柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白CHP559基因克隆與真核表達

翟頎 黃兵 董輝 趙其平 朱順海 梁思婷 李莎 楊斯涵 韓紅玉

（中國農業科學院上海獸醫研究所 農業部動物寄生蟲學重點實驗室，上海 200241）

柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白CHP559基因克隆與真核表達

翟頎 黃兵 董輝 趙其平 朱順海 梁思婷 李莎 楊斯涵 韓紅玉

（中國農業科學院上海獸醫研究所 農業部動物寄生蟲學重點實驗室，上海 200241）

為構建柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP559基因的真核表達重組質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，并轉染DF-1細胞進行表達。利用5' RACE技術克隆獲得了柔嫩艾美耳球蟲EtCHP559基因全長cDNA序列，該基因全長為1 746 bp，ORF為104-1 327 bp，編碼407個氨基酸，編碼蛋白的分子量約為46 kD，并利用生物信息學分析該基因編碼蛋白的性質、結構等特征，發現該蛋白含有跨膜結構和信號肽。通過RT-PCR擴增得到含完整開放閱讀框的基因片段，并將其與真核表達載體pcDNA3.1-flag連接，構建了真核重組表達質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，所構建的真核重組表達質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559經過PCR和雙酶切鑒定，可見一條大小約為1 224 bp的目的條帶；重組質粒轉染DF-1細胞后，免疫印跡檢測可見大小約為47 kD的目的蛋白條帶，間接免疫熒光實驗顯示在DF-1細胞中檢測到綠色熒光。這些研究結果表明已成功獲得了EtCHP559的全長序列，并成功構建了EtCHP559的真核重組表達質粒，在真核細胞DF-1中獲得表達，為深入研究EtCHP559的功能奠定了基礎。

柔嫩艾美耳球蟲；CHP559基因；DF-1細胞；真核表達

雞球蟲病在世界范圍內嚴重影響養雞業健康發展，給養雞業造成巨大的經濟損失，該病主要是由幾種艾美耳球蟲寄生于雞腸道引起。而在幾種艾美耳球蟲中，柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）是分布最廣、致病力最強的球蟲之一，常作為研究雞球蟲病的一種模式物種［1］。柔嫩艾美耳球蟲寄生在絨毛上皮和盲腸的黏膜下，引起出血性腸炎，可導致雞死亡，尤其對雛雞危害最大。雞球蟲屬于頂復器門原蟲，頂復器原蟲多數是專性細胞內寄生蟲，都需要入侵宿主細胞，在宿主細胞內生長、發育、繁殖完成整個生活史，其共有的特征是具有由幾種專門分泌蛋白的細胞器構成的頂端復合體，這些細胞器包括微線體、棒狀體和致密顆粒，這些特殊細胞器分泌的蛋白參與了蟲體入侵宿主細胞。在蟲體入侵宿主細胞這一過程中，蟲體黏附宿主細胞后，在蟲體頂端和宿主細胞膜表面形成一個緊密的運動接觸環（Moving Junction，MJ）［2］。對弓形蟲、瘧原蟲等頂復器門原蟲的研究表明，該結構對蟲體成功入侵宿主細胞起至關重要的作用［3］。

研究發現由微線分泌的頂體膜抗原1（Apical membrance protein-1，AMA1）是組成MJ的關鍵分子，該分子與棒狀體分泌的蛋白形成的復合體是MJ的主要成分［4］。由于MJ在頂復器原蟲入侵宿主細胞過程中發揮重要作用，因此與頂膜抗原1相互作用的分子可能參與形成MJ，在蟲體入侵宿主細胞過程中也是必不可少的。為了弄清楚柔嫩艾美耳球蟲AMA1的相互作用分子以及在蟲體入侵過程中發揮的作用，本實驗室前期利用酵母雙雜交技術，以柔嫩艾美耳球蟲頂體膜抗原1（EtAMA1）為誘餌，篩選了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，獲得一些潛在的與EtAMA1相互作用蛋白的ESTs序列［5］。本研究選取其中編號為559的EST序列，運用RACE技術擴增獲得該基因含完整開放閱讀框（ORF）的全長cDNA序列。Blast分析發現該基因編碼的蛋白是柔嫩艾美耳球蟲的保守蛋白（conserved hypothetical protein），因此將該基因命名為EtCHP559。利用RT-PCR擴增其ORF區，構建該基因的真核表達重組質粒，并在真核細胞雞胚成纖維細胞DF-1中進行表達，旨在為進一步研究該基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株 柔嫩艾美耳球蟲純種（CAAS211116-11），由中國農業科學院上海獸醫研究所動物寄生蟲病研究室保存提供。

