卵形鯧鲹耐低溫候選基因△6FAD全長cDNA 序列的克隆與表達分析

韓洪波王忠良，2，3陳剛，2，3湯保貴，2，3張健東黃建盛周暉施綱潘傳豪

（1.廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2.廣東省普通高校 南海水產經濟動物增養殖重點實驗室，湛江 524088；3. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江 524088）

卵形鯧鲹耐低溫候選基因△6FAD全長cDNA 序列的克隆與表達分析

韓洪波1王忠良1，2，3陳剛1，2，3湯保貴1，2，3張健東1黃建盛1周暉1施綱1潘傳豪1

（1.廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2.廣東省普通高校 南海水產經濟動物增養殖重點實驗室，湛江 524088；3. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江 524088）

采用cDNA末端快速擴增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術克隆了卵形鯧鲹△6脂肪酸去飽和酶（△6FAD）的cDNA全長序列，并對其基因和蛋白序列結構特征進行了生物信息學分析，同時采用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術分析了該基因在不同溫度條件下的表達差異及低溫下的時序表達模式。結果顯示，卵形鯧鲹△6FAD基因cDNA序列全長1 908 bp，其中開放閱讀框為1 329 bp，3'非編碼區431 bp，5'非編碼區135 bp，共編碼442個氨基酸；其編碼蛋白屬于疏水性蛋白，無信號肽特征，含有大量蛋白質二級結構和該家族典型的組氨酸富集區及細胞色素b5結構域。系統進化分析表明，卵形鯧鲹△6FAD基因與尖吻鱸、軍曹魚的△6FAD基因在進化關系上最為接近，其次是大菱鲆、藍鰭金槍魚和點帶石斑魚，但與斑馬魚、小鼠和人△6FAD基因進化關系較遠。實時熒光定量PCR結果表明，該基因的表達與環境溫度和脅迫時間存在明顯相關性，其表達水平在降溫過程中隨溫度降低而先緩慢下降后又迅速升高，在不同的低溫環境下表現出不同的時序表達模式：13℃時，隨時間延長該基因的表達量呈現先降低后又升高至原來水平的變化趨勢，16℃和19℃時則表現出一種隨時間延長逐漸降低的反饋式調節方式。

卵形鯧鲹；△6脂肪酸去飽和酶；cDNA克隆；低溫脅迫

卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）隸屬于鲹科（Carsngidae）鯧鲹屬（Trachinotus），為暖水性魚類。近年來，隨著人工育苗的成功和養殖技術日趨成熟，卵形鯧鲹的人工養殖在華南沿海地區迅速展開，成為海水魚類養殖的主要品種之一。卵形鯧鲹屬于溫水型魚類，低溫環境將對卵形鯧鲹的養殖生產產生極大的影響，限制著卵形鯧鲹養殖業的發展。目前有關低溫應激對卵形鯧鲹血清生化、免疫指標、激素的影響已開展研究［1］，但關于卵形鯧鲹耐低溫候選基因的篩選及全長克隆和低溫脅迫對其表達量的影響尚未見報道。

魚類的耐低溫性狀是一種重要的經濟性狀，也是一種數量性狀，受微效多基因控制［2］。研究表明，魚類在遭遇冷脅迫時為了保持生理穩態不被破壞，通過提高細胞膜上不飽和脂肪酸的比例來增加細胞膜的流動性，維持細胞在低溫下的生理活性［3］。低溫環境下磷脂中不飽和脂肪酸（特別是DHA）的積累是膜流動性對于溫度適應的一種表現［4］，控制脂肪酸去飽和反應，提高不飽和脂肪酸含量可以改善魚類的抗寒性［5］。因此，細胞膜脂肪酸的脫飽和是魚類在低溫脅迫下的重要適應機制［6］。魚類△6脂肪酸去飽和酶（△6FAD）是參與魚類多不飽和脂肪酸（PUFA）生物合成的關鍵酶，大量研究證明，營養因素和環境因素會影響魚類PUFA生物合成關鍵酶基因的表達水平，進而影響魚類高度不飽和脂肪酸的合成［7］。多不飽和脂肪酸，尤其是二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）作為魚類的必須營養素在維持生命體的正常機能，促進生長、發育、繁殖和提高成活率等方面發揮著不可替代的生理作用。有關脂肪酸去飽和酶基因家族與植物抗冷性狀的研究目前已有大量的研究，如白云豆［8］及油菜［9］的SAD（硬脂酰-ACP去飽和酶）和橄欖［10］、馬齒莧［11］的FAD（脂肪酸去飽和酶）在轉錄水平均受低溫調節，但與水生生物抗寒性的研究還較少。

