綠色杜氏藻DHDDS基因生物信息學分析及表達研究

潘益芳 龔一富 俞凱 朱帥旗 王何瑜

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

綠色杜氏藻DHDDS基因生物信息學分析及表達研究

潘益芳 龔一富 俞凱 朱帥旗 王何瑜

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

綠色杜氏藻是一種能產生重要次生代謝產物類胡蘿卜素的單細胞綠藻，脫氫多萜醇焦磷酸合成酶（dehydrodolichyl diphosphate synthase，DHDDS）是其在類胡蘿卜素合成途徑中的相關酶。旨在研究DHDDS基因表達與類胡蘿卜素含量之間的關系。提取綠色杜氏藻總RNA，通過轉錄組測序獲得DHDDS基因全長，對該基因進行生物信息學分析；并用不同濃度甲基茉莉酸（MeJA）處理綠色杜氏藻，采用實時定量PCR研究該基因轉錄差異。結果顯示，綠色杜氏藻DHDDS基因全長2 211 bp，含有一個1 740 bp長的開放閱讀框（ORF），編碼579個氨基酸序列。DHDDS蛋白質理論等電點為7.63，相對分子質量為62 472.7 Da。預測結果表明，DHDDS蛋白不含信號肽，也不存在跨膜區域，該蛋白定位于細胞質基質。氨基酸序列比對結果顯示，綠色杜氏藻DHDDS蛋白與小球藻的同源性最高（59%）。實時定量PCR結果表明，經100 μmol/L MeJA處理的綠色杜氏藻DHDDS表達水平最高，具有極顯著差異；在該濃度下，類胡蘿卜素含量均高于其他濃度組。且DHDDS基因的表達與類胡蘿卜素含量呈一定的相關性。綠色杜氏藻DHDDS是一種定位于細胞質基質中的酶，其與綠色杜氏藻類胡蘿卜素合成途徑有關。在一定濃度范圍的MeJA誘導下，低濃度的MeJA對其表達起促進作用，高濃度MeJA對其表達有抑制作用，且其表達與類胡蘿卜素含量呈一定的相關性。

綠色杜氏藻；脫氫多萜醇焦磷酸合成酶；類胡蘿卜素；甲基茉莉酸

極端嗜鹽綠色杜氏藻（Dunaliella viridis）又稱綠色杜氏藻，是一種單細胞真核綠藻，較其它藻類更能忍受高鹽度，是迄今為止發現的最耐鹽的生物之一［1］。由于其結構簡單，無細胞壁，因此綠色杜氏藻成為研究耐鹽機制理想的模式生物［2］。綠色杜氏藻細胞中含有豐富的類胡蘿卜素、甘油、多糖等能提高免疫力、清除自由基、預防心血管病的物質［3］，可以作為天然的保健品，具有一定的營養價值；目前，對綠色杜氏藻的研究主要集中在耐鹽機制［4］和類胡蘿素積累機制［5］這兩個方面。

類胡蘿卜素通常是指含有40個碳原子的萜類色素，主要通過萜類途徑合成，即甲羥戊酸途徑（MVA）和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（MEP）。脫氫多萜醇焦磷酸合成酶（dehydrodolichyl diphosphate synthase，DHDDS）存在于萜類合成的第二階段，將異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）與法呢基焦磷酸（farnesyl-phyophosphate，FPP）或焦磷酸雙牛龍牛兒基丙酮（geranylgeranyl diphosphat，GGPP）通過不斷縮合，直至形成焦磷酸多萜醇（polypeno-pyrophosphat，Pol-PP）［6］，Pol-PP經脫磷酸和還原后得到多萜醇（dolichol，Dol）。DHDDS在許多糖蛋白的N-糖基化中起著非常重要的作用，是多萜醇合成途徑中的關鍵酶，也是類胡蘿卜素合成途徑的相關酶。