1.1.2 菌種、細胞和載體 大腸桿菌TOP10購自上海天根生物技術有限公司，真核細胞DF-1由本所丁鏟老師饋贈，pGEM-T-easy vector購自美國Promega公司，真核表達載體pcDNA3.1-flag，由復旦大學上海醫學院崔曉嫻博士饋贈。

1.1.3 主要試劑 DL2000（DNA Maker）、DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、2*Taq PCR MasterMix，購自上海天根生物技術有限公司。Trizol、限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ，購自大連寶生物工程有限公司。T4 DNA連接酶、購自美國Promega公司。GeneRacerTMKit、Lipofectamine 2000，購自美國Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM、opti-MEM，購自美國Gibco公司。近紅外熒光羊抗兔二抗，購自LI-COR公司。RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司。綠色熒光標記山羊抗兔二抗，購自Jackson Immuno Research公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 以純化的柔嫩艾美耳球蟲子孢子為材料按Trizol說明書操作，提取子孢子階段蟲體的Total RNA，經電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和純度，符合要求后用于RACE模板的制備。

1.2.2 引物設計與合成

1.2.2.1 RACE引物 根據編號為559的EST序列，該序列含有3'端poly（A）尾，利用Primer Premier 5.00軟件設計5'端的引物，RACE引物如下，5' Primer：5'-ACCTTCGACCGCTGCCGCTCGTGTTCCT-3'；5'Nest Primer：5'-CCGCTGCCGCTCGTGTTCCTTTTCCC AT-3'。所有引物均由上海賽百盛生物有限公司合成。

1.2.2.2 全長cDNA擴增的引物 將獲得的5'-RACE擴增產物純化回收后與pGEM-Teasy載體連接，轉化TOP10感受態細胞，進行藍白斑篩選，對PCR鑒定的陽性菌落進行測序，利用DNAstar軟件查找5'-RACE PCR擴增產物的序列與原EST序列的重疊部分，將2段序列拼接為全長cDNA序列，根據拼接的全長cDNA序列，設計上下游引物進行RTPCR擴增含完整ORF的cDNA片段，在上下游引物引入酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ，上游引物序列為5'-GGATCCATGCGATCCTCGCAGCGTCGGCGCC-3'，下游引物序列為5'-CTCGAGTCGGCTTCATCTCCCGG CCCTTAC-3'。

1.2.3 EtCHP559基因的克隆與測序

1.2.3.1 EtCHP559全長基因5'端的擴增與測序 首先利用GeneRaceTMKit對提取的柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA依次進行去磷酸化反應、去mRNA帽結構、連接RNA Oligo、反轉錄，然后進行cDNA的5'端擴增。PCR擴增體系含模板1 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1 μL，總體積為25 μL，反應條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，72℃ 1 min，5個循環；94℃ 30 s，70℃ 1 min，5個循環；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃1 min，25個循環；72℃ 10 min。反應結束后，取10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若有特異性條帶，則回收；若無特異性條帶，則繼續進行Nested PCR，反應條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 2 min，25個循環；72℃ 10 min。反應結束后取10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收特異性條帶與pGEM-T-easy vector連接，連接產物轉化TOP10感受態細胞，進行藍白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養后，進行PCR鑒定。經鑒定分子量大小與預期一致的陽性菌落，送上海桑尼生物技術有限公司進行測序。

1.2.3.2 EtCHP559基因含完整ORF的cDNA克隆及測序 利用DNAstar軟件查找5' RACE PCR擴增產物的序列與原EST序列的重疊部分，將兩段序列拼接為全長cDNA序列。根據拼接的全長cDNA序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計兩端引物（引物引入酶切位點BamHⅠ、XhoⅠ），以mRNA反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增。PCR體系含模板2 μL，上下游引物各1 μL，總體積為20 μL。反應條件：94℃ 2 min；94℃ 45 s，57℃ 45 s，72℃ 2 min，35個循環；72℃ 10 min。反應結束后取10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。回收的特異性PCR產物同5' RACE產物一樣連接轉化，經鑒定正確后測序。

