視黃酸刺激RARE調控熒光素酶報告基因表達系統的構建與應用

袁源 陳亞瓊

（中國科學院上海生命科學研究院營養科學研究所，上海 200031）

視黃酸刺激RARE調控熒光素酶報告基因表達系統的構建與應用

袁源 陳亞瓊

（中國科學院上海生命科學研究院營養科學研究所，上海 200031）

類維生素A，通過視黃酸（retinoic acid，RA）代謝旺盛組織的靶基因調控，與生物節律通路相互作用，在代謝性疾病發展過程中發揮著重要作用。在293T及小鼠肝原代細胞中，構建視黃酸反應元件（RARE）調控的熒光素酶報告基因表達系統，為研究類維生素A與節律和代謝研究中靶基因上游調控信號分子提供可能。用定點突變PCR方法在pGL3-Basic載體中插入RARE片段，檢測報告基因表達及RARE對視黃酸響應的半數有效濃度（EC50），初步篩選可能調控RARE的靶基因，通過酶切連接將熒光素酶報告基因Luciferase和啟動子RARE片段構入穿梭載體pShuttle，轉入感受態細胞BJ518獲得重組腺病毒載體Ad-Basic-RARE-Luc，轉染MGH細胞并進行擴增，在小鼠肝原代細胞檢測腺病毒活性。結果顯示，構建的RARE調控的熒光素酶報告基因表達載體在293T細胞可被RA刺激，RARβ促進RA刺激RARE表達，而CRY1抑制RARE-Luc對RA的響應，并成功構建了在小鼠肝原代細胞響應RA刺激的Adeasy-Basic-RARE-Luc腺病毒載體。

視黃酸；RARE；熒光素酶報告基因；節律；代謝

類維生素A，包括視黃醇及其衍生物［1］，調控著細胞的分化、增殖與凋亡［2］。近年來研究表明，在代謝性疾病發展過程中，類維生素A發揮著重要作用。類維生素A通過調控靶基因表達進而調節哺乳動物的糖脂代謝，被認為是糖尿病，肥胖等重要的治療靶點。報道稱RA過量會引起小鼠體重減輕，白色脂肪減少［3，4］，改善小鼠胰島素敏感性［4］。有研究表明維生素A還影響著生物鐘和節律，尤其是視黃酸（retinoid acid，RA）信號通路與生物鐘信號通路相互調節［5］。肝臟是維生素A主要的吸收代謝場所，同時也高表達節律基因參與機體生物鐘調節，此外在中樞神經系統發現高表達RARα，其轉錄mRNA水平呈周期性變化，有力證明了RA影響中樞生物鐘［6］。越來越多的證據表明生物節律紊亂和糖尿病肥胖等代謝性疾病有著重要關系，如CRY1節律基因過表達可以降低血糖以及改善db糖尿病老鼠胰島素敏感性［7］。RA作為維生素A中最主要的具有轉錄活性的組分，通過與視黃酸受體（Retinoic acid receptors，RARs）和類視黃醇X受體（Retinoid X receptors，RXRs）結合［8］，調控超過500種基因的表達。眾多功能各異的維生素A靶基因的啟動子序列中均含有兩個重復的PuG（G/T）TCA的位置［9］，即視黃酸反應原件（RARE）。RARs和RXRs形成的異源二聚體可以結合到RARE上，調控靶蛋白的轉錄。類維生素A對代謝的調控主要是通過RA代謝旺盛組織的基因調控實現的，但其具體的的分子機制還不清楚。因此研究肝臟類維生素A對節律調控以及代謝的信號通路具有深遠意義，而RA對其靶基因調控的分子機制是一個重要方向，RARE可能可以作為研究類維生素A與靶基因調控的重要位點。本研究通過構建RARE元件調控的熒光素酶報告基因表達系統，更直接高效地篩選出影響RARELuc對RA響應敏感性的基因，并構建在小鼠肝原代細胞表達的RARE-Luc腺病毒表達載體，更好地模擬小鼠體內信號通路，旨在為進一步探尋RA調控代謝靶基因的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pGL3-Basic熒光素酶報告基因質粒及pShuttle穿梭載體質粒購于Promega，大腸桿菌XL-1 Blue及BJ 5183為本實驗室保存，人胚胎腎細胞株293T及MGH細胞由本實驗室保存，C57正常小鼠購自南京模式動物研究所。Kpn I-HF、Sal I-HF及T4連接酶購自NEB公司，Cutsmart酶切緩沖液（BioLabs）、細胞培養液DMEM（GIBCO）、胎牛血清（Hyclone）、胰蛋白酶Trypsin、M199 和HBSS緩沖液購自Invitrogen，HEPES、臺盼藍染液和膠原酶購自Sigma，DNA ladder marker V、6×loading buffer 及2×Taq Master Mix購自萊楓DNA 膠回收試劑盒（Bio Dev-Tech），Prime Star HS DNA Polymerase和 5×PS buffer 來自TaKaRa。熒光素酶報告基因檢測系統（Thermo Scientific），Master Flex蠕動泵（Cole-Parmer Instrument Company）。

