蒙古沙冬青AmDREB2.1基因的克隆及表達(dá)分析

李章磊 高飛 曹玉震 張至瑋 王寧 李華云 周宜君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

蒙古沙冬青AmDREB2.1基因的克隆及表達(dá)分析

李章磊 高飛 曹玉震 張至瑋 王寧 李華云 周宜君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

基于已建立的蒙古沙冬青［Ammopiptanthus mongolicus（Masxim.）Cheng f.］根的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，分離到1個(gè)編碼DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AmDREB2.1。該序列全長(zhǎng)978 bp，包括531 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼176個(gè)氨基酸，具有典型的DREB轉(zhuǎn)錄因子保守的AP2結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，該基因能在根、葉中表達(dá)，但對(duì)干旱、低溫響應(yīng)不同，AmDREB2.1主要參與根的干旱脅迫應(yīng)答。

蒙古沙冬青；AmDREB2.1；序列分析；表達(dá)模式

沙冬青屬植物是亞洲中部地區(qū)唯一和特有的常綠闊葉灌木，是第四季冰川孑遺植物［1］，具有重要的研究?jī)r(jià)值。沙冬青屬為寡種屬，僅有蒙古沙冬青和新疆沙冬青2個(gè)種。蒙古沙冬青［Ammopiptanthus mongolicus（Maxim）Cheng f.］，也被稱(chēng)為沙冬青、冬青、蒙古黃花木，主要分布于我國(guó)內(nèi)蒙古、寧夏等地，具有抗旱、抗寒、抗風(fēng)蝕等特性，在我國(guó)西北部荒漠地區(qū)的生態(tài)平衡和水土保持中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也被認(rèn)為是研究林木抗逆機(jī)制、發(fā)掘抗逆基因資源的理想材料。近年來(lái)，關(guān)于沙冬青抗逆分子機(jī)制和抗逆功能基因的研究受到越來(lái)越多的重視［2-6］。

干旱、低溫等非生物逆境是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素。植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)是通過(guò)眾多基因的逐次表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，這些基因可分為功能基因和調(diào)節(jié)基因兩大類(lèi)。轉(zhuǎn)錄因子基因是一類(lèi)重要的調(diào)節(jié)基因，研究轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答中的作用有助于推進(jìn)對(duì)于植物逆境分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。DREB（dehydration responsive element binding）類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子屬于植物AP2/EREBP（ethylene-responsive element binding protein）轉(zhuǎn)錄因子大家族中的一個(gè)亞族，可通過(guò)其保守的AP2結(jié)構(gòu)域與多個(gè)逆境應(yīng)答基因啟動(dòng)子區(qū)的DRE（dehydration responsive element）/CRT（C-repeat responsive element）順式作用元件特異性地結(jié)合，在逆境脅迫下調(diào)控一系列下游逆境應(yīng)答基因的表達(dá)［7，8］。目前，研究人員已經(jīng)對(duì)DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因（擬南芥CBF3 /DREB1A［9］、水稻OsDREB1F［10］、玉米ZmDREB2［11］，煙草NbDREB-2a［12］）進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究，發(fā)現(xiàn)所獲得的轉(zhuǎn)基因植物能具有較高的干旱、高鹽或低溫耐受性。克隆和鑒定更多的DREB 類(lèi)基因用于篩選抗逆作物育種的候選基因已成為國(guó)內(nèi)外植物抗逆分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一［13］。

本研究以蒙古沙冬青為材料，基于實(shí)驗(yàn)室前期建立的蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)［2］，從中克隆得到1個(gè)新的DREB類(lèi)基因，對(duì)其序列特征、編碼蛋白的功能域及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，并對(duì)其逆境表達(dá)模式進(jìn)行研究，旨在為闡釋蒙古沙冬青DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)答干旱、低溫等逆境脅迫中的分子機(jī)制提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古沙冬青（A. mongolicus）種子采自寧夏自治區(qū)中衛(wèi)縣。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和PCR Master Mix購(gòu)自天根公司，膠回收試劑盒購(gòu)自Bio Teke公司，pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，SYBR Green Supermix購(gòu)自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)材料處理 種子經(jīng)播種、萌發(fā)培養(yǎng)4周后，采用含20% PEG6000的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，分別處理1、6、24和72 h。在低溫恒溫冷光源光照培養(yǎng)箱中，4℃下分別處理1、3、6和24 h；以未脅迫處理（0 h）為對(duì)照。分別取脅迫處理和未經(jīng)脅迫處理后的植物根和葉片組織，稱(chēng)量后迅速放入液氮中，用于基因的克隆和表達(dá)模式分析。