1.2.4 EtCHP559基因的生物信息學分析 利用在線軟件ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html）分析獲得的新基因全長cDNA序列，找出編碼框。利用ProtParam工具（http：//cn.expasy.org/ tools/protparam. html）計算編碼蛋白質的理論分子量、等電點、氨基酸組成等。利用TMHMM服務器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析編碼蛋白有無跨膜結構。利用SignalP3.0在線分析軟件（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析編碼蛋白有無信號肽。利用ProtScale分析軟件（www.expasy. org/cgi-bin/protscale.pl）分析編碼蛋白的疏水性。采用 motif_scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_ scan）尋找氨基酸序列的功能結構域，了解目的蛋白可能的功能。利用北京大學生物信息中心WebLab中提供的Antigenic程序（http：//weblab.cbi.pku.edu. cn/program.inputForm.do？program=antigenic）分析其抗原為點。采用NCBI服務器中的CDD（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml）程序對氨基酸序列進行功能保守功能域分析，判斷該蛋白是否具有完整的保守結構域。

1.2.5 真核重組質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559的構建 按上海天根生物技術有限公司提供的質粒提取試劑盒提取重組克隆質粒pGEM-T-EtCHP559，并用BamHⅠ和XhoⅠ對載體pcDNA3.1-flag和重組克隆質粒pGEM-T-EtCHP559分別進行雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，4℃連接過夜，連接產物轉入大腸桿菌TOP10感受態細胞中，涂板過夜培養，次日挑取單克隆菌落于5 mL LB培養基中培養12 h后，進行PCR鑒定；對鑒定為陽性的菌液提取質粒用BamHⅠ和Xho I限制性內切酶進行雙酶切鑒定，陽性克隆送至上海桑尼生物有限公司進行測序。

1.2.6 DF-1細胞的復蘇培養及質粒轉染 質粒轉染細胞前的一周復蘇DF-1細胞，將細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中融化后，將細胞轉入15 mL無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養液懸浮細胞，轉入細胞培養瓶中，于37℃，5%CO2濃度的培養箱中培養，每2 d更換一次培養液，傳2-3代，至細胞生長狀態良好。轉染前，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液37℃消化2 min，收集DF-1細胞進行計數，以每孔60萬細胞鋪被六孔板2塊，37℃、5% CO2培養過夜，按照LipofectamineTM2000脂質體轉染操作步驟分別將空質粒pcDNA3.1-flag和重組質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559轉染進DF-1細胞，置于37℃、5% CO2培養6 h，更換為含有2%胎牛血清的DMEM培養基。培養48 h后，收集一塊六孔板的DF-1細胞，提取蛋白后進行Western blot檢測，另一塊六孔板的DF-1細胞進行間接免疫熒光檢測。

1.2.7 間接免疫熒光（IFA）鑒定蛋白在真核細胞的表達 為了檢測真核表達重組質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559在DF-1細胞中的表達情況，取培養48 h的DF-1細胞，每孔用2%多聚甲醛2 mL固定15 min，PBS洗滌3次，加入1% Triton X-100 2 mL，室溫下固定15 min，PBS洗滌3次，加入2% BSA/PBS 2 mL，4℃封閉過夜，PBS洗滌3次，加入抗rEtCHP559蛋白兔源血清（1∶100倍稀釋），37℃作用1 h；PBS洗滌3次，加入1∶400稀釋的綠色熒光標記的山羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBS洗滌3次后在熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.8 Western blot 鑒定真核表達重組質粒pcDNA-3.1-flag-EtCHP559在DF-1細胞的表達情況 收集培養48 h的DF-1細胞，加入RIPA裂解液，4℃，12 000 r/min離心2 min，取上清進行SDS-PAGE電泳。全濕法電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；PBST洗滌3次，加入1∶100稀釋的抗rEtCHP559蛋白兔血清，37℃孵育2 h；PBST洗滌3次，加入1∶15 000稀釋的近紅外熒光羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，再經PBS洗滌5次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統進行拍照。

