一株丁二酸高產菌株的篩選與選育

王樂 宇光海 楊碩曄 王為為 惠明

（河南工業大學生物工程學院，鄭州 450001）

一株丁二酸高產菌株的篩選與選育

王樂 宇光海 楊碩曄 王為為 惠明

（河南工業大學生物工程學院，鄭州 450001）

旨在提高丁二酸發酵生產水平，通過初篩、復篩從土壤中分離得到了高產丁二酸菌株，發酵結束后利用高效液相色譜法檢測丁二酸的產率為34.45%。對菌株進行紫外誘變選育，結果表明，在底物葡萄糖的濃度為100 g/L時，丁二酸的產率提高了46%，達到了50.30%，殘糖低于10 g/L。經形態學特征、生理生化指標測定以及16S rDNA序列分析等，鑒定該菌株為放線桿菌。

丁二酸；高產菌株；篩選；誘變；放線桿菌

近年來，丁二酸應用的領域不斷拓展，國際市場的需求量也迅猛增加［1］。工業上生產丁二酸的方法主要為化學方法，常見的化學合成的方法有石蠟氧化法、氯乙酸甲酯的氰化水解法、加氫法等，生產工藝相對成熟［2，3］。但化學法生產丁二酸的價格較高，且會消耗大量石油等不可再生資源，不利于資源的可持續發展，同時在生產過程中還會造成環境的污染［4，5］。微生物發酵法制備丁二酸具備諸多優勢，如由于菌種特性及微生物酶的專一性，丁二酸純度高且產品易分離；生物法生產丁二酸工藝與傳統化學法相比，生產過程簡化且成本低、生產條件溫和且耗能小、生產工藝安全且對環境友好，因此生物法生產丁二酸已成為目前諸多學者研究的熱點［6］。丁二酸的生物法生產主要有兩種方式，葡萄糖經糖酵解轉化為磷酸烯醇式丙酮酸后，一方面繼續以三羧酸循環順式的方式（丙酮酸→乙酰-CoA→檸檬酸→丁二酸）生成丁二酸，另一方面以三羧酸循環反式途徑（蘋果酸→延胡索酸→丁二酸）生成丁二酸［7，8］。其中，丁二酸代謝產生還需要受到CO2、丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶等條件的調節［9，10］。目前，能夠產丁二酸的菌種主要有黑曲霉、谷氨酸棒狀桿菌、產琥珀酸厭氧螺菌、產琥珀酸放線桿菌和重組大腸桿菌等［11］。

研究發現，放線桿菌l30Z菌株和它的變異株具有1-8 g/L氟乙酸鹽的耐受力，可以生產大量的丁二酸［12］。產琥珀酸放線桿菌ATCC55618也是國內丁二酸發酵研究較多的菌株，研究發現其丁二酸產量為11.49 g/L，并有乳酸、甲酸和乙酸等副產物的生成［13］。近年來，研究人員篩選出菌株琥珀酸放線桿菌CGMCC1593，對其誘變選育后，在5 L發酵罐上發酵36 h，丁二酸產量高達40.51 g/L，同時伴隨一些副產物［14］。天然的菌種產丁二酸的能力較低，副產物也較多，且對于底物或產物的耐受性較差，因此利用生物工程技術手段對現有的菌種進行改造成為該領域的研究重點［15］。為了降低乳酸、甲酸等副產物的生成，以野生型大腸桿菌w1485為出發菌株，在染色體中插入抗性基因，構建丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）和乳酸脫氫酶（ldhA）基因失活菌株，實現了丁二酸的高效生產［16，17］。美國MBI的專利中有丁二酸發酵的最高產量110 g/L，而產琥珀酸放線桿菌是目前丁二酸發酵最具工業化潛力的菌株［18］。