1.2.2 AmDREB2.1基因的克隆 采用本實(shí)驗(yàn)室改良的Trizol 法分別提取不同脅迫處理的植物根和葉片組織總RNA［14］，用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)，進(jìn)行DREB相關(guān)基因序列的搜索，獲得1個(gè)編碼DREB基因序列。采用Primer 5.0設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，引物序列為5'-GGCGGTGGTGTGATAAACTC-3'/5'-ATGCACCACAACACACGATT-3'。以反轉(zhuǎn)錄得到的未經(jīng)脅迫處理的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×Pfu PCR Master Mix 20 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 17 μL，總體積40 μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保溫。膠回收目的片段，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性克隆，送至北京華大基因公司測(cè)序。

1.2.3 AmDREB2.1基因的生物信息學(xué)分析 分別采用相關(guān)生物信息學(xué)軟件對(duì)獲得的蒙古沙冬青編碼DREB基因AmDREB2.1及演繹的氨基酸序列進(jìn)行分析，具體分析目標(biāo)及選用的相關(guān)軟件見(jiàn)表1。

表1 AmDREB2.1基因的生物信息學(xué)分析使用的相關(guān)軟件

1.2.4 AmDREB2.1的表達(dá)模式分析 根據(jù)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)基因檢測(cè)引物和內(nèi)參引物。用引物5'-GTGCCAGAGTGGATGCTCTT-3'/5'-ATGCACCACAACACACGATT-3'擴(kuò)增目標(biāo)基因AmDREB2.1，用引物5'-CTGACATGCGCCGTAGGAACG-3'/5'-CCCTGCTTATGCCAGTCTTTT-3'擴(kuò)增內(nèi)參基因AmeIF1（蒙古沙冬青的真核起始因子基因）。

采用qRT-PCR對(duì)不同脅迫處理下AmDREB2.1在根和葉片中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以未處理（0 h）為對(duì)照，以AmeIF1為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系（10 μL）：2×SYBR Green Supermix 5 μL， 上 下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，稀釋后cDNA模板0.8 μL，ddH2O 3.6 μL。 反 應(yīng) 于Bio-Rad MyIQ2熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，循環(huán)40次；55℃ 10 s（0.5℃/循環(huán)），循環(huán)81次。采用基因表達(dá)相對(duì)定量分析，將對(duì)照樣本的基因表達(dá)量設(shè)為1，處理樣本中的基因表達(dá)量變化的倍數(shù)用2-△△Ct來(lái)表示，其中：△△Ct=△Ct（處理）-△Ct（對(duì)照），△Ct=Ct（目標(biāo)基因）-Ct（內(nèi)參基因），計(jì)算在不同處理下基因的表達(dá)量，其中每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)做3個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 AmDREB2.1基因全長(zhǎng)的克隆

用改良Trizol法提取蒙古沙冬青總RNA，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已建立的蒙古沙冬青根的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得的DREB基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的目的片段大小為600 bp左右，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖1）。

圖1 蒙古沙冬青AmDREB2.1的ORF區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 AmDREB2.1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 AmDREB2.1基因全長(zhǎng)序列的結(jié)構(gòu)特征 采用DNAMAN 7.0分析從蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的1個(gè)編碼DREB的基因全長(zhǎng)序列。序列全長(zhǎng)為978 bp，其中5' UTR 長(zhǎng)度為257 bp，3' UTR長(zhǎng)度為 190 bp 。ORF編碼區(qū)長(zhǎng)度為531 bp，可編碼176個(gè)氨基酸（圖2-A）。計(jì)算其等電點(diǎn)（pI）為5.59，分子量（MW）為20 210.16 Da。采用NCBI在線分析序列表明，此基因編碼的蛋白質(zhì)具有典型的AP2結(jié)構(gòu)域，具有11個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)屬于AP2超家族成員（圖2-B）。與GenBank登錄的部分DREB基因進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與很多DERB2類(lèi)基因高度相似，故將其命名為AmDREB2.1。

AmDREB2.1的氨基酸序列的潛在磷酸化位點(diǎn)共計(jì)11個(gè)，其中7個(gè)為Ser，3個(gè)為T(mén)hr，1個(gè)為T(mén)yr。AmDREB2.1不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不是跨膜蛋白。用SignalP 3.0Server在線軟件分析確定AmDREB2.1不具有信號(hào)肽。用PSORT對(duì)AmDREB2.1的氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，推測(cè)其定位于細(xì)胞核中。采用cNLS Mapper對(duì)AmDREB2.1的氨基酸序列進(jìn)行核定位信號(hào)分析，確定其核定位信號(hào)序列由30個(gè)氨基酸構(gòu)成（圖2-A灰色陰影部分）。