本研究克隆卵形鯧鲹△6FAD cDNA的序列全長，并對該基因進行生物信息學分析，同時研究低溫脅迫下卵形鯧鲹肝臟組織中該基因的表達模式，旨在為探究卵形鯧鲹多不飽和脂肪酸的合成機制及與溫度調節的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗用魚來自廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地。魚體健康，活力良好的卵形鯧鲹（約30 g）共195尾，分為5個實驗組和1個對照組，每組3個平行，在溫控循環水族箱中暫養一周后用于實驗。

1.1.2 主要儀器和試劑 Trizol購自北京全式金生物有限公司。M-MLV Reverse Transcriptase、Oligo（dT）18、dNTP、Ribonuclease Inhibitor、DNA Marker、pMD18-T Vector均購自TaKaRa公司。UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購自上海生工生物有限公司；3'-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase和5'-Full RACE Kit with TAP 試劑盒均購自TaKaRa公司；F-416XL DyNAmo ColorFlash SYBR和 AB-1182 ABgene Strips of 8 Tub購自美國Thermo Fisher Scientific公司，PCR 儀為Bio-Rad 公司和TaKaRa 公司。熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。

1.2 方法

1.2.1 低溫處理 實驗期間每天投喂商品飼料兩次，實驗開始后采用3℃/d的降溫方式對實驗組從常溫28℃開始進行降溫處理直至分別降到預先設定的實驗溫度25℃、22℃、19℃、16℃和13℃，對照組則保持28℃的恒溫。實驗組卵形鯧鲹在各實驗溫度下分別喂養0、12、24、36、48、60、72和84 h后隨機采樣，取肝臟組織儲存于液氮中用于后續實驗。

1.2.2 卵形鯧鲹△6 脂肪酸去飽和酶cDNA全長序列的克隆

1.2.2.1 總RNA的提取 取于-80℃保存的卵形鯧鲹肝臟組織50-100 mg，按照上海生工的UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒中推薦的方法提取、純化總RNA，提取的總RNA樣品經過微量核酸定量儀測定其OD260/OD280值。

1.2.2.2 中間片段的獲取 按TaKaRa公司M-MLV Reverse Transcriptase說明書步驟將上述提取的總RNA進行RT反應，隨后應用基于其他物種△6脂肪酸去飽和酶基因序列設計的特異性引物PCR擴增卵形鯧鲹△6FAD的中間片段。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32個循環。最后得到大小為300 bp左右的PCR產物，產物經切膠回收純化后克隆到pMD18-T Vector上，并轉化到感受態細胞E.coli DH5α中，經菌落PCR鑒定，挑選陽性克隆后送上海生工測序。

1.2.2.3 卵形鯧鲹△6FAD的3'和5'RACE 根據同源克隆獲得的△6FAD大小為303 bp的中間片段，設計用于3'和5'序列全長擴增的特異性引物（表1）。按照TaKaRa公司的3'-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒要求，分別進行3'RACE和5'RACE擴增。3'RACE首輪和次輪PCR反應條件分別為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 55 s，共25個循環；94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1 min 55 s，共30個循環。5'RACE第一輪和第二輪PCR退火溫度分別為：55.8℃和57.8℃，PCR程序同上。隨后，純化RACE-PCR產物并進行克隆和測序。