2 結果

2.1 CHP559基因的生物信息學分析

根據Et CHP559基因的EST序列，利用5' RACE技術擴增獲得了含一個完整開放閱讀框（ORF：104-1 327 bp）的全長cDNA序列，該序列全長1 746 bp，包括5'端的UTR序列，長103 bp，含有CAAT 序列，沒有TATA 序列；3'端UTR序列，長419 bp，含Ploy（A）尾，沒有典型的AATAAA序列，ORF長1 224 bp，編碼407個氨基酸（圖1）；預測分子量為46.04 kD，等電點為9.12，在溶液中的不穩定指數為40.44，高于域值40，在溶液中性質不穩定，脂肪族指數81.45，總平均親水性-0.223；信號肽、疏水性和跨膜結構的分析表明，該基因編碼的蛋白有信號肽，信號肽的概率為0.998，其斷裂位點位于第25個aa和第26個aa之間，該蛋白具有跨膜結構，其中第1-8個aa為蛋白的胞內區域，第9-31個aa為該蛋白的跨膜區域，第32-407個aa為蛋白的胞外區域。疏水性分析顯示最大值為2.611，最小值為-3.511。抗原位點分析發現，該蛋白可能有15個抗原位點，推測具有良好的免疫原性。經結構功能域分析發現EtCHP559基因編碼的蛋白可能含有2個N端糖基化位點，6個N端酰化位點，5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，6個蛋白激酶C磷酸化位點和1個酪氨酸激酶磷酸化位點。利用NCBI的CDD程序對該基因編碼的氨基酸的保守結構域進行搜索，結果顯示該基因編碼的氨基酸沒有保守結構域。與柔嫩艾美耳球蟲基因組數據庫（http：//www. genedb.org/Homepage/Etenella）比較發現，該基因的ORF與保守的假象蛋白（hypothetical protein，conserved，ETH_00024035）100%同源，因此將該基因命名為Et CHP559。

2.2 EtCHP559基因的克隆

利用DNAstar軟件查找5' RACE PCR擴增產物的序列與原EST序列的重疊部分，將兩段序列拼接為全長cDNA序列。根據拼接的全長cDNA序列，利用合成的引物以柔嫩艾美耳球蟲子孢子的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增含ORF的cDNA片段，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，在1 224 bp處有特異性的單一條帶，與預期大小一致（圖2）；其與pGEM-Teasy載體連接，轉化感受態細胞TOP10，菌液PCR、雙酶切、測序鑒定正確，表明成功擴增獲得EtCHP559基因含完整ORF的cDNA片段。

2.3 重組質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559的構建

分別用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對鑒定正確的重組克隆質粒pGEM-T-EtCHP559和空載體pcDNA3.1-flag進行雙酶切，純化后進行連接，構建了真核重組表達質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559。對該重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定，結果（圖3）均為陽性，測序結果顯示該基因正確插入，表明真核重組表達質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559構建成功。

圖1 EtCHP559 cDNA的核苷酸序列及其氨基酸序列

圖2 EtCHP559的PCR擴增結果

圖3 重組質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559的PCR與雙酶切鑒定結果

2.4 間接免疫熒光檢測pcDNA3.1-flag-EtCHP559在DF-1細胞中的表達情況

利用抗rEtCHP559蛋白兔血清，對重組質粒轉染48 h后的DF-1細胞進行了免疫熒光檢測。結果（圖4）顯示，在轉染pcDNA3.1-flag-EtCHP559重組質粒的DF-1細胞中，綠色熒光通道可以看到特異的綠色熒光；而在轉染pcDNA3.1-flag空載體和正常的DF-1細胞中，無任何可見熒光。結果表明pcDNA3.1-flag-EtCHP559重組質粒能在DF-1細胞中成功轉染和表達。