2.2.2 AmDREB2.1高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 基因功能的最終表現(xiàn)在于它所編碼的蛋白質(zhì)的功能，而功能的實(shí)現(xiàn)取決于其高級(jí)結(jié)構(gòu)特征。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明AmDREB2.1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有3種類(lèi)型，分別為α-螺旋、β-折疊片和無(wú)規(guī)則卷曲。3種結(jié)構(gòu)所占比例不同，以無(wú)規(guī)則卷曲為主，β-折疊片較少（圖3-A）。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3-B。

2.2.3 AmDREB2.1的系統(tǒng)進(jìn)化分析 在NCBI中搜索與AmDREB2.1氨基酸序列相近的10個(gè)編碼DREB氨基酸序列：擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtDREB2A/BAA36705.1、AtDREB2B /AEE74994.1和AtDREB2C/ AEC09816.1，白刺花（Sophora davidii）SdDREB2/AFP89590.1，大豆（Glycine max）GmDREB1/AAP47161.1、GmDREB2/ABB36645.1和 GmDREB3/ABB36646.1，鹽豆木（Halimodendron halodendron）HhDREB2/ACJ66376.1，水稻（Oryza sativa）OsDREB2A/Q0JQF7.1和玉米（Zea mays）ZmDREB-2A/ANP_001105876.1，已有文獻(xiàn)報(bào)道的2個(gè)蒙古沙冬青中編碼DREB序列AmDREB1［15］和AmDREB3［16］，與本研究的AmDREB2.1等共計(jì)13個(gè)DREB的氨基酸序列采用MEGA5.0進(jìn)行多序列比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。

圖2 AmDREB2.1的核苷酸序列及推測(cè)的蛋白質(zhì)序列特征

圖3 AmDREB2.1的二級(jí)結(jié)構(gòu)（A）與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（B）

圖4為選取的不同植物13個(gè)DREB氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，各序列盡管長(zhǎng)短有別，但都具有13個(gè)保守的氨基酸，保守氨基酸的存在可能與AP2結(jié)構(gòu)域有關(guān)。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）可知，在選取的13種DREB蛋白質(zhì)中，AmDREB2.1和豆科的鹽豆木HhDREB2、大豆GmDREB2和GmDREB1聚為一類(lèi)，與HhDREB2親緣關(guān)系最近；與擬南芥的AtDREB2A、AtDREB2B和AtDREB2C的關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，本研究的AmDREB2.1與已報(bào)道的AmDREB1和AmDREB3的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖4 AmDREB2.1與其他植物已知DREB 蛋白的多序列比對(duì)

圖5 AmDREB2.1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 AmDREB2.1基因的表達(dá)模式分析

2.3.1 干旱脅迫下AmDREB2.1的表達(dá)特征 以20% PEG6000模擬干旱脅迫處理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.1在干旱脅迫下不同組織中的響應(yīng)特點(diǎn)，結(jié)果（圖6-A）顯示，AmDREB2.1在根和葉片中的逆境表達(dá)模式不同。根中AmDREB2.1在不同的干旱脅迫下皆為顯著上調(diào)表達(dá)，1 h表達(dá)量為對(duì)照水平的4.47倍；6 h表達(dá)量達(dá)到最大值，為對(duì)照水平的12.73倍；隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，24 h和72 h表達(dá)量呈明顯的回落趨勢(shì)，但高于對(duì)照。而葉中AmDREB2.1在不同干旱脅迫條件下表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，1 h表達(dá)量顯著下調(diào)，為對(duì)照水平的0.31；隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量有上升趨勢(shì)。

2.3.2 低溫脅迫下AmDREB2.1的表達(dá)特征 以4℃進(jìn)行處理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.1在低溫脅迫下的響應(yīng)特點(diǎn)，結(jié)果（圖6-B）顯示，AmDREB2.1在根和葉片中的逆境表達(dá)模式相似，與對(duì)照相比皆表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，且隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量有上升趨勢(shì)，但在24 h表達(dá)量顯著下調(diào)，其中根中表達(dá)量為對(duì)照水平的0.36，而葉中表達(dá)量為對(duì)照水平的0.26。

圖6 AmDREB2.1響應(yīng)干旱（A）和低溫（B）脅迫的表達(dá)特征

3 討論

植物在干旱、低溫等逆境脅迫下，與逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的高效表達(dá)可激活多個(gè)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)多個(gè)功能基因的效果。研究表明，在低溫和干旱等逆境脅迫下，DREB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與逆境信號(hào)途徑中下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的DRE 或CRT 順式作用元件結(jié)合，進(jìn)而激活rd（Responsive to dehydration）/COR（Cold responsive /regulated gene）類(lèi)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的耐受力［17，18］。DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子成員較多，有的參與低溫響應(yīng)，有的則與干旱、高鹽/高溫有關(guān)。如在擬南芥中，DREB1基因主要受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，DREB2基因則受干旱、高鹽和高溫誘導(dǎo)表達(dá)［18］。DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)不同脅迫的選擇性應(yīng)答可能與其自身啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等多種因素有關(guān)。

