差異無統計學意義（P＞0.05），護心康高、中劑量組較低劑量組有明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），護心康高劑量組和中劑量組之間差異無統計學意義（P＞0.05）；MCP-1在護心康高、中、低劑量組均較模型組低，差異有高度統計學意義（P＜0.01），護心康高、中、低劑量組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖2（封三）。

表1　護心康對大鼠主動脈NF-κB、VCAM-1及MCP-1蛋白表達平均光密度值的影響（±s）

表1　護心康對大鼠主動脈NF-κB、VCAM-1及MCP-1蛋白表達平均光密度值的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01；與低劑量組比較，△P＜0.05，◇P＜0.01；NF-κB：核轉錄因子-κB；VCAM-1：血管細胞黏附分子-1；MCP-1：單核細胞趨化蛋白-1

組別VCAM-1 MCP-1正常組模型組護心康低劑量組護心康中劑量組護心康高劑量組只數6 11 11 11 11 NF-κB 0.130 00±0.014 14 0.550 00±0.114 46*0.406 00±0.070 21▲0.236 00±0.015 17▲◇0.172 00±0.024 90▲◇0.290 00±0.055 23 0.722 00±0.184 17*0.622 00±0.085 56 0.462 00±0.085 56▲△0.410 00±0.047 43▲◇0.118 00±0.029 50 0.370 00±0.062 05*0.260 00±0.080 93▲0.212 00±0.035 64▲0.194 00±0.023 02▲

3　討論

動脈粥樣硬化是動脈壁疾病，是發生在大、中動脈的一種緩慢進展的粥樣硬化性疾病，它的特征是循環白細胞的聚集、黏附及跨越，血管內皮細胞轉移，伴隨著一系列化學因子、細胞因子和生長因子的產生，導致血管壁脂質的形成和纖維組織的損傷［3］。其中的NF-κB、VCAM-1、MCP-1等炎癥因子，大量研究都清楚地顯示了它們在動脈粥樣硬化中的作用及作用方式［4-7］。

MCP-1是具有趨化及活化單核細胞功能的重要細胞因子之一，可聚集單核/巨噬細胞遷移入動脈內皮下層，然后巨噬細胞通過攝取氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）形成泡沫細胞，加速動脈粥樣斑塊的形成。文獻報道，MCP-1的過量表達可以加速動脈粥樣硬化的進展和泡沫細胞的形成，而MCP-1的缺失可以減緩動脈粥樣硬化的進展［4-5］。Martinovic等［6］通過對263例志愿者的研究顯示，血漿MCP-1水平升高可以增加冠狀動脈粥樣硬化的發病風險。

黏附因子是參與細胞間、細胞與細胞外基質間黏附的一系列大分子，其中VCAM-1及細胞間黏附分子-1（ICAM-1）在動脈粥樣硬化的形成過程中起著重要的作用，其中VCAM-l早期表達促進了血管內皮的損傷［7］，在進展期則主要通過促進已遷入病灶的單核細胞的滾動、T淋巴細胞的激活，增加細胞間的相互作用及多種細胞因子的釋放，促進平滑肌細胞轉化和增殖，從而形成纖維斑塊，并影響斑塊的穩定性。張玉保等［8］研究發現VCAM-1在粥樣斑塊形成過程中持續表達，提示黏附分子在動脈粥樣硬化的早期與進展期均發揮著重要作用。

NF-κB是多種炎性反應相關基因的重要轉錄調控因子，在動脈粥樣硬化的發生和發展過程中，NF-κB可以調節一系列炎癥因子的基因的表達，包括MCP-1和細胞間黏附分子-1等的表達，與動脈粥樣硬化的炎性反應的放大與持續密切相關。近年來有學者認為，NF-κB是動脈粥樣硬化發生的始動機制之一，它可通過調控炎癥因子的產生，進而調節白細胞的聚集、泡沫細胞的形成以及影響硬化斑塊的穩定性，參與動脈粥樣硬化的發生、發展［9］。Benard等［10］報道在動脈粥樣斑塊中有NF-κB的活化，涉及的病變區域與細胞類型多樣，而在血管無粥樣斑塊的部位則未見或僅見輕微的NF-κB的活化。張玉保等［8］研究顯示經相關治療干預后，動脈粥樣硬化病灶中，能抑制NF-κB、VCAM-1的激活與表達，從而有效抑制炎癥，且NF-κB及VCAM-1的表達呈正相關，體現了NF-κB的重要調控作用。本研究顯示，在動脈粥樣硬化組動脈粥樣硬化內膜可見VCAM-1、MCP-1、NF-κB的表達明顯高于正常組，表明炎癥因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和發展。

動脈粥樣硬化根據其臨床表現，中醫將其歸屬于“胸痹”、“心痛”、“真心痛”、“中風”、“痰飲”、“脫疽”等范疇。本病病位在血脈，與肝、脾、腎有關，多為本虛標實。蔡光先教授根據多年的臨床經驗自擬護心康，其藥物組成為丹參、黃芪、瓜蔞皮、薤白、半夏、陳皮、茯苓、蒲黃、茜草、山楂、三七等十余味中藥，諸藥合用，體現了氣、痰、瘀同治，心肝脾共調的整體辨證思路［11-12］。

實驗研究表明，護心康能降低高血脂，降低血清和動脈粥樣硬化斑塊中TNF-α的表達，而抑制由此引發的血管壁炎性反應，從而起到治療冠心病的作用［11-12］。臨床研究也表明，護心康對痰瘀阻絡型冠心病、心絞痛有較好的療效，能有效改善心絞痛的發作癥狀和心電圖表現，降低全血黏度，同時提高患者的生存質量［13-14］。

此次實驗顯示護心康具有降低粥樣斑塊中NF-κB、VCAM-1、MCP-1蛋白表達的功效，對VCAM-1、NF-κB的影響，高、中劑量組明顯優于低劑量組，體現出劑量上的優勢。由此可見，護心康能夠抑制斑塊內炎性反應，從而穩定動脈粥樣硬化易損斑塊，并且與劑量有一定的相關性，為護心康應用于臨床提供更多有價值的微觀研究依據，其進一步的作用機制還在深入研究中。

［1］褚現明，李冰，安毅，等.炎癥與動脈粥樣硬化關系研究進展［J］.中國分子心臟病學雜志，2010，11（3）：184-188.

