納豆激酶生產菌的篩選及發酵納豆特性研究

趙仲麟李淑英聶瑩李燕袁超唐選明

（1. 河南農業大學理學院，鄭州 450002；2. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；3.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，鄭州 450002）

納豆激酶生產菌的篩選及發酵納豆特性研究

趙仲麟1李淑英2聶瑩2李燕3袁超1唐選明2

（1. 河南農業大學理學院，鄭州 450002；2. 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；3.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，鄭州 450002）

為開發具有特定生理活性的新型納豆保健品，從發酵豆制品中分離篩選得到一株納豆激酶高產菌株。利用該菌株以及市售的3種納豆中的納豆菌進行納豆發酵，比較了4株納豆菌發酵納豆的特性，并對納豆激酶活性進行分析。結果表明5號菌株發酵生產納豆周期短，顏色金黃，具有醬香味，拉絲長度最佳。同時，對產納豆激酶的最佳發酵時間進行研究，結果表明發酵至17 h納豆激酶活性達到最大值。

納豆激酶；篩選；酶活；特性

納豆作為一種日本傳統食物已有上千年的歷史，是大豆經枯草芽孢桿菌發酵而來。納豆中含有納豆激酶，是具有強力的纖維蛋白溶解特性一種酶類［1］。利用其特性可以開發相關的抗血栓癥藥物。血栓則是由血小板和纖維蛋白聚集形成的，有效的血栓溶解劑能切開血栓上纖維蛋白凝塊，如纖溶酶。納豆激酶屬于枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，其溶血栓活性是纖溶酶的4倍［2］。研究顯示納豆激酶可在體外將血栓水解，間接地將血纖維蛋白溶酶原轉化為血纖維蛋白溶酶，使纖維蛋白凝塊水解，通過抑制血小板的凝聚和血栓的形成從而改善血流［3］。Xu等［4］使用不同劑量的納豆激酶處理血栓小鼠，發現納豆激酶對血栓還具有體內活性。

納豆激酶不僅可以直接溶解交聯狀的血栓，還可以催化血纖維蛋白溶酶原轉化為有活性的血纖維蛋白溶酶，增加體內血栓溶解因子，諸如t-PA的合成，失活纖維蛋白溶酶抑制劑（PAI-1）等，在體內具有增強的血栓溶解活性［5］；與臨床藥物相比，具有纖溶活性高、無毒副作用、半衰期長、生產成本低廉等優點［6，7］。Fadl等［8］發現納豆激酶對緩解阿爾茨海默病也有一定幫助。因此，納豆是一種潛在的、可以開發為一種預防和治療心腦血管疾病的功能食品［9］。本研究對納豆激酶生產菌進行了分離篩選，并將得到的高產菌株到與其他3種市售納豆菌進行納豆發酵，對產品的感官和納豆激酶酶活進行比較，以期為納豆激酶生產菌株的生產應用及潛在的市場應用價值進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 市售及民間豆醬、豆豉等各種發酵豆制品，均購買于超市。

1.1.2 試劑 纖維蛋白原（牛血，批號：140626-201009）、尿激酶標準品（1280 U/支）和凝血酶（560 U/支）均購于中國藥品生物制品檢定所；LB Broth Ultrapure（USB），胰蛋白胨（OXOID），酪蛋白（Sigma），其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基 篩選培養基為酪蛋白平板培養基，具體配方：酪蛋白 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 0.9%、瓊脂2%，pH7.2-7.4，121℃滅菌20 min，現配現用。種子和液體發酵培養基：LB培養基，酪蛋白 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 1%，pH7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 納豆激酶生產菌株篩選 取 5 g 發酵豆制品，放入裝有 20 mL 無菌生理鹽水和10余顆玻璃珠的三角瓶中，每隔10 min 振蕩1 次，室溫下浸提1 h，3 000 r/min離心5 min，制得菌懸液；85℃熱處理30 min，生理鹽水倍比稀釋后，取 100 μL 涂布酪蛋白平板，30℃培養18 h。復篩時，觀察酪蛋白平板上的單菌落，挑選溶解圈大的菌株用無菌牙簽點酪蛋白平板，30℃培養12 h，選取溶解圈較大的菌株，反復篩選5次后，接種LB單菌落平板，4℃保存備用。