本研究從耐逆植物蒙古沙冬青中分離獲得了1個(gè)編碼DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因AmDREB2.1，生物信息學(xué)分析表明其編碼蛋白具有典型的DREB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子所共有的保守AP2結(jié)構(gòu)域和保守的氨基酸。AmDREB2.1與同為豆科的鹽豆木HhDREB2、大豆GmDREB1和GmDREB2親緣關(guān)系最近，與十字花科的擬南芥AtDREB2A、AtDREB2B和AtDREB2C親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與已經(jīng)報(bào)道的蒙古沙冬青AmDREB1和AmDREB3分屬在不同的進(jìn)化支上，同種植物不同成員之間的進(jìn)化關(guān)系結(jié)果提示可能存在功能上的差異。

Li等［19］在研究大豆GmDREB時(shí)發(fā)現(xiàn)GmDREBc僅在根中受鹽、干旱和ABA誘導(dǎo)。本研究結(jié)果表明，盡管AmDREB2.1在蒙古沙冬青的根和葉片中均能表達(dá)，但在不同脅迫條件下，AmDREB2.1在根與葉片的表達(dá)模式不同。AmDREB2.1主要在根中受干旱脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而不受低溫脅迫誘導(dǎo)，表明AmDREB2.1主要參與蒙古沙冬青應(yīng)答干旱脅迫的反應(yīng)，且具有組織特異性，僅在根中積極響應(yīng)，符合DREB2類(lèi)基因主要受干旱、高鹽和高溫誘導(dǎo)表達(dá)的特征。我們推測(cè)這種現(xiàn)象可能與DREB基因復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制有關(guān)。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在植物DREB的啟動(dòng)子區(qū)域分布著多種與光、ABA、GA、乙烯和茉莉酸等激素、溫度、鈣信號(hào)相關(guān)的順式作用元件［20］，這些順式作用元件與相應(yīng)的反式作用元件（如ICE1）發(fā)生相互作用，共同決定DREB基因的表達(dá)水平。在干旱和低溫脅迫下的蒙古沙冬青葉片和根系中，激素等條件可能會(huì)出現(xiàn)差異，這種差異可能會(huì)導(dǎo)致本研究觀察到的AmDREB2.1在不同組織中的不同的逆境誘導(dǎo)模式。研究結(jié)果提示DREB轉(zhuǎn)錄因子中的不同成員不僅具有應(yīng)答不同逆境脅迫的分工，同時(shí)存在組織特異性表達(dá)特征，研究不同脅迫下不同成員的組織表達(dá)特征是十分必要的。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索蒙古沙冬青DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因在逆境脅迫應(yīng)答中的作用機(jī)理與功能研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)論

從蒙古沙冬青中分離到1個(gè)編碼DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AmDREB2.1。該序列開(kāi)放閱讀框編碼176個(gè)氨基酸，具有典型的DREB轉(zhuǎn)錄因子保守的AP2結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，該基因能在根、葉中表達(dá)，但對(duì)干旱、低溫響應(yīng)不同，AmDREB2.1主要參與根的干旱脅迫應(yīng)答。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of AmDREB2.1 in Ammopiptanthus mongolicus

Li Zhanglei Gao Fei Cao Yuzhen Zhang Zhiwei Wang Ning Li Huayun Zhou Yijun
（College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081）

A new dehydration responsive element binding protein（DREB）transcription factor gene， which was named as AmDREB2.1，was isolated from Ammopiptanthus mongolicus（Masxim.）（Cheng f.）root transcriptome database， that it had been established in our previous work. The full length of the AmDREB2.1 cDNA was 978 bp， including a single 531 bp opening reading frame which encoded a 176-amino acid peptide with a conserved AP2 domain. Quantitative real-time PCR analysis revealed that the AmDREB2.1 expressed in leaf and root of A. mongolicus， but there were different expression patterns under drought or low temperature stress respectively， and it could be mainly induced by drought in root.

Ammopiptanthus mongolicus；AmDREB2.1；sequence analysis；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.015

2014-08-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370356），中央民族大學(xué)一流大學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（YLDX01013），國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（GCCX2013110015），中央民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（K2014044）

李章磊，男，碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：lizhanglei2008@126.com

周宜君，女，博士，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：queenzhou@263.net