丁二酸作為一種優秀的化學平臺產品，其前景廣闊［19］。生物法生產丁二酸是基于可再生能源（如葡萄糖）和二氧化碳為主要原料，不僅能夠擺脫對石油化工原料的依賴性，而且開辟了溫室氣體二氧化碳新的利用方式，具有可再生性、成本低廉、綠色無污染和環境友好等優勢［9，20］。本研究旨在通過篩選、分離土壤中生產丁二酸的菌種，以得到一種可以在較為苛刻條件下生長，且屬于微厭氧菌株，高產丁二酸的菌株，并對篩選出的高產菌株進行紫外誘變處理，以期有效提高丁二酸的產率和底物葡萄糖的利用能力，為后續試驗進行菌種性能和生產工藝的改良，以及代謝控制發酵產丁二酸的研究奠定基礎，也為大規模利用生物法生產丁二酸提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣、碳酸鎂、硫酸銨、氯化鎂，均為分析純，購于北京化工廠。莫能菌素、富馬酸鈉、溴甲酚綠、瓊脂，均為生化級，均購于Sigma 公司。

1.1.2 儀器與設備 THZ-312型臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設備有限公司），LDZX-0KBS型立式高溫蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠），SW-CJ-ZF型雙人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司），722N紫外分光光度計（上海精科科學儀器有限公司），FA12004B電子天平（上海精科科學儀器有限公司），TDL-5-A離心機（上海安亭科技股份有限公司），Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.1.3 培養基及培養條件 富集培養基：葡萄糖40 g，富馬酸鈉5 g，酵母膏5 g，莫能菌素0.1 g，KH2PO43 g，NaCl 1 g，（NH4）2SO41 g，CaCl20.5 g，MgCl20.5 g，MgCO35 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌15 min。

分離培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，NaCl 5 g，澳甲酚綠0.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH6.8-7.2，121℃滅菌15 min。

保藏培養基：葡萄糖10 g，酵母粉5 g，K2HPO43 g，NaCl 0.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH7.0，121℃，滅菌15 min。

活化培養基：蛋白胨20 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH7.2±0.2。121℃，滅菌15 min。

種子培養基：葡萄糖10 g，酵母粉5 g，K2HPO43 g，NaCl 0.1 g，CaCl20.5 g，MgCl20.5g，pH7.0，121℃，滅菌15 min。

發酵培養基：葡萄糖100 g，酵母膏15 g，NaCl 0.5 g，NaHCO315 g，Na2HPO40.5 g，NaH2PO49.6 g，K2HPO45 g，pH7.0，121℃，滅菌15 min。

普通培養條件：接種量為10%，裝液量為100 mL培養基/250 mL搖瓶，培養溫度為37℃，pH值自然，轉速150 r/min，搖瓶在滅菌過程中用紗布封口，接種后在紗布上覆蓋保鮮膜以實現微氧環境，發酵周期72 h。

1.1.4 菌種 土壤樣品采自鄭州市某奶牛場。在鄭州市某奶牛場，采集帶有牛糞土壤和附近土壤共10處，每處各15 g，裝入無菌袋中。將這10份采集回來的土壤樣品放置在-20℃冰箱保藏，待用。

1.2 方法

1.2.1 土壤的富集培養 取10份保藏的土壤樣品各3 g，分別放入250 mL搖瓶中含有150 mL的富集培養基中，于37℃培養24 h，之后按照15%的接種量，在同樣的培養條件進行轉接，共轉接3次。培養結束后進行5 000 r/min離心3 min，棄上清，得到無菌濕菌體，待用。

1.2.2 純菌種的分離 取土壤富集培養得到的濕菌體，適當稀釋后分別涂布于溴甲酚綠變色分離平板，于37℃培養箱中培養32 h，取溴甲酚綠變色平板上變色菌落，用劃線法接種到保藏培養基平板上培養，得到菌落，再用描點法接種到溴甲酚綠變色平板上，在發生變色反應的位置上得到菌落。重復上述過程直至不再出現雜菌。將分離得到單菌落接種于保藏培養基斜面上，保藏，用于菌株的篩選和發酵。