［2］楊鵬遠，芮耀誠，焦亞斌.動脈粥樣硬化大鼠實驗模型的建立［J］.第二軍醫大學學報，2003，24（7）：802-804.

［3］RossR.Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］.NEng I JMed，1999，340（2）：115-126.

［4］Aiello RJ，Bourassa PA，Lindsey S，etal.Monocyte chemoattractant protein-1 acceleratesatherosclerosis in apolipoprotein E-deficientmice［J］.Arterioscler Thromb Vase Biol，1999，19（6）：1518-1525.

［5］Gu L，Okada Y，Clinton SK，et al.Absence of monocyte chemoattractant protein-1 reduces atherosclerosis in low density lipoprotein receptor-deficientmice［J］.Mol Cell，1998，2（2）：275-281.

［6］Martinovic I，Abegunewardene N，Seul M，et al.EIevated monocyte chemoattractant protein-serum levels in patients at risk for coronary artery disease［J］.Circ J，2005，69（12）：1484-1489.

［7］武云濤，高迎春，周書明.血管內皮功能失調與冠心病［J］.中國現代醫學雜志，2003，5（13）：47-54.

［8］張玉保，董果雄，張社華.全反式維甲酸對兔頸動脈粥樣硬化病灶中NF-κB、P-選擇素及VCAM-1表達的影響［J］.復旦學報：醫學版，2010，37（5）：565-569.

［9］黃偉鵬，吳旻.核因子在心血管疾病中的研究進展［J］.醫學綜述，2012，18（18）：2950-2953.

［10］Benard C，Cultrone A，MichelC，etal.Degraded carrageenan causing colitis in rats ind uces TNF-Secretion and ICAM-1 upregulation in monocytes through NF-kappa B activation［J］.PLoSOne，2010，5（1）：e8666.

［11］屈波，蔡光先，劉柏炎，等.護心康對動脈粥樣硬化兔腫瘤壞死因子-1的影響［J］.湖南中醫藥大學學報，2008，28（3）：23-25.

［12］屈波，蔡光先，劉柏炎，等.護心康對動脈粥樣硬化兔模型血脂的干預研究［J］.實用預防醫學，2007，14（3）：686-687.

［13］蔡光先，胡學軍，鄭愛華.護心康片治療冠心病心絞痛86例［J］.中醫藥學刊，2003，21（3）：4501.

［14］蔡光先，胡學軍，劉柏炎.護心康片治療冠心病心絞痛及對患者生存質量的影響［J］.中國中醫急癥，2004，13（1）：9-10.

Effect of Huxinkang on expression of NF-κB，VCAM-1 and MCP-1 in ratsw ith atherosclerosis

GUO Le1PAN Kun2YIN Sheng3YANG Junhui1
1.Library，Hu'nan University of Chinese Medicine，Hu'nan Province，Changsha 410208，China；2.Laboratory，Hu'nan University of Chinese Medicine，Hu'nan Province，Changsha 410208，China；3.Animal Center，Hu'nan University of Chinese Medicine，Hu'nan Province，Changsha 410208，China

Objective To explore themechanism of Huxinkang（HXK）on prevention of rats with atherosclerosis（AS）. M ethods The ratswere fed with high cholesterol diet and given disposable intraperitoneal injection of vitamin D3to induce themodels，then，they were treated by low，middle and high dose of HXK.The levels of nuclear factor gene binding（NF-κB），vascular cell adhesionmolecule-1（VCAM-1）and monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）on aortic of AS rats were examined by immunohistochemistry in each group.Results All the low，middle and high dose groups could decrease the expression of aortic NF-κB，VCAM-1 and MCP-1 in rats（P＜0.01），and the effects inmiddle and high dose groupswere better than the expression of NF-κB，VCAM-1 in low dose group，the differences were statistically significant［NF-κB:（0.236 00±0.015 17），（0.172 00±0.024 90）vs（0.406 00±0.070 21）；VCAM-1:（0.462 00± 0.085 56），（0.410 00±0.047 43）vs（0.622 00±0.085 56）］（P＜0.05）.Conclusion HXK can decrease the expression of NF-κB，VCAM-1 and MCP-1 of inflammatory cytokines to inhibit the inflammation in aortic tissue of AS rats，so as to achieve the protective effect on atherosclerosis.

Huxinkang；Atherosclerosis；NF-κB；VCAM-1；MCP-1；Rat

R543.3

A

1673-7210（2015）05（a）-0019-04

2014-11-18本文編輯：張瑜杰）

湖南省中醫藥科研計劃項目（60010287）。

郭樂（1985.9-），女，碩士；研究方向：中西醫內科學。

楊軍輝（1969.4-），男，博士，副教授；研究方向：中醫診斷學。