1.2.2.4 卵形鯧鲹△6FAD生物信息的預測 采用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html）和protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）確定開放閱讀框（ORF）并預測由該閱讀框編碼蛋白的分子量計算值（Mw）和理論等電點（pI）；通過在線分SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP）預測信號肽序列；以TMHMM在線服務器（http：//cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）預測該編碼蛋白中存在的跨膜結構域；應用在線預測軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=npsa_sopma.html）和 PredictProtein（http：//www.predictprotein.org/）預測蛋白二級結構。應用Prosite（http：//prosite.expasy.org/）和NCBI的CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）工具預測蛋白質結構域、家族和功能位點；氨基酸序列同源性分析和系統進化樹的構建分別采用Vector NTI 11和MEGA6軟件。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析 將低溫脅迫處理下采集的肝臟組織進行RNA的提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳和微量核算定量儀檢測其總RNA的完整性、OD值和濃度。在檢測卵形鯧鲹△6FAD在兩種低溫脅迫處理下的表達水平前，先將提取的所有樣品總RNA進行反轉錄成cDNA，再按照Thermo公司的F-416XL DyNAmo ColorFlash SYBR試劑盒使用說明，采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進行實時定量PCR擴增反應。在熒光定量PCR儀上設置好孔的位置且各樣品均設置3個復孔。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性20 s，57.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行40個循環；最后72℃延伸30 s。設置好PCR過程中檢測的臨界點，每個循環退火末期檢測熒光信號。最后在反應條件中加入分析模式為：70-95℃升溫，其中每次升溫0.5℃，反應時間為10 s的熔解曲線分析，以卵形鯧鲹β-actin為內參，對得到的各樣品Ct值進行均一化處理，應用2-ΔΔCT法確定不同處理方式下肝臟組織中△6FAD的相對表達量，實驗數據采用SPSS19.0進行單因素顯著性分析和Duncan多重性比較。

2 結果

2.1 總RNA的提取

提取的總RNA樣品經過微量核酸定量儀，測定其OD260/OD280值均在1.8-2.0之間，說明提取的總RNA較為單一。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示清晰的28S和18S rRNA條帶（圖1），說明提取的總RNA樣品完整性良好，可以用于下一步實驗。

表1 △6脂肪酸去飽和酶cDNA克隆及qPCR所需引物

圖1 肝臟組織中提取的總RNA

圖2 卵形鯧鲹△6FAD基因cDNA開放閱讀框及推測編碼的氨基酸序列

2.2 卵形鯧鲹△6FAD基因克隆及序列同源性分析

經DNAman工具拼接后獲得全長為1 908 bp的卵形鯧鲹△6脂肪酸去飽和酶基因的全長cDNA序列（GenBank 登錄號：KP295471），開放閱讀框1 329 bp，編碼442個氨基酸殘基（圖2）。利用Vector NTI 11軟件將得到的卵形鯧鲹△6FAD基因所編碼的氨基酸序列與GenBank上公布的其他物種的△6FAD的氨基酸序列進行同源性比對，結果（表2）顯示，該基因編碼的氨基酸序列與其他魚類的△6脂肪酸去飽和酶氨基酸序列具有很高的相似度，與尖吻鱸（Lates calcarifer）、軍曹魚（Rachycentron canadum）、 大 菱 鲆（Scophthalmus maximus）、 點帶石斑魚（Epinephelus coioides）、金頭鯛（Sparus aurata）和鱖魚（Siniperca chuatsi）的同源性分別高達87%、88%、83%、84%、83%和83%，但與斑馬魚（Danio rerio）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo sapiens）等哺乳動物同源性較低，分別為67%、63%和63%。

2.3 卵形鯧鲹△6FAD氨基酸序列的理化性質

Protparam預測該編碼氨基酸理論分子質量約為52 kD，理論等電點8.88，其中Leu最多，有47個，占總氨基酸數的10.6%，其次分別是His和Phe，分別為32個和29個，占總氨基酸數的7.2%和6.6%，最少的為Cys，只有6個，占總氨基酸的1.4%。蛋白質序列中不存在Pyl和Sec，含正電荷殘基數42個，負電荷殘基數36個，不穩定指數為40.05，被分類為不穩定蛋白。該蛋白的理論疏水值和總平均親水性分別為87.81和-0.167，屬于一種疏水性蛋白，脂肪族氨基酸指數也因序列中含有較多的Leu而高達87.81。

表2 卵形鯧鲹和其他各物種的△6FAD氨基酸序列同源性比對分析/%

2.4 卵形鯧鲹△6FAD氨基酸序列信號肽和亞細胞定位

SignalP預測中未檢測到該蛋白中存在信號肽，故該蛋白應不屬于分泌蛋白（圖3）。 PSORT II Prediction對△6FAD的亞細胞定位結果中顯示，卵形鯧鲹△6FAD定位于細胞質中的可能性最高，為39.1%，其次分別為內質網34.8%、線粒體13%，細胞外、分泌囊泡和高爾基體中可能性最低，均為4.3%。