2.5 Western blot分析pcDNA3.1-flag-EtCHP559在DF-1細胞中的表達

Western blot結 果（ 圖5） 顯 示， 轉 染 了pcDNA3.1-flag-EtCHP559重組質粒的DF-1細胞中可檢測到大小約為47 kD的目的條帶，而轉染空載體的DF-1細胞中卻沒有相應的條帶出現，表明pcDNA3.1-flag-EtCHP559重組質粒成功轉染了DF-1細胞并在DF-1細胞中成功表達。

圖4 重組質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559表達產物的間接免疫熒光檢測

圖5 EtCHP559重組蛋白Western blot分析結果

3 討論

雖然頂復器門原蟲入侵的宿主細胞不同，包括紅細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和消化道細胞等，但它們都有一個共同的高度保守的入侵機制［6］。 在這一過程中，運動接觸環（MJ）的形成至關重要，此特殊結構作為支架推動蟲體進入帶蟲空泡［7，8］，對頂復器門原蟲弓形蟲、瘧原蟲等研究表明，AMA1通過與棒狀體頸部蛋白（RONs）相互作用形成的復合體是構成MJ結構的主要成分，參與入侵過程［3，9，10］。但到目前為止，對雞球蟲入侵宿主細胞時MJ的分子組成研究還未見報道，只是對微線分泌的頂膜抗原AMA1進行了一些研究。Jiang等［11］首次克隆到了柔嫩艾美耳球蟲的AMA1基因全長，并在體外用多克隆抗體抑制EtAMA1蛋白后觀察到子孢子細胞入侵率下降了70%，表明AMA1蛋白參與了子孢子入侵宿主細胞的過程。為了進一步研究柔嫩艾美耳球蟲AMA1的功能，薛璞［5］利用酵母雙雜交的方法從柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母cDNA文庫中篩選到了與EtAMA1相互作用的14個蛋白的ESTs序列。已有研究表明其中2個ESTs（EtZB1-A08與EtMIC2）參與了球蟲入侵宿主細胞的過程，本研究擴增獲得的EtCHP559基因，是根據其中的一個EST序列利用RACE技術擴增獲得的，因此該蛋白可能與EtAMA1相互作用，參與了子孢子入侵宿主細胞的過程。

pcDNA3.1載體是一種能夠在哺乳動物細胞或宿主內高水平穩定或瞬時表達的真核表達載體，其含有巨細胞病毒早期啟動子CMV、BGH、polyA加尾信號和SV40早期啟動子，全長5 400 bp，還帶有Neo抗性基因便于轉染細胞的篩選，常用來融合表達多種外源基因蛋白以及核酸疫苗的研究［12］。本研究選用的真核表達載體pcDNA3.1-Flag是由pcDNA3.1（+）改造而獲得的，該載體在pcDNA3.1（+）多克隆位點的N端添加了flag標簽，并且在標簽序列之前插入了kozak序列。研究發現真核生物蛋白表達調控與蛋白起始密碼子AUG周圍的堿基種類有很大關系，當一個基因起始密碼子AUG之前的堿基為kozak序列GCCACC時，該蛋白表達量會有相應提高［13］。 Flag是序列為DYKDDDDK蛋白標簽，由親水性的8個氨基酸殘基組成，序列簡短，對目標蛋白的結構和生物活性影響小，容易構建成標簽蛋白融合N端或C端，可用Anti-flag抗體檢測［14］。Flag標簽還可設計用于免疫親和層析，在非變性條件下洗脫flag標簽融合蛋白［15］。因此，本研究利用該載體成功構建了真核表達重組質粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，并在真核細胞DF-1中成功表達，表達的蛋白帶有flag標簽，在后續實驗中可以用來純化蛋白，也可以通過免疫沉淀來研究蛋白質之間的互作等。

