西瓜枯萎病菌的快速檢測與鑒定

曹月霞 凌鍵 謝丙炎 楊宇紅

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

西瓜枯萎病菌的快速檢測與鑒定

曹月霞 凌鍵 謝丙炎 楊宇紅

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

通過西瓜枯萎病菌與其他專化型枯萎病菌及瓜類幾種重要病原菌的比較基因組分析，獲得了西瓜枯萎病菌的基因組特異序列。在此基礎上，設計出特異引物，篩選可擴增出西瓜枯萎病菌特異性DNA條帶的引物。將特異性引物和尖孢鐮刀菌專化型的通用引物W106R/W106S結合，建立雙重PCR檢測體系。該雙重PCR檢測體系可以在一次PCR反應中快速、準確的檢測出西瓜枯萎病菌，為通過分子方法快速鑒定西瓜枯萎病菌提供技術支持。

西瓜枯萎病菌；雙重PCR；尖孢鐮刀菌

西瓜枯萎病俗稱蔓割病或萎蔫病，是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）引起的一種世界性瓜類土傳病害［1-3］。它的發生極為普遍，對西瓜產量和品質構成了嚴重的威脅，是西瓜生產上的重要病害。目前，對這類維管束病害的有效防治方法主要是依靠抗病品種選育，但可供選育的抗病品種抗源單一，效率不高。趙麗明等［4］從西瓜根際土壤中篩選出對西瓜枯萎病菌防治效果好、無污染土壤中生存良好的放線菌菌株XF9、XF18和XF22，能較好的防治西瓜枯萎病。3種有益微生物為生物農藥的研發奠定了基礎，也為西瓜枯萎病上拮抗菌的拮抗機制奠定了理論基礎。國際上公認的西瓜枯萎病菌有3個生理小種，即生理小種0號、1號和2號，其中2號生理小種的侵染性最強［5-7］。除以上3個生理小種外，還有其他的小種分化，生理小種3于2010年鑒定分離［8］，但在中國尚未見報道，需進一步證實。傳統上對西瓜枯萎病菌的鑒定主要是采用形態特征的比較法，即對不同地區的西瓜枯萎病菌分離物進行形態特征（如菌落顏色、菌落密度、大小孢子的大小與形狀及菌落直徑等）的比較。但利用傳統的鑒定方法來鑒別病原菌準確性不高，已不能滿足生產的要求。近年來，隨著分子生物學技術的發展，包括AFLP、RFLP、RAPD及SCAR在內的分子檢測技術在病原菌鑒定［9］、分類［10］及群體遺傳多樣性［11］研究中得到植物病理學家的高度重視。基于特異基因組設計的特異性引物已經廣泛應用于病原菌的分子檢測，前人基于特異性引物成功建立了快速檢測雙重PCR技術已用于檢測水稻白葉枯病菌和細菌性條斑病菌［12］、小麥條紋花葉病毒和小麥花葉病毒［13］等植物病原菌的分子鑒定體系。目前在尖孢鐮刀菌的分子檢測方面，Zhang等［14］利用甘藍枯萎病菌特異性引物Focs-1/Focs-2和尖孢鐮刀菌通用引物W106R/W106F建立了檢測甘藍枯萎病菌的多重PCR檢測體系。該技術既可應用于甘藍枯萎病發病區病情的檢測，也可從發病植株中檢測出甘藍枯萎病菌。而對于西瓜枯萎病菌的分子檢測，Zhang等［15］把西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌的2對特異性引物Fn-1/Fn-2 和Mn-1/Mn-2置于同一反應中，建立了檢測西瓜枯萎病菌和蔓枯病菌的雙重 PCR 體系。但雙重PCR檢測西瓜枯萎病菌和其他病原菌的方法在國內外都未見報道。

本研究擬通過設計西瓜枯萎病菌的特異引物，與尖孢鐮刀菌的通用引物W106R/W106S結合，建立雙重PCR檢測體系，對西瓜枯萎病菌、尖孢鐮刀菌其他專化型菌株和其他外圍菌株進行專化性檢測，以期為該病的預測預報并及時采取有效的防控措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試菌株包括西瓜枯萎病菌的3個小種共7個菌株、尖孢鐮刀菌其他專化型的10個菌株和其他5個外圍菌株。其種名、來源及數量，見表1。