圖3 △6FAD蛋白的信號肽預測分析

2.5 卵形鯧鲹△6FAD氨基酸二級結構和跨膜結構域、功能域的預測

PredictProtein和SPOMA對卵形鯧鲹△6FAD氨基酸二級結構的預測中呈現出相似的結果，都顯示螺旋結構（helix）和無規則卷曲結構（Beta turn）為該蛋白質二級結構中的主要構成部分，分散存在于整個蛋白質結構中。其中在SPOMA的預測結果中顯示α螺旋（Alpha helix）和無規則卷曲（random coil）分別有170處和145處，占總二級結構的38.46%和32.81%；其次，鏈延伸結構（Extended strand）有90處，占20.36%，而β轉角（Beta turn）在整個蛋白的二級結構中含量最少，只有37處，占8.37%（圖4）。在PredictProtein的結果中還顯示該蛋白可能存在3個跨膜區螺旋，4個跨膜區，共形成4個跨膜區拓撲結構。在TMHMM在線服務器反饋的結果中也明顯看到在氨基酸序列的143-165、264-286、301-323這3個區域存在3個跨膜螺旋區，這一結果與PredictProtein中預測的跨膜螺旋區數目一致。在Prosite和NCBI的CDD的預測結果中均顯示該編碼蛋白在位置為16-93上含有一個屬于細胞色素b5家族的血紅素結合結構域（heme-binding domain）；此外，NCBI的CDD分析顯示，該蛋白具有膜結合脂肪酸去飽和酶超家族的保守脂肪酸去飽和酶結構和一個類△6脂肪酸去飽和酶結構（圖5）。

圖4 △6FAD蛋白的二級結構預測圖

圖5 CDD預測的△6FAD蛋白的結構域分析圖

2.6 卵形鯧鲹△6FAD蛋白的系統進化分析

應用MEGA6軟件將推測的卵形鯧鲹△6FAD氨基酸序列及從GenBank下載的其他物種的同種基因推測的氨基酸序列進行比對分析并按NJ法構建該基因在這些物種中的進化樹。結果（圖6）表明，卵形鯧鲹與尖吻鱸（Lates calcarifer）、軍曹魚（Rachycentron canadum）在進化關系上最為接近，其次是大菱鲆（Scophthalmus maximus）、藍鰭金槍魚（Thunnus thynnus）和點帶石斑魚（Epinephelus coioides），但卻與斑馬魚（Danio rerio）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo sapiens）表現出較遠的進化關系，這一結果與氨基酸序列相似性比對結果一致。

2.7 低溫脅迫下誘導的卵形鯧鲹△6FAD基因的表達分析

在卵形鯧鲹△6FAD基因隨溫度變化的相對表達分析中，各實驗組降到目標溫度12 h后卵形鯧鲹肝臟中△6FAD基因的表達量被測定。結果（圖7）顯示，該基因的表達量在28℃到13℃范圍內隨溫度的降低先緩慢降低后又迅速升高，13℃時達到峰值，并與其他各溫度下的表達量存在顯著性差異（P＜0.05），而對照組中則基本保持平衡，各組間表達量差異不顯著（P＞0.05）。而不同低溫下隨時間變化的相對表達分析中，該基因的時序表達模式在不同低溫下不同，其中13℃時表現出的時序表達模式與16℃和19℃出現明顯差異。13℃下，△6FAD的表達量隨時間的增加先降低后升高，最終恢復至原來水平，與0 h時差異不顯著（P＞0.05），而16℃和19℃下，該基因的表達量則表現出一種反饋式的調節方式且逐漸隨時間降低（圖8）。