近年來，為了對雞球蟲功能基因和核酸疫苗的研究，許多研究者將雞球蟲的功能基因連接到真核表達載體，成功構建了真核重組質粒，并在不同的真核表達細胞中獲得表達。如王艷歌等［16］構建了柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶的真核表達質粒，并在293T細胞中成功表達，劉穎麗等［17］在Hela細胞中成功表達了柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白2（Et-MIC2），杜愛芳等［18］以減毒沙門氏菌為載體，在Vero細胞中表達了柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白4（Et-MIC4）。但這些細胞均為哺乳動物細胞，目前還未見利用球蟲宿主雞細胞來表達雞球蟲蛋白的報道。本研究嘗試選擇了雞胚成纖維細胞（chicken embryo fibroblast cell line，DF-1）來表達EtCHP559，DF-1細胞來源于East Lansing Line（ELL-0），是一種可無限傳代的細胞系，目前，在病毒研究領域應用廣泛，如用于病毒疫苗的生產和重組病毒或蛋白的表達［19］。黃杰等［20］在DF-1細胞中成功表達了鴨瘟病毒的UL7蛋白，田志革等［21］將新城疫病毒V基因片段與pcDNA3.1載體連接，并在DF-1細胞中獲得了表達。近來，DF-1細胞也被用于雞球蟲體外培養的研究，姜連連等［22］首次將DF-1細胞應用于雞球蟲研究領域，將柔嫩艾美耳球蟲子孢子接入DF-1細胞后，子孢子能成功入侵DF-1細胞，并在細胞內發育至裂殖子，因此該細胞可用于雞球蟲體外研究。本研究在DF-1細胞中首次成功表達了柔嫩艾美耳球蟲CHP559蛋白，由于DF-1細胞是柔嫩艾美耳球蟲天然宿主雞的本體細胞，因此以其為平臺更有利于研究球蟲基因的功能以及與宿主的相互作用關系。

4 結論

本研究利用RACE技術成功獲得了柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP559基因，并構建了其真核重組表達質粒pcDNA3.1-Flag-EtCHP559，成功轉染到DF-1細胞中。通過間接免疫熒光和免疫印跡的方法證實該基因在真核細胞DF-1中成功表達，這些結果將為進一步研究該蛋白的生物學功能和球蟲核酸疫苗的研制奠定了基礎。

［1］Williams RB. A compartmentalised model for the estimation of the cost of coccidiosis to the world’s chicken production industry［J］. International Journal for Parasitology， 1999， 29（8）：1209-1229.

［2］Aikawa M， Miller LH， Johnson J， et al. Erythrocyte entry by malarial parasites. A moving junction between erythrocyte and parasite［J］. J Cell Biol， 1978， 77（1）：72-82.

［3］Lamarque M， Besteiro S， Papoin J， et al. The RON2-AMA1 interaction is a critical step in moving junction-dependent invasion by apicomplexan parasites［J］. PLoS Pathogens， 2011， 7（2）：e1001276.

［4］Alexander D， Mital J， Ward G， et al. Identification of the moving junction complex of the apicomplexan parasite， Toxoplasma gondii：a collaboration between distinct secretory organelles［J］. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene， 2005， 73（6， Suppl. S）：363.

［5］薛璞. 柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的構建及EtAMA1相互作用蛋白的初步篩選［D］. 上海：上海師范大學，2013.

［6］Besteiro SSBU， Dubremetz J， Lebrun M. The moving junction of apicomplexan parasites：a key structure for invasion［J］. Cellular Microbiology， 2011， 13（6）：797-805.

［7］Proellocks NI， Coppel RL， Waller KL. Dissecting the apicomplexan rhoptry neck proteins［J］. Trends in Parasitology， 2010， 26（6）：297-304.

［8］Opitz C， Soldati D. ‘The glideosome’：A dynamic complex powering gliding motion and host cell invasion by Toxoplasma gondii［J］. Molecular Microbiology， 2002， 45（3）：597-604.

［9］Tyler JS， Treeck M， Boothroyd JCJB. Focus on the ringleader：the role of AMA1 in apicomplexan invasion and replication［J］. Trends in Parasitology， 2011， 27（9）：410-420.

［10］Besteiro S， Michelin A， Poncet J， et al. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion［J］. PLoS Pathogens，2009， 5（2）：e1000309.

［11］Jiang L， Lin J， Han H， et al. Identification and characterization of Eimeria tenella apical membrane antigen-1（AMA1）［J］. PLoS One， 2012， 7（7）：e41115.

［12］胡曉靜， 劉棋， 付薇， 等. 鵝γ-干擾素基因真核表達載體的構建及在幼倉鼠腎細胞中的表達［J］. 中國獸醫科學， 2011（5）：526-529.