1.2.3 熒光法初篩檢測 從斜面上取下少量分離得到的單菌落接入至種子培養基中，培養24 h后接入發酵培養基中，培養72 h，結束后進行5 000 r/min離心3 min，得上清發酵液，作為檢測樣品。取0.3 mL樣品分別于試管中，加入濃硫酸0.3 mL，然后加入間苯二酚0.6 g后混合，將混合物沸水浴加熱溶解直至有深紅色出現，之后放入冰水混合物中冰浴10 min，然后從反應試管的邊緣緩慢加入1 mol/L的NaoH溶液2 mL，震蕩充分至反應物溶解，再緩慢加入5 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液，觀察顏色反應，是否出現綠色熒光圈，并判斷熒光圈大小。

1.2.4 葡萄糖含量的測定 樣品中葡萄糖含量的測定方法采用DNS法［21］。葡萄糖含量的標準曲線如圖1所示。

圖1 DNS法測定葡萄糖含量的標準曲線

1.2.5 高效液相色譜法復篩 進行菌株復篩的發酵樣品，其丁二酸含量的測定采用高效液相色譜法。丁二酸含量的標準曲線如圖2所示。

圖2 高效液相法測定丁二酸含量的標準曲線

1.2.6 菌體干重測定 發酵結束后取20 mL菌體懸液于稱重后的干燥離心管內，進行5 000 r/min離心5 min，去上清，菌體用無菌去離子水洗滌，離心，重復兩遍后得濕菌體，于55℃烘干至恒重后稱重。直接稱重。

1.2.7 紫外誘變選育 將菌株在保藏培養基平板上活化12 h，接入種子培養基中，37℃培養24 h，得到菌體總體處在生長對數期的菌懸液，倒入無菌平皿中，深度約1.0 cm，菌體數量約為105個/mL，借助磁力攪拌器保持平皿中的菌懸液勻質。選取260 nm下的紫外光源，紫外燈的功率為15 W，燈源與菌懸液的最近距離為25 cm，進行紫外誘變。從打開紫外燈后計時，紫外線照射時間為5-120 s。紫外誘變結束后，將菌懸液均勻涂布在溴甲酚綠變色分離上，于37℃，避光培養2-3 d后得到出現變色反應的單菌落，在保藏培養基上延續傳8代穩定后，重復熒光法初篩檢測和高效液相法復篩，篩選經過誘變選育后丁二酸產量最高的優勢菌株，并對發酵液中的菌體進行鏡檢。

1.2.8 菌株的生理生化試驗 將紫外誘變選育得到的高產菌株接種于葡萄糖、木糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、纖維二糖、棉籽糖、淀粉、蜜二糖、硝酸鹽、尿素、明膠等生化管內進行發酵試驗，并進行革蘭氏染色試驗，根據結果判斷其基本特性［22］。

1.2.9 16S rDNA的 PCR擴增及其序列分析 利用Oligo6 和Primer5.0軟件設計一對通用引物，即上游P1：5'-AGAGTTTGATC（A/C）TGG-3'和下游P2：5'-GGACTAC（A/T/C）AGGGTATCTAAT-3'，P1和P2擴增出的片段大小約為780 bp。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

PCR擴增反應體系（25 μL）：10×Taq酶緩沖液 2.5 μL，引物 0.2 μmol/L，200 mmol/L dNTP 2 μL，DNA模板20 ng，Taq酶（TaKaRa）1 U，ddH2O 17 μL。PCR反應擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，56℃復性1 min，72℃延伸2 min，循環30次；72℃延伸5 min?；厥盏哪康钠?，在目的片段大小處出現了特異性條帶，且與預計的片段大小相符。測序工作由上海生工生物技術有限公司完成。

2 結果

2.1 富集培養分離菌株

采用含溴甲酚綠指示劑的瓊脂培養基作為選擇性平板，以稀釋分離純菌落為目的，對產丁二酸菌株進行富集培養。圖3顯示，在溴甲酚綠篩選平板上有一定量的單菌落生成，由于溴甲酚綠在酸性條件下會顯黃色，因此，此變色菌落為產酸菌落。通過挑選溴甲酚綠選擇性平板上不同變色菌落，尤其是對變色反應后出現較深色斑的菌株，進行選擇性平板重復篩選，分離選取出優勢菌株X1、X2、X3……Xn，分別進行斜面保藏。