圖6 △6 FAD蛋白同源序列的分子進化樹

圖7 △6 FAD基因隨溫度變化的相對表達分析

圖8 △6 FAD基因在不同低溫下隨時間的相對表達分析

3 討論

3.1 卵形鯧鲹△6FAD基因的低溫補償機制

△6FAD是一種膜結合脂肪酸去飽和酶，屬于脂肪酸去飽和酶家族中的一員，是生物體內參與多不飽和脂肪酸合成的關鍵酶。在n-3或n-6途徑合成多不飽和脂肪酸的過程中，△6FAD主要以NADH、細胞色素b5氧化還原酶作為電子供體，催化甘油酯中的脂肪酸脫氫［12］。魚類脂肪酸代謝對環境溫度的變化極為敏感，溫度脅迫下發生的生物膜膜脂結構重組及成分變化等溫度補償機制普遍存在于魚體中。當水溫急劇下降時，魚類肝、腎、心臟等組織的細胞膜膜脂流動性和彈性減弱，膜脂的不對稱性使膜體緊縮不均勻而造成破損滲漏或通透性增加，胞內溶質外流入血，引起魚的血清生化指標的變化［13］；Lyons等［14］的“膜脂相變”學說指出低溫下首先傷害的是細胞膜膜相，膜脂從液晶相變為了凝膠相，因此影響了膜的流動性。低溫下生物膜能否保持適當的流動性與生物耐寒性之間有一定的相關性，而生物膜的流動性主要取決于膜脂的脂肪酸組成［15］。膜脂中的不飽和脂肪酸成分在增加膜脂流動性和黏滯性方面起著重要作用，因此，膜脂中的不飽和脂肪酸可能成為物種抗寒能力的一個關鍵機制。

3.2 卵形鯧鲹△6FAD基因全長cDNA的克隆及生物信息學分析

本實驗中獲得的卵形鯧鲹△6FAD基因全長1 908 bp，編碼442個氨基酸。序列結構分析顯示，卵形鯧鲹△6FAD基因具有典型的脂肪酸去飽和酶家族的結構特性，即1個細胞色素b5區、3個組氨酸富集區（HDFGH、HFQHH和QIEHH）和3個跨膜結構域。序列同源性比對分析發現，該酶基因的N端和C端缺乏明顯的同源性，僅中間序列相對保守，由8個保守的組氨酸殘基構成了3個保守的組氨酸富集區。研究認為3個保守的組氨酸富集區是維持酶活性所必需的，且其中HisI和HisII 區與酶-底物結合位點的形成有關，而3個保守的組氨酸富集區和1個Fe2+結合形成催化活性中心［16］；由3個組氨酸富集區與細胞色素b5區域相結合共同在脂肪酸的去飽和電子傳遞鏈中完成電子傳遞的作用。△6FAD基因編碼的氨基酸序列同源性比對分析發現，該氨基酸序列片段與其他魚類的△6FAD基因所編碼的氨基酸序列具有較高的相似度，存在較近的親緣關系，但與斑馬魚、小鼠和人等哺乳動物在進化關系上卻表現出較遠的親緣關系，這與已有的報道結果一致。

3.3 卵形鯧鲹肝臟中△6FAD基因在不同處理下的差異表達

已有研究報道低溫能增加硬骨魚中△6FAD基因的表達量與酶活性［17-19］，但目前有關脂肪酸去飽和酶家族和魚類抗寒性的研究還較少。Ren等［20］研究表明低溫能促進鯉（Common carp）△6FAD-a基因表達量明顯的增加；遮目魚（Chanos chanos）△9FAD的mRNA表達量在低溫脅迫下呈先穩定增加后明顯下降的趨勢，而草魚（Grass carp）在脅迫21 d后才明顯檢測到△9FAD mRNA的表達［21］；鯉魚（Common carp）低溫（6℃）應激下，△9FAD基因的表達水平是常溫條件下（23℃）的13.9倍，表明了△9FAD基因的表達與低溫刺激密切相關［22］。此外，也有研究表明在微生物和高等植物中△9FAD是導致細胞膜膜脂冷適應的主要蛋白，與其冷適應性有關［23］。本研究中該基因在降溫過程表達量的變化和不同低溫下的時序表達模式表明該基因的表達與環境溫度和脅迫時間存在一定相關性。魚類是變溫動物，不同的環境溫度可能造成魚體不同的新陳代謝方式，并出現不同的生理回應。根據本研究中卵形鯧鲹△6FAD基因在不同溫度下的相對表達分析結果推測，魚體的新陳代謝水平隨著水溫的下降而下降，但隨著溫度的繼續下降，魚體開始出現冷應激反應，激發體內一切抗寒機制以應對外界的低溫刺激，最終使得該基因的表達量在整個降溫過程中出現先下降后上升的趨勢；而不同低溫下的時序表達模式則可能是低溫刺激和魚體對環境的自然適應共同作用的結果。