甲基茉莉酸（Methyl Jasmonate，MeJA）是一種廣泛存在于植物體內的生長調節物質。有報道認為外源性茉莉酸類化合物能有效刺激植物次生代謝物的生物合成［7，8］，能誘導植物產生抗毒素。在細胞工程中，MeJA 是促進類胡蘿卜素等次生代謝產物積累的誘導因子［9］。植物中次生代謝產物的合成通過誘導因子調節次生代謝途徑中關鍵酶的表達來調節［10］。馬君蘭等［11］研究表明，在大豆生長過程中通過噴灑MeJA 能改變苯丙氨酸解氨酶（PAL）的酶活性，從而影響其次級代謝，使大豆中異黃酮的含量增加。廖巧［12］研究表明，在青蒿生長過程中用 MeJA 噴灑的植株α-氨基己二酸還原酶（AAR）、乙醛脫氫酶1（ALDH1）基因的表達水平顯著提高，其青蒿素含量亦顯著提高。桂連友［13］研究表明，外源 MeJA 能夠提高茶樹葉片脂氧合酶（LOX）的活性。施江［14］研究表明，外源 MeJA能誘導茶樹鮮葉中不同的次生代謝途徑，能降低非揮發性次生產物含量，增加揮發性產物含量，提高茶樹鮮葉的品質。但是MeJA誘導藻類次生代謝產物積累方面的報道較少，王鑫威等［15］研究表明，一定濃度的MeJA可以促進單位細胞雨生紅球藻次生代謝產物蝦青素的合成。章麗等［16］研究表明，一定濃度的外源MeJA能誘導鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的積累。因此本研究使用MeJA作為誘導子，試圖探究其在綠色杜氏藻DHDDS合成代謝途徑中的影響。

如今，DHDDS基因已經在擬南芥［17］、玉米［18］、斑馬魚［19］等動植物中被克隆出來，但尚未有綠色杜氏藻中的DHDDS基因的相關報道。本實驗通過綠色杜氏藻轉錄組測序，序列拼接和分析得到DHDDS基因序列，對其進行生物信息學分析，同時用誘導子甲基茉莉酸處理綠色杜氏藻，研究DHDDS的轉錄差異，旨在為進一步闡明DHDDS在類胡蘿卜素合成代謝途徑及其調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 綠色杜氏藻藻種（D. viridis）由寧波大學海洋生物工程重點實驗室微藻室提供。綠色杜氏藻培養液為PKS培養基，25±0.5℃，4 000 lx光強，光暗周期比12 h∶12 h，每天搖瓶2-3次。

1.1.2 引物設計與合成 利用Primer Premier5.0軟件設計引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 綠色杜氏藻總RNA的提取 取純化培養的處于對數生長期的綠色杜氏藻，離心收集，按照TaKaRa RNAiso plus kit（TaKaRa，大連）操作說明書提取總RNA。經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA質量。按照反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）的操作說明，反轉錄獲得cDNA，保存于-20℃備用。

1.2.2 轉錄組測序獲得基因序列 綠色杜氏藻DHDDS基因全長序列由本實驗室綠色杜氏藻轉錄組測序獲得的。

1.2.3 DHDDS的生物信息學分析 將測序獲得的 序 列 在NCBI（National Center for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站查找其開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）并進行核酸、氨基酸比對［20］；通過CBS（http：//www. cbs.dtu.dk/）網站預測信號肽、轉運肽及其跨膜結構域［21-23］；使用ExPASy（http：//cn.expasy.org）中文鏡像網站預測蛋白的疏水性/親水性、分子量、等電點及二、三級結構［24，25］。利用DNAMAN 4.0 軟件推導DHDDS基因的氨基酸序列；用Vector NTI 7.1 軟件對測序獲得的綠色杜氏藻DHDDS基因進行多序列比對；MEGA 3.0 軟件的鄰接歸并法（NJ法）構建系統進化樹［26］；用SOPMA［27］（https：//sopma. expasy.org/）預測綠色杜氏藻DHDDS氨基酸序列的二級結構。