圖3 溴甲酚綠篩選平板上的菌落

2.2 熒光法篩選丁二酸生產菌株

熒光法篩選丁二酸生產菌株的結果（圖4）顯示，丁二酸標準品（1號）有著明顯的綠色熒光圈，說明熒光法對丁二酸具有良好的顯色分辨效果。2、3、4號樣品為溴甲酚綠選擇性平板變色的3株優勢菌株X4、X7和X12。通過對比可知，3號（X7）和4號（X12）樣品比2號（X4）樣品的熒光顯色結果更為清晰、明顯，且熒光圈較大。因此將X7和X12菌株分別命名為Y3和Y4，作為利用高效液相法進行復篩的優勢菌株。

圖4 培養液樣品的熒光法初篩

2.3 高效液相色譜法篩選丁二酸生產菌株

丁二酸標準品在高效液相法檢測時的峰保留時間為4.22 min，兩株菌在4.22 min時都出現有明顯的色譜峰，說明Y3和Y4菌株均具有產丁二酸的能力，這也與熒光圈初篩的結果相一致。高效液相色譜檢測丁二酸的方法經優化調整，條件如下：XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm）；流動相25 mmol/L K2HPO4，pH2.8（H3PO4調節）；流速0.8 mL/min；紫外檢測器，210 nm；進樣量，20 μL；柱溫，室溫。通過對比兩株菌的高效液相色譜（圖5和圖6）表明，Y3菌株在底物葡萄糖濃度為100 g/L的發酵培養條件下，丁二酸的產率為34.45 g/L，利用DNS法測得的殘留葡萄糖濃度為15.3 g/L。Y4菌株在底物葡萄糖濃度為100 g/L的發酵培養條件下，丁二酸產率為12.78 g/L，殘留葡萄糖濃度為19.0 g/L。相對于Y4菌株，Y3菌株的發酵樣品中丁二酸產量較高，且副產物較少，優勢明顯。Y4菌株的發酵生產丁二酸的能力一般，且有一些副產物的生成，可能是該菌株不僅生產出丁二酸還產出了如乳酸、甲酸等副產物，在一定程度上削弱了丁二酸代謝途徑，降低了丁二酸的產量。因此，將利用高效液相復篩法得到的優勢菌株Y3命名為G3。對G3進行紫外線誘變選育處理，以進一步提高該菌株的丁二酸發酵水平。

2.4 紫外線誘變

對G3進行紫外線誘變選育處理的致死率曲線（圖7）顯示，最佳的致死率時間為50-60 s，因此選擇紫外照射的時間為60 s，采用平皿法，于30℃，避光培養2-3 d后，得到單菌落，在富集培養基上延續傳8代穩定后，進行搖瓶發酵培養，并利用高效液相法進行丁二酸產量的檢測，發酵菌體進行顯微鏡鏡檢。

圖5 Y3菌株發酵液的高效液相色譜圖

圖6 Y4菌株發酵液的高效液相色譜圖

圖7 紫外線誘變菌體致死率曲線

紫外照射60 s的6株誘變選育結果與復篩優勢菌株G3（空白對比）的結果（圖8）顯示，經過紫外誘變60 s后的1號菌株的丁二酸發酵結果有了明顯提高，發酵培養結束后丁二酸產量最高，為50.3 g/L，相比于初始菌株的丁二酸產量34.5 g/L，提升了46%。1號誘變菌株的細胞干重為12.8 g/L，相比于初始菌株的細胞干重11.5 g/L，提高了11.2%。因此，將紫外誘變處理后丁二酸產量最高的1號菌株命名為Z1。