硬骨魚類通過增加不飽和脂肪酸在細胞膜膜脂中的比例來維持低溫下的正常生理活性［24，25］。有研究表明，低溫能增加去飽和酶mRNA的合成與穩定性，進而增加胞內酶的數量，加強膜脂的去飽和作用［26］。因此，在多不飽和脂肪酸合成過程中的脂肪酸去飽和酶基因家族對增加膜脂中的不飽和脂肪酸成分、提高細胞膜在低溫下的流動性都有著重要的作用，其也可能是卵形鯧鲹在抗寒過程中的關鍵基因成員，而有關脂肪酸去飽和酶基因家族和物種耐寒性狀之間的聯系還有待進一步的研究。

4 結論

本研究克隆了卵形鯧鲹△6脂肪酸去飽和酶（△6FAD）基因，全長共1 908 bp，并提交至NCBI基因庫（GenBank登錄號KP295471），低溫脅迫表達實驗表明，該基因在28℃到13℃范圍內表達量隨溫度降低先緩慢降低后又迅速升高，并于13℃時達到峰值；在不同低溫下該基因表達量呈現出不同的時序表達模式，13℃時隨時間增加先降低后升高，最終恢復至原來水平，而16℃和19℃時則表現出一種隨時間逐漸降低的反饋式調節方式。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of Full-length cDNA Sequence of a Low Temperature Resistant Candidate Gene △6FAD in Trachinotus ovatus

Han Hongbo1Wang Zhongliang1，2，3Chen Gang1，2，3Tang Baogui1，2，3Zhang Jiandong1Huang Jiansheng1Zhou Hui1Shi Gang1Pan Chuanhao1
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088：2. Key laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animals，Regular Higher Education Institute of Guangdong Province，Zhanjiang 524088；3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088）

The full-length cDNA of delta 6 fatty acid desaturase（△6FAD）in Trachinotus ovatus was cloned by RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）， and the sequence structure of the gene and protein was determined through bioinformatics analysis. RT-PCR（Real-time PCR）was employed to analyze its expression differences in tissues under different temperatures and the expression patterns in low temperature. Ultimately， the results indicate that full length of cDNA sequence of △6FAD in T. ovatus is 1 908 bp， of which has 3' non-coding region 431 bp， 5' non-coding region 135 bp， and open reading frame 1 329 bp that encodes 442 amino acids. The protein is hydrophobic withoutsignal peptide， and containing abundant protein secondary structure， typical histidine cluster motifs in this family， and cytochrome b5domain. Phylogenetic results from the BLAST protein database reveal that the deduced amino acid sequence of △6FAD of T. ovatus is highly homologous with Lates calcarifer and Rachycentron canadum：lowly homologous with Scophthalmus maximu， Thunnusthynnus and Epinephelus coioides：but little homologous with Danio rerio， Mus musculus and Homo sapiens. RT-PCR results manifest that gene expression of △6FAD is significantly correlated with temperature and stress time in environment， the expression level of the gene at first slowly decreases， then rapidly rises as temperature lowering in the experiment of temperature gradient. However， there is different expression pattern in different low-temperature environment：for example， at 13℃ the gene expression of △6FAD increases to its original level after first decreasing with time：and while at 16℃ and 19℃ it is gradually decreasing with time， i.e.， feedback adjustment way.

Trachinotus ovatus；delta 6 fatty acid desaturase；cDNA cloning；low temperature stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.017

2014-12-25

國家海洋公益性行業科研專項（201205028），廣東省海洋經濟創新發展區域示范專項（GD2012-A01-007，GD2012-A02-003），廣東省教育廳創新計劃專項（2012KJCX0063），廣西科技廳科技計劃（桂科攻1222013-2）

韓洪波，男，碩士研究生，研究方向：魚類種子工程與增養殖；E-mail：476450062@qq.com

陳剛，男，教授，研究方向：魚類種子工程與增養殖；E-mail：cheng@gdou.edu.cn