1.2.4 綠色杜氏藻DHDDS表達特征分析 將綠色杜氏藻細胞以1×105cells/mL接種到PKS培養液中，培養2 d后，向培養瓶中分別添加不同體積的MeJA母液，分別將培養瓶中MeJA終濃度調整為0（對照組）、50、100、200和500 μmol/L，每個外源MeJA誘導組設3個重復組。處理24 h，提取不同處理組綠色杜氏藻的總RNA。用NanoDrop 2000超微量核酸定量光譜儀（Thermo，美國）測定RNA樣品的濃度和純度。熒光定量PCR 目的基因引物：DHDDS-1：5'-CCTGGAAACGCTTGAATAAAT-3'和DHDDS-2：5'-CAGTTGCTCGTATCCGTATCG-3'，β-actin內參基因引物：BACTIN-1：5'-CGTGACTTGACGGACTACCTG-3'和 BACTIN-2：5'-TAGTTTTTGTCCAGAGCCGAG-3'。 熒光定量PCR反應在Realplex4型定量PCR儀（Eppendorf，德國）上進行，反應體系為：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR反應程序為：94℃ 3 min；94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環。反應結束后確認擴增曲線和融解曲線。計算綠色杜氏藻DHDDS基因相對表達量，每個樣品重復3次。采用SPSS軟件進行數據統計分析。

1.2.5 綠色杜氏藻類胡蘿卜素含量的提取和測定用0、50、100、200和500 μmol/L的MeJA處理綠色杜氏藻，培養10 d，吸取20 mL藻液置于50 mL離心管中，4 000 r/min離心8 min，用雙蒸水沖洗沉淀2 次，加16 mL純丙酮，冰浴超聲5 min，-20℃保存24 h后，8 000 r/min離心10 min，重復提取直到藻體呈白色。以1∶10的量加入60% KOH于色素提取液中，振蕩后靜置分層，以除去葉綠素和中性脂肪的影響。全部提取液用 0.22 μm 的注射式膜過濾，定容到100 mL，在722型分光光度計上測定450 nm波長下提取液的最大吸光度A，以胡蘿卜素分子平均吸收系數250為依據，按下式計算：

式中，A為測定的最大吸光度；20為換算系數。以上操作都在遮光條件下進行。

2 結果

2.1 綠色杜氏藻DHDDS生物信息學分析

2.1.1 綠色杜氏藻DHDDS的基本理化性質分析綠色杜氏藻轉錄組測序獲得的DHDDS基因序列全長為2 211 bp，其中5'非翻譯區（Untranslated Regions，UTR）為204 bp，3' UTR為270 bp，開放閱讀框（ORF）1 740 bp（核苷酸序列位置269-2 008），編碼579 個氨基酸的蛋白質（圖1），該蛋白的分子式為C2718H4262N822O810S33，原子個數8 645，推導的蛋白質理論等電點（pI）為7.63，相對分子質量為62 472.7 Da。正電荷殘基（Arg+Lys）總數為54，負電荷殘基（Asp+Glu）總數為53，不穩定系數為60.79，該蛋白分類為不穩定蛋白。脂肪系數為74.54，其疏水性平均值為-0.317，表現為親水性，無明顯的疏水區域。具有3個主要保守區，保守序列為AFIMDGNRR，YAFSI（D/E）NFKR和IRTSG（E/A）（T/I/A）RLS（N/D）F（L/M）LWQ，到目前為止，這是多萜醇磷酸合成酶的共同特征［28］，屬于順式-IPPS蛋白家族。同源性比對發現綠色杜氏藻與小球藻（Chlorella variabilis）DHDDS基因的氨基酸序列相似性最高，達到了59%，與虎刺梅（Callorhinchus milii）、侏儒鳥（Manacus vitellinus）、斑馬魚（Danio rerio）、小家鼠（Mus musculus）和小頭蟲（Capitella teleta）的同源性分別為46%、46%、43%、43%和40%。