圖8 紫外誘變60 s后的選育結果

2.5 Z1菌株的生理生化試驗及分子鑒定結果

2.5.1 形態學特征及生理生化指標測定 優勢誘變菌株Z1，在保藏培養基上培養2-3 d后形成直徑約1 mm的菌落，菌落呈圓形凸起，表面光滑，不透明，邊緣整齊，淡黃色。在顯微鏡下觀察菌體大小（0.4-0.6 μm×1.0-3.5 μm），以桿形為主，無莢膜和動力。采用發酵培養基進行液體發酵培養，培養液均勻混濁，底部有菌體沉淀，經革蘭氏染色呈現陰性。Z1菌株能夠利用葡萄糖、木糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、纖維二糖、棉籽糖、淀粉，能夠使硝酸鹽還原，不能利用蜜二糖，無法使尿素分解、明膠液化。

2.5.2 16S rDNA的基因序列測定及比對結果 對Z1菌株16S rDNA的PCR擴增純化產物進行序列測定，結果如圖9所示，其序列經 BLAST 軟件對比GenBank數據庫，進行同源性分析得出，Z1與GenBank中序列號為|AF024525.1|的Actinobacillus succinogenes 16S rRNA基因同源性達到99%。綜上可初步判斷Z1菌株為放線桿菌。

圖9 Z1菌株16S rDNA的基因序列測定結果

3 討論

琥珀酸作為許多重要化學品的直接或間接合成中間體被廣泛應用于化工領域，具有很高的商業價值和廣闊的應用前景［23，24］。目前生產琥珀酸的方法主要有化學合成法和生物發酵法兩種，但由于化學合成法具有能耗高，污染大等缺點，不符合可持續發展的要求［25］。近幾年隨著生物工程技術的迅速發展和逐漸成熟，生物發酵法生產琥珀酸因兼具資源可再生利用及吸收CO2等優勢，具有廣闊的發展潛力［24］。

從已報道的丁二酸生產菌株的種屬分布來看，它們廣泛分布于不同的種屬中。目前主要生產丁二酸的菌種有黑曲霉、谷氨酸棒狀桿菌、產琥珀酸厭氧螺菌、產琥珀酸放線桿菌和重組大腸桿菌等［5］。對于從自然界中分離出產丁二酸菌種的研究，國內外已有很多報道，大多數的菌種自然產丁二酸的量還比較低，但是經過基因技術的改良能夠有效地提高菌種的產量［23］。

據統計，自然界中生產丁二酸的菌屬以放線桿菌居多，產琥珀酸放線桿菌具有高耐受底物濃度和產物抑制等優點，是最具有工業化發展前景的潛力菌株之一［25］。本研究分離得到的高產菌株也屬于放線桿菌，但是與其他研究不同的是，本研究獲得的優勢菌株Z1對氧氣的抵抗能力較強，能夠在微厭氧條件下較好地生產丁二酸。原因或許是我們在對該菌株進行分離和選育時，有針對性的混雜一些無菌空氣，篩選出的菌株能夠較好地適應微厭氧條件，也或許與在紫外誘變選育的過程中發生了基因突變有關，有待于進一步深入的研究。

在富集培養過程中，培養基中加入了5 g/L的富馬酸鈉和0.1 g/L的莫能菌素，目的是促進目的菌株優勢生長。富馬酸是三羧酸循環中重要的電子受體，能轉移氫，氫的減少能使產乳酸菌和產甲烷菌減少生長，在一定程度上避免一些產酸菌落的干擾［7］，為生產丁二酸菌種的篩選奠定了一定基礎。采用熒光光圈篩選丁二酸生產菌株，該方法較為簡便、經濟、耗時比較少，適合于大量篩選產丁二酸菌株的工作［13］。熒光法篩選產丁二酸菌株的原理是：在濃硫酸存在的條件下，丁二酸首先形成丁二酸酐，丁二酸酐與間苯二酚縮合而成丁二酰熒光素，反應化學方程式如圖10所示［12］。