1.2.2 納豆制備及粗酶液的提取 將篩選菌株接種到3 mL LB液體培養基，37℃過夜培養活化菌株；2%的接菌量轉接到50 mL LB液體培養基，37℃培養4 h，4 000 r/min離心10 min收集菌株，生理鹽水洗3次，稱取菌株濕重，加入生理鹽水，配置成相同菌液濃度的菌懸液（菌落數約為107/mL）備用。大豆原料洗凈，浸泡后分裝成200 g每瓶，蒸煮，放涼（約50℃左右），將1 mL菌懸液加入滅菌的黃豆中，發酵至表面產生白膜后停止發酵，4℃后熟12 h得納豆成品。

取從各種豆制品中分離純化得到的高活力菌株，按照以上工藝生產納豆，以拉絲長度評價納豆品質。拉絲長度測定：用筷子挑起，20 cm為一單位，從中間部位再拉20 cm，重復進行，直至拉斷。

取適量發酵好的納豆放入燒杯，加入5倍體積的生理鹽水，于4℃下以磁力攪拌器攪拌2 h，以6層紗布過濾除豆渣，取納豆液，12 000×g、4℃離心5 min，所得上清液，即為納豆激酶粗提液。

1.2.3 納豆激酶酶活分析 纖維蛋白平板法測納豆激酶活力，為改進的Astrup法［10］，具體如下：0.1 g瓊脂糖加到10 mL 10 mmol/L PBS（pH7.2），微波爐加熱溶解，50℃恒溫水浴10 min；0.01 g纖維蛋白原加到10 mL 10 mmol/L PBS（pH7.2），玻璃棒攪勻，50℃恒溫水浴10 min；將10 μL凝血酶（0.1 IU/μL）加到瓊脂糖溶液中，混勻；再將纖維蛋白原溶液加入瓊脂糖溶液中，迅速混勻并倒于9×9 cm平皿中，室溫放置90 min，使其充分凝固。5 mm打孔器打孔，上樣，室溫放置10 min，于37℃恒溫18 h，游標卡尺測量溶解圈的兩個垂直直徑，計算溶解圈的面積，根據尿激酶標準曲線計算酶的活力單位。尿激酶標準曲線的制作參考馬明等［11］的方法。

1.2.4 最適發酵時間分析 將篩選菌株活化后，按方法1.2.2和1.2.3進行納豆的發酵，于13 h 起每隔1 h取5 g納豆，連續取5 h，分別提取納豆激酶粗酶液進行酶活分析。

2 結果

2.1 納豆菌的篩選

以從日本納豆中篩選的菌株為陽性對照，從多家超市購買納豆、豆醬、豆豉及民間自釀豆醬等發酵豆制品中篩選納豆激酶產生菌。通過酪蛋白平板法檢測菌落蛋白酶水解活性，最終獲得具有較明顯溶解圈的菌株 8株，其中5號菌落水解圈最大。通過納豆激酶活性測定，結果顯示5號菌落具有最好的酶活性（圖1-A），納豆激酶活性分析顯示5號菌產的激酶活性最高（圖1-B）。

圖1 菌落蛋白酶水解活性試驗

2.2 納豆的感官評價

利用5號菌株以及從市售的3種納豆（S1，S2，S3）中分離到的納豆菌進行納豆發酵，對大豆發酵后制得納豆進行感官評價。4種發酵納豆產品均為亮黃色，具有納豆特有的醬香氣味，納豆絲里含納豆激酶，拉絲長度測定結果，如圖2。5號菌株發酵所得納豆拉絲長度最好，為75 cm；其次為S2納豆菌發酵所得納豆，拉絲長度60 cm；S1納豆和S3納豆相對較短，拉絲長度分別為54 cm和45 cm。