表1 供試西瓜枯萎病菌菌株的來源

1.2 方法

1.2.1 供試菌株培養 西瓜枯萎病菌在PDA培養基上（28℃）培養72 h后，從菌落的邊緣挑取菌絲轉至PDB液體培養基中（150 r/min，28℃）振蕩培養3 d過濾收集菌絲，-80℃保存備用。

1.2.2 DNA的提取 用改良的CTAB法［16］提取病原菌的DNA。

1.2.3 引物的設計 根據西瓜枯萎病菌的基因組序列，比對近緣種以及其他不同致病菌的序列同源性，通過基因組BLAST的方法找到西瓜枯萎病菌的特異片段。用引物設計軟件Primer 5.0設計出10對引物，詳況，見表2。

表2 待篩選的生物序列

1.2.4 引物的PCR擴增 引物檢測西瓜枯萎病菌的PCR反應總體系是25 μL：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5 μL，10 μmol/L的引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR的反應程序是：94℃預變性4 min；94℃變性40 s；60℃退火30 s；72℃延伸100 s，共30個循環；最后72℃延伸10 min。擴增結束后，取6 μL PCR產物經1%（50×TAE）瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀上觀察并拍照。

1.2.5 引物的特異性檢測 用合成的引物對供試菌株的基因組DNA進行擴增，檢測其特異性，PCR反應體系、反應程序同上。

1.2.6 雙重PCR體系的建立 利用設計的檢測西瓜枯萎病菌的特異性引物與尖孢鐮刀菌其他專化型菌株的通用引物W106R/W106S［17］結合，建立雙重PCR體系。通用引物W106R/W106S的序列為W106R（5'-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3'）和W106S（5'-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3'），該引物使尖孢鐮刀菌其他專化型菌株擴增出一條729 bp的特異性條帶［17］。

雙重PCR反應總體系為25 μL：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5 μL，西瓜枯萎病菌的特異引物（10 μmol/L）各1 μL，通用引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性40 s；60℃退火30 s；72℃延伸100 s，共30個循環；最后72℃延伸10 min。擴增結束后，取6 μL PCR產物經1%（50×TAE）瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀上觀察并拍照。

2 結果

2.1 引物的特異性篩選

利用設計的10對西瓜枯萎病菌特異性引物對供試的7個西瓜枯萎病菌菌株的DNA進行PCR擴增。結果（圖1）顯示，只有1、2、3、4和6號引物均可以產生比較單一的條帶，而其他的引物則不能產生單一的條帶，說明上述5對引物均具有較強特異性。

圖1 利用編號為1至10的引物和通用引物W106R/ W106S擴增的特異性條帶

2.2 特異性引物的檢測

對篩選出的5對引物和供試的7個西瓜枯萎病菌菌株、10個尖孢鐮刀菌其他專化型菌株和5個外圍菌株的DNA進行PCR擴增，以ddH2O為對照。結果顯示，1、2、3、4和6號引物可以使西瓜枯萎病菌產生相應的單一條帶（圖2，泳道1-7），而在尖孢鐮刀菌其他專化型菌株和外圍菌株中均不能產生條帶（圖2，泳道8-22）。通用引物可以使西瓜枯萎病菌和尖孢鐮刀菌其他專化型菌株擴增出729 bp的條帶（圖2，泳道1-17），表明上述引物均具有特異性。

圖2 利用編號為1、2、3、4、6的引物和通用引物W106R/W106S擴增的特異性條帶

2.3 雙重PCR檢測

以5對特異性引物和通用引物（W106R/W106S）對7個西瓜枯萎病菌菌株以及15個對照菌株的基因組DNA進行雙重PCR擴增，以ddH2O為對照。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3所示，西瓜枯萎病菌可以產生兩條不同的條帶（圖3，泳道1-7，1-17），尖孢鐮刀菌其他專化型菌株只產生一條729 bp的條帶（圖3，泳道8-17），而外圍菌株和無菌水不能擴增出條帶（圖3，泳道18-23）。研究結果顯示，雙重PCR檢測結果與常規PCR檢測結果一致，也進一步證明雙重PCR檢測技術的可靠性。