2.1.2 綠色杜氏藻DHDDS亞細胞定位的預測 通過CBS網站在線預測，結果顯示DHDDS不含信號肽，也不存在跨膜區域，其定位于細胞質基質。

圖1 綠色杜氏藻DHDDS基因全長及其推導氨基酸序列

2.1.3 綠色杜氏藻DHDDS二級結構和三級結構的預測 用SOPMA預測綠色杜氏藻DHDDS氨基酸序列的二級結構，有34.72%的α-螺旋，15.54%的延長鏈，7.08%的β-轉角和42.66%的無規則卷曲。DHDDS 三級結構的預測結果如圖 2 所示。該蛋白是典型的T字型結構，其酶的活性位點在其T字交叉處，其中Lys40靠近該蛋白質的活性位點，是在多個物種中高度保守的殘基，表示強烈的進化約束。帶正電的Arg235在酶的活性位點的組織中起重要作用，可能與活性位點與FPP的結合有關。

圖2 綠色杜氏藻DHDDS蛋白三級結構預測圖

2.1.4 綠色杜氏藻DHDDS的生物進化分析 通過NCBI數據庫中Blastp對DHDDS氨基酸序列進行相似性搜索和比對，選取同源性較高的11個物種構建進化樹，序列如下：麥芽糖假絲酵母（Candida maltosa，EMG47928.1）；傘狀毛霉菌（Lichtheimia corymbifera，CDH54945.1）；短花藥野生稻（Oryza brachyantha，XP_006655828.1）；小米（Setaria italica，XP_004964740.1）；玉米（Zea mays，ACG35019.1）；馬鈴薯（Solanum tuberosum，XP_006353865.1）；甜橙（Citrus sinensis，XP_006480091.1）；葡 萄（Vitis vinifera，XP_002263977.1）； 草 莓（Fragaria vesca subsp. Vesca，XP_004289930.1）；小球藻（Chlorella variabilis，XP_005848062.1）；新型微藻（Auxenochlorella protothecoides，KFM24359.1）。結果（圖3）顯示，12個不同物種的DHDDS基因大體分成4支，小球藻（Chlorella variabilis）和新型微藻（Auxenochlorella protothecoides）聚成一支，真菌麥芽糖假絲酵母（Candida maltosa） 和 傘 狀 毛 霉 菌（Lichtheimia corymbifera）聚成一支，雙子葉植物甜橙（Citrus sinensis），草莓（Fragaria vesca subsp. Vesca），葡萄（Vitis vinifera）和馬鈴薯（Solanum tuberosum）聚成一支，而綠色杜氏藻（Dunaliella viridis）則與單子葉植物玉米（Zea mays）、小米（Setaria italica）和短花野生稻（Oryza brachyantha）聚成一支。可以看出綠色杜氏藻與單子葉植物的親緣關系較近，與其他植物親緣關系稍遠。

圖3 綠色杜氏藻與其他物種DHDDS氨基酸序列的系統進化樹

2.2 綠色杜氏藻在MeJA誘導下類胡蘿卜素含量和DHDDS表達分析

實時熒光定量結果（圖4）表明，經過不同濃度的甲基茉莉酸（MeJA）處理綠色杜氏藻，DHDDS基因相對表達水平具有一定差異性，呈現先增加后減少再增加的趨勢。濃度為100 μmol/L MeJA處理綠色杜氏藻，DHDDS轉錄水平最高，經500 μmol/L MeJA處理綠色杜氏藻，其DHDDS轉錄水平最低。經50 μmol/L MeJA處理的綠色杜氏藻DHDDS表達水平不具有顯著差異（F50=1.454，P＞0.005）。經100 μmol/L和500 μmol/L MeJA處理的綠色杜氏藻DHDDS表達水平具有極顯著差異（F100=3.630，P＜0.001；F500=0.157 127，P＜0.001），經200 μmol/L MeJA處理的綠色杜氏藻DHDDS表達水平具有顯著差異（F200=0.379，P＜0.05）。不同濃度MeJA處理對綠色杜氏藻類胡蘿卜素含量的影響，結果（圖5）表明，隨著MeJA濃度的升高，綠色杜氏藻類胡蘿卜素含量呈現先上升后下降的趨勢，MeJA濃度在100 μmol/L時，綠色杜氏藻類胡蘿卜素含量最高。與對照相比，具有顯著差異（C100=9.386 667，P＜0.05）。MeJA濃度在1 000 μmol/L時，未檢測到類胡蘿卜素含量。