圖2 納豆產品的拉絲長度比較

2.3 納豆激酶活性分析

從5號菌株和其他市售的3種納豆分離出的納豆菌發酵得到的納豆中提取粗酶液，進行活性分析，結果如表1所示。S2納豆菌和S1納豆菌所產的納豆激酶活性最高，約為131 FU/g，5號納豆的納豆激酶活性次之，為121.538 FU/g，S3納豆中納豆激酶活性為100 FU/g。雖然5號菌株發酵納豆的納豆激酶活性居中，但是該菌株實現了較快的發酵速度，發酵形成白膜的時間較其他菌株早大約2 h，且產生白膜的厚度和黏度明顯強于其他菌株，這也可能是其拉絲長度強于其他菌株的原因。

表1 納豆激酶酶活分析

2.4 最適發酵時間分析

為研究5號菌株發酵納豆的特性，找到最佳發酵時間，將5號菌株活化后進行納豆發酵，從13 h開始每隔1 h取樣，提取粗酶液，纖維蛋白法測定粗酶液活性，并繪制5號菌株納豆發酵過程中納豆激酶活性曲線（圖3）。結果表明，隨著發酵時間的延長，5號菌株發酵納豆產生的納豆激酶呈緩慢遞增的趨勢，17-18 h趨于平緩，17 h時的納豆激酶活性最高，為92.278 FU/g。

圖3 5號菌株納豆激酶活性曲線

3 討論

本試驗對分離篩選的納豆激酶生產菌與其他3種市售納豆菌進行了納豆發酵，對產品和納豆激酶酶活性進行了比較。5號菌發酵得到的產品口感佳、氣味好，雖然酶活相對居中，但具有最高的拉絲長度。此外，5號菌株發酵納豆產生的納豆激酶呈緩慢遞增的趨勢，17 h的納豆激酶活性最高，相比其他3株納豆菌發酵時間略短。菌株的發酵條件對產品中納豆激酶含量的影響較大，可以通過酶活優化培養基組成和發酵工藝提高芽孢桿菌的納豆激酶產量［12］，通過采用單因素和正交試驗對篩選菌株的納豆激酶的液體發酵條件進行研究，也可通過分子生物學的手段對納豆激酶基因進行改造［13］，以期提高納豆激酶產量，為該酶的進一步擴大培養奠定基礎。

目前已商業化應用的納豆激酶熱穩定性較差，溫度到達60℃時，納豆激酶瞬間失活，在制備膠囊和長期運輸的過程中會喪失大部分活力，影響其實際使用效果。通過增加酶量，且在低溫儲運來緩解納豆激酶的活性損失，不利用工業大規模生產及推廣。另外，納豆激酶在酸性環境下也容易失活，在胃液環境中將完全失去活性。因此，未來的研究主要集中在納豆激酶基因的篩選及產品包被膠囊化等方面［14，15］，以期得到性能優良、可商品化的納豆激酶。我們后期的研究主要是克隆該納豆激酶的基因，并對其進行突變改造，以期提高其酶活性及熱穩定性。

4 結論

本研究篩選到了一株納豆激酶生產菌，利用該菌株以及市售的3種納豆中的納豆菌進行納豆發酵試驗，篩選到的5號菌株發酵生產納豆的周期較短，得到的納豆產品顏色金黃，具有醬香味，拉絲長度極佳。表明發酵至17 h納豆激酶活性達到最大值，該菌株可作為潛在的納豆生產菌株。

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（責任編輯 李楠）

Screening of Nattokinase Producing Strain and Characterazation of Nattokinase

Zhao Zhonglin1Li Shuying2Nie Ying2Li Yan3Yuan Chao1Tang Xuanming2
（1. College of Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002；2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；3. School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002）

To develop new kinds of natto health care products with specific physiological activity， a nattokinase high-yield strain was isolated and used for natto production. The characteristics and nattokinase activities of the isolated strain were compared with other 3 kinds of natto strains. Results showed that the natto products of munber 5 strain have golden color and soy sauce flavor， and have the best length of natto wire drawing. The result of fermentation time showed that nattokinase content reached the maximum value at 17 h.

nattokinase；screen；enzyme activity；characteristic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.023

2014-09-05

中國農業科學院科技經費項目（201211），公益性行業（農業）科研專項經費項目（201303080）

趙仲麟，男，博士，副教授，研究方向：化學生物學、環境微生物；E-mail：rayzzl@163.com

李淑英，女，博士，助研，研究方向：微生物生化與分子生物學；E-mail：lishuying@caas. cn