圖3 利用編號為2、3、4、6的引物和通用引物W106R/ W106S擴增的特異性條帶

3 討論

雙重PCR（Duplex PCR）是在一個PCR反應體系中加入兩對特異性引物，同時擴增2個目的基因，能夠在一個PCR反應中檢測出兩種病原菌，提高效率，而且還可以減少因實驗操作所帶來的假陽性等問題，能很好地用于植物病原菌間的檢測。建立雙重 PCR 體系的關鍵是引物設計［18］，雙重PCR反應中引物之間不可以發生相互作用，形成引物二聚體和非特異性的擴增。同時，二者擴增的片段長度要有一定的差距，電泳檢測可以產生不同的條帶。因此，雙重PCR體系的建立很重要［19，20］。

檢測不同植物病原菌的雙重PCR反應在國內外均有報道，如陳慶河等［21］利用馬鈴薯晚疫病菌內轉錄間隔區序列設計了一對特異性引物INF1/INF2，與馬鈴薯青枯病菌特異性引物 759/760 組合建立雙重 PCR 體系。Diallo 等［22］建立了檢測胡蘿卜軟腐果膠桿菌馬鈴薯黑脛病亞種和菊亞種的雙重 PCR體系，能夠快速的對兩種病原菌進行分子檢測。Majumder 等［23］建立了檢測洋蔥黃矮病毒和蔥潛隱病毒的雙重 PCR 體系，該體系是在 RNA 水平上對洋蔥黃矮病毒和蔥潛隱病毒進行檢測。

前人應用雙重PCR方法只能檢測出西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌，而針對西瓜枯萎病菌與尖孢鐮刀菌其他專化型的病原菌和其他病原菌的分子檢測尚未報道。在本研究中，通過對西瓜枯萎病菌的全基因組測序，比對近緣種以及瓜類上幾種重要病原菌的基因組序列，設計并篩選能擴增出西瓜枯萎病菌特異性DNA條帶的引物。本研究設計的特異引物能夠快速而準確的檢測西瓜枯萎病菌，在西瓜枯萎病菌潛伏期和發病初期對其進行診斷、監測和病原菌鑒定，以便采取有效的防治方法，及時控制病害的傳播和蔓延，減少經濟損失，在實際生產上具有重要的指導作用。雙重PCR具有效率高、成本低等優點，具有非常廣闊的實際應用價值，同時本研究也為其他植物病害雙重PCR檢測方法的建立奠定了理論基礎。

4 結論

本研究建立了一種雙重PCR檢測體系，通過設計和應用引物Fon-2R/ Fon-2F、Fon-3R/ Fon-3F、Fon-4R/ Fon-4F 和Fon-6R/ Fon-6F能檢測出西瓜枯萎病菌。該檢測體系具有高效、準確及經濟實惠等優點，適用于西瓜田間土壤的帶菌檢測以及西瓜枯萎病菌的檢驗檢疫和有效防治。

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（責任編輯 狄艷紅）

Rapid Detection and Identification of Fusarium oxysporum f. sp. niveum

Cao Yuexia Ling Jian Xie Bingyan Yang Yuhong
（Institute of Vegetable and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Based on the genome comparison analysis between Fusarium oxysporum f. sp. niveum（Fon）and other closely-related pathogens， the specific sequences of Fon were obtained. Then we developed specific primers that could amplify Fon-specific DNA bands. Combined the Fon-specific primers with the universal primer of Fusarium oxysporum （W106R/W106S）， we established a duplex PCR method that might rapidly and accurately detect Fon by 1 PCR reaction， which is beneficial to technically support the rapid identification of Fon by method of molecular detection..

Fusarium oxysporum f. sp. niveum；duplex PCR；Fusarium oxysporum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.009

2014-11-05

國家自然科學基金項目（31272003），國家科技支撐計劃“果蔬重大病蟲害防控技術研究與集成示范（2012BAD19B06），公益性行業（農業）科研專項（200903049），中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）

曹月霞，女，碩士研究生，研究方向：分子植物病理學；E-mail：caoyuexia815@163.com

凌鍵，男，副研究員，研究方向：植物病理學；E-mail：lingjian2005@126.com