圖10 丁二酸酐與間苯二酚縮合成丁二酰熒光素化學方程式［12］

發酵液中丁二酸的含量與熒光圈的大小成正比，通過對比熒光顯色狀況和光圈大小，可以初步判斷在同樣培養條件下菌株的發酵產酸能力［13］。采用高效液相色譜法對經過熒光圈初篩法得到優勢菌株進行復篩驗證，能夠檢測菌株發酵生產丁二酸的水平，也能測定出該菌株在丁二酸發酵生產過程中的副產物生成情況。結果證實，實驗室篩選得到的優勢菌株在丁二酸發酵生產過程中，副產物代謝生成途徑較弱，發酵液中的丁二酸含量較高，因此在后期的分離純化的難度得以大幅降低，具有較強的競爭力。

目前所報道的琥珀酸產量最高的菌株就是琥珀酸放線桿菌的誘變突變株［24］，因此，本研究對篩選出優勢菌株G3進行了紫外線誘變選育。紫外誘變的主要原理是使同鏈DNA 的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，以阻礙堿基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。經紫外線損傷的DNA能被可見光復活，故經紫外線照射后孢子懸液不應貯放太久，處理后的培養樣品需用黑紙或黑布包裹，避免長波紫外線和可見光的照射［26］。本試驗經過紫外誘變選育獲得了一株細胞干重和丁二酸產率均有明顯提高的高產菌株Z1，與誘變處理前的菌株相比，丁二酸的產率提高了46%。經形態學特征、生理生化指標測定以及16S rDNA序列分析等，鑒定Z1菌株為放線桿菌。本試驗經過篩選和選育得到的菌株Z1，在丁二酸的發酵生產能力上處于自然菌屬發酵結果的較高水平，但與目前報道的利用基因工程手段獲取的重組大腸桿菌發酵丁二酸的結果相比，還有一定的差距。因此，利用代謝控制發酵和基因工程手段，進一步提高丁二酸的發酵水平，將成為今后研究的重點方向。

4 結論

本研究利用溴甲酚綠指示劑的固態培養基作為選擇性平板，分離得到了生產丁二酸的單一菌落。通過熒光圈初篩法初步篩選得到了兩株產丁二酸水平較高的菌株Y3和Y4，然后利用高效液相法對初篩優勢菌株進行發酵復篩檢驗，得到產丁二酸產率較高的菌株G3，并對菌株G3進行紫外線誘變選育處理，獲得了一株細胞濕重和丁二酸產率均有明顯提高的高產菌株Z1，與誘變處理前的菌株G3相比，丁二酸的產率提高了46%，在底物葡萄糖濃度為100 g/L的發酵培養條件下，Z1菌株的丁二酸發酵產量為50.30 g/L，葡萄糖殘留濃度為9.0 g/L。經形態學特征、生理生化指標測定以及16S rDNA序列分析等，鑒定Z1菌株為放線桿菌。

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（責任編輯 馬鑫）

Screening and Breeding of a Strain for High Yield of Succinic Acid

Wang Le Yu Guanghai Yang Shuoye Wang Weiwei Hui Ming
（College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

It was to improve the production of succinic acid. After the primary and secondary screening， a strain with high-yield of succinic acid was isolated from the soil. The succinic acid production of 34.45% was determined by the high performance liquid chromatography（HPLC）after the fermentation. Later， the UV mutagenic breeding of strains has been performed， resulting in the succinic acid production of 50.30% which increased by 46% in the substrate of glucose concentration of 100 g/L with the residual sugar lower than 10 g/L. After the determinations of morphological characteristics， physiological and biochemical index and 16S rDNA sequence analysis， the strain was identified as actinobacillus.

succinic acid；high-producing strain；screen；mutagenesis；Actinobacillus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.018

2014-08-04

國家自然科學基金項目（21306040）

王樂，男，博士，講師，研究方向：微生物學，發酵工程；E-mail：wanglely1984@163.com

惠明，男，博士，教授，研究方向：發酵工程；E-mail：huiming69@163.com