圖4 甲基茉莉酸濃度對綠色杜氏藻DHDDS轉錄的影響

圖5 甲基茉莉酸濃度對綠色杜氏藻類胡蘿卜素含量的影響

3 討論

本研究從綠色杜氏藻轉錄組測序結果中獲得DHDDS基因序列全長，對DHDDS核苷酸序列及氨基酸序列進行比對。結果顯示綠色杜氏藻DHDDS基因核酸序列未能在其他物種中找到相似序列，而氨基酸序列比對結果顯示與之相似的物種有很多。這一結果證明不同物種之間的氨基酸序列比對相較于核苷酸序列比對，其相似性更高、更廣泛［29］。生物信息學方法預測，DHDDS的開放閱讀框為 1 740 bp，編碼579個氨基酸，序列已上傳至GenBank（登錄號 KP125328）。

綠色杜氏藻DHDDS含有3個保守位點，分別位于 28-36 aa，76-83 aa，228-243 aa，保守結構域分析結果表明，DHDDS蛋白屬于順式-IPPS蛋白家族。其中分析保守區域發現，28-36 aa序列同目前不同物種已獲得的DHDDS活性中心相同［28］，基本可確定該區域是綠色杜氏藻DHDDS的活性中心。綠色杜氏藻DHDDS蛋白等電點為7.63，相對分子質量為62 472.7 Da，二級結構中無規則卷曲含量最多，其次為α-螺旋，延長鏈和β-轉角。不含有轉運肽、信號肽、跨膜結構域等結構，定位于細胞質，該結論同Núria Cunillera等［17］分析的擬南芥DHDDS定位于細胞質粗面內質網上相近。根據氨基酸序列比對制作系統進化樹，發現綠色杜氏藻DHDDS與單子葉植物的親緣關系較近，與其他植物的親緣關系稍遠。該結論雖與形態分類學［30］的結果有一定的差異，但對判斷不同植物之間的親緣關系也具有一定的借鑒意義。

MeJA是與植物代謝及防御相關的內源激素［31］。實時定量PCR結果顯示，綠色杜氏藻DHDDS的表達水平受到MeJA濃度的影響，其中100 μmol/L的MeJA處理的綠色杜氏藻，其DHDDS的表達較對照組明顯提高。同時，該濃度下，綠色杜氏藻細胞內類胡蘿卜素含量也高于其他濃度組。而經500 μmol/L的MeJA處理后，綠色杜氏藻DHDDS的表達則受到抑制，綠色杜氏藻細胞內類胡蘿卜素含量也低于其他濃度組。該結果也與前人的研究結果相符。Yukimune等［32］分別在曼地亞紅豆杉和歐洲紅豆杉細胞懸浮培養液中加入100 μmol/L的MeJA，發現能明顯提高曼地亞紅豆杉紫杉醇的含量，而歐洲紅豆杉則表現出最高的漿果赤霉素III的含量。余龍江等［9］在紅豆杉胚性細胞培養過程中加入不同濃度的MeJA，結果表明在濃度100 μmol/L時紫杉醇產量出現最大值。朱穎等［33］研究茉莉酸甲酯對杜氏鹽藻β-胡蘿卜素含量的影響發現，MeJA 能誘導鹽藻β-胡蘿卜素的積累，其中100 μmol/L的MeJA處理效果最佳，比對照增加了33.85%。而Choi等［34］報道高濃度的MeJA能抑制甾體類甘油生物堿的積累。這可能是高濃度的MeJA對綠色杜氏藻DHDDS的表達也有類似的作用。