［13］Petty AP， Dick CL， Lindsey JS. Translation of an atypical human cDNA requires fidelity of apurine-pyrimidine repeat region and recoding［J］. Gene， 2008， 414（1-2）：49-59.

［14］Hopp TP， Prickett KS， Price VL， et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification［J］. Biotechnology， 1988， 6（10）：1204-1210.

［15］Einhauer A， Jungbauer A. The FLAGTMpeptide， a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins［J］. Journal of Biochemical and Biophysical Methods， 2001， 49（1-3）：455-465.

［16］王艷歌， 董輝， 韓紅玉， 等. 柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶真核表達質粒的構建與鑒定［J］. 中國動物傳染病學報， 2014（2）：65-71.

［17］劉穎麗， 李建華， 鄭君， 等. 雞柔嫩艾美耳球蟲EtMIC-2基因真核表達載體的構建及其在Hela細胞中的表達［J］. 中國獸醫學報， 2011（8）：1142-1146.

［18］杜愛芳， 王素華， 胡松華. 雞柔嫩艾美耳球蟲5401基因真核表達載體的構建及在Vero細胞中的表達［C］. 桂林：中國畜牧獸醫學會家畜寄生蟲學分會， 2004.

［19］Himly M， Foster DN， Bottoli I， et al. The DF-1 chicken fibroblast cell line：Transformation induced by diverse oncogenes and cell death resulting from infection by avian leukosis viruses［J］. Virology， 1998， 248（2）：295-304.

［20］黃杰， 程安春， 汪銘書， 等. 鴨瘟病毒UL7基因真核表達質粒的構建及其瞬時表達［J］. 中國獸醫科學， 2013（8）：861-865.

［21］田志革， 柴洪亮， 李鳳勇， 等. 野鴨源新城疫病毒V蛋白基因在DF-1細胞中的表達及V蛋白的亞細胞定位［J］. 中國獸醫科學， 2014（5）：476-479.

［22］姜連連， 林矯矯， 韓紅玉， 等. 柔嫩艾美耳球蟲DF-1細胞培養體系的建立及應用［J］. 中國獸醫科學， 2011（6）：551-556.

（責任編輯 李楠）

Gene Cloning and Eukaryotic Expression of a Conserved Hypothetical Protein Gene CHP559 in Eimeria tenella

Zhai Qi Huang Bing Dong Hui Zhao Qiping Zhu Shunhai Liang Siting Li Sha Yang Sihan Han Hongyu
（Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture，Shanghai Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 200241）

The objective of this study is to construct eukaryotic recombinant expression plasmids of a conserved hypothetical protein gene（EtCHP559）of Eimeria tenella， and study the expression of EtCHP559 gene in transfected DF-1 cells. The full-length cDNA of EtCHP559 was cloned using 5'RACE approaches. Bioinformatics analysis revealed that the gene contained 1 746 bp， of which the ORF was 1 224 bp（position 104 - 1 327 bp）encoding 407 amino acids with molecular weight of 46 kD. The deduced amino acid sequence of the protein had a transmembrane region and signal peptide. The cDNA fragment consisting of complete ORF was amplified by RT-PCR， and ligated to the eukaryotic expression vector pcDNA3. 1-flag. The recombinant plasmid pcDNA3. 1-flag-EtCHP559 was identified successfully by PCR and restriction enzyme digestion， and the target band of approximate 1 224 bp was observed. Subsequently， the recombinant plasmid was transfected into DF-1 cells， Western blot recognized target protein of around 47 kD， and immunofluorescence also showed that green fluorescence in transfected DF-1 cells was observed. These results indicated that the full-length sequence of EtCHP559 was obtained， and the recombinant plasmid of EtCHP559 was successfully constructed and expressed in eukaryotic cells， which laid a foundation for the future research on functions of EtCHP559.

Eimeria tenella；CHP559 gene；DF-1 cell；eukaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.024

2014-10-24

國家自然科學基金項目（31201699），中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（2014JB03）

翟頎，男，碩士研究生，研究方向：寄生蟲分子生物學；E-mail：zhaixiaoqi@126.com

韓紅玉，女，副研究員，研究方向：寄生蟲分子生物學；E-mail：hhysh@shvri.ac.cn