綠色杜氏藻DHDDS氨基酸序列較長，是玉米（Z. mays）的1.91倍，是甜瓜（C. smelo）的1.97倍，是葡萄（V. vinifera）的2倍。本實驗首次獲得了綠色杜氏藻DHDDS基因，并全面地對DHDDS進行了生物信息學分析，探討了DHDDS的表達與類胡蘿卜素含量之間的關系，為今后深入研究DHDDS結構和功能提供了可靠依據。目前對綠色杜氏藻DHDDS的研究尚不完全，對于其在類胡蘿卜素合成機制中的具體作用仍不是非常清楚，還需要進一步研究探索。

4 結論

通過綠色杜氏藻轉錄組測序，得到DHDDS基因全長序列，該基因全長為2 211 bp，ORF為1 740 bp。生物信息學分析表明，該蛋白是一種親水性不穩定蛋白；二級結構主要組成元件為α-螺旋和無規則卷曲；3D模型成功構建，具有3個主要保守區域，屬于順式-IPPS蛋白家族。定位于細胞質基質，與綠色杜氏藻類胡蘿卜素合成途徑有關。不同濃度的誘導子甲基茉莉酸對綠色杜氏藻DHDDS基因的表達有影響，一定范圍內，低濃度的MeJA對其表達起促進作用，高濃度MeJA對其表達有抑制作用，且其表達與類胡蘿卜素含量呈一定的相關性。

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（責任編輯 馬鑫）

Bioinformatics Analysis and Expression Study of DHDDS of Dunaliella viridis

Pan Yifang Gong Yifu Yu Kai Zhu Shuaiqi Wang Heyu
（School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）

Dunaliella viridis is a unicellular green alga producing valuable secondary metabolite carotenoids， and dehydrodolichyl diphosphate synthase（DHDDS）is an enzyme in the synthesis pathway of carotenoids. It was to investigate the correlation between expression of DHDDS gene in D. viridis treated with different concentrations of MeJA and the content of carotenoids. Total RNA was extracted from D. viridis and the full length of DHDDS was acquired by de-novo transcriptome sequencing， then the sequence was analyzed by bioinformatics website and software to predict the protein structure. Transcriptional levels of D. viridis treated with different concentrations of MeJA were examined by Realtime quantitative PCR（RT-qPCR）. The total length of gene DHDDS was 2 211 bp， containing a 1 740 bp open reading frame（ORF）that encoded 579 amino acids. Theoretical isoelectric point of DHDDS protein was 7.63. Relative molecular mass was 62 472.7 Da. Bioinformatics prediction revealed that there was no signal peptide and transmembrane domain in DHDDS protein， and it was located in cytoplasmic matrix. Sequence alignment showed that DHDDS of D. viridis shared the highest homology of 59% with that of Chlorella variabilis. The RT-qPCR showed that the expression of DHDDS gene in D. viridis treated by 100 mol/L of MeJA was the highest with significant difference：at this concentration，the content of carotenoids was higher than other groups. There was certain correlation between the expression of DHDDS gene and the content of carotenoids. Conclusively， the DHDDS of D. viridis is an enzyme located in cytoplasmic matrix， relating to synthesis pathway of carotenoids. Within certain concentration， MeJA in lower concentration shows promoting effect on the expression， and inhibiting in higher concentration， there is a correlation between the expression and the content of carotenoids.

Dunaliella viridis；DHDDS；carotenoids contents；MeJA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.015

2014-12-02

浙江省科技廳重點科技創新團隊項目（2012R10029-07，2010R50029），寧波市科技項目（2013C10018）

潘益芳，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學；E-mail：pannyfang@126.com

龔一富，男，副教授，研究方向：植物分子生物學；E-mail：gongyifu@163.com