1.2 方法

1.2.1 定點突變PCR 根據GenBank提供的RARE序列，參照pGL3-Basic-Luc序列，根據引物設計原則，用Primer5軟件設計一段完全互補的引物序列。所用引物由上海桑尼生物科技公司合成。正向引物：TAT CGA TAG GTA CCG AGC TCG CGA GTT CAG CAA GAG TTC AGC CGG CGA GTT CAG CAA GAG TTC AGC CGG GGC TCG AGA TCT GCG ATC，反向引物：AGA TCG CAG ATC TCG AGC CCC GGC TGA ACT CTT GCT GAA CTC GCC GGC TGA ACT CTT GCT GAA CTC GCG AGC TCG GTA CCT ATC GAT。

取10 ng pGL3-Basic質粒，用PrimerStar試劑盒進行20 μL體系PCR反應：93℃ 3 min，93℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 4 min，22個循環，72℃ 5 min，最后4℃保存。取PCR反應前后樣品通過1%瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定長度，分別在4 600 bp和4 800 bp左右。將PCR產物用Dpn I在37℃ 酶切2 h，將酶切后產物轉化涂板：將XL-1 Blue感受態從-80℃取出，放置冰上10 min，加入 Dpn I酶切產物再在冰上靜置15 min，在42℃水浴鍋熱擊1 min，然后放回冰上10 min，取300 μL 含Kam的LB液體培養基，在37℃ 搖床培養30 min，涂含有Kam抗生素LB平板，37℃培養過夜，挑單克隆測序。

1.2.2 pGL3-Basic-RARE-Luc質粒轉染和報告基因檢測 將培養的293T細胞用含有10%FBS的DMEM培養基接種于24孔細胞培養板，37℃培養箱培養約18 h后，細胞長到80%左右，用脂質體瞬轉細胞的方法，通過PEI介導，每個孔共轉染50 ng pGL3-Basic-RARE-Luc 和25 ng 內參質粒pRSV-Renilla，6 h后換液加入RA（1 μmol/L），18 h后去掉培養基，用熒光素酶報告基因裂解緩沖液裂解細胞，靜置10 min后，取上清分別檢測Luc和Renilla報告基因表達：50 μL 裂解液加50 μL報告基因顯色液。用Renilla報告基因的表達量對Luc進行校正，以Luc/Renilla比值作為最終的報告基因活性。

1.2.3 重組穿梭質粒pShuttle-Basic-RARE-Luc的構建 取測序正確的pGL3-Basic-RARE-Luc和pShuttle質粒，用Kpn I-HF和Sal I-HF進行雙酶切，40 μL反應體系如下：pGL3-Basic-2RARE-Luc和pShuttle質粒各500 ng，用ddH2O補平至33.2 μL，Cutsmart酶切緩沖液4 μL，BSA 0.4 μL，Kpn I-HF和Sal I-HF各1.2 μL。37℃培養箱酶切5 h，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠進行鑒定，根據預估目的片段大小，切膠并用DNA膠回收試劑盒進行回收純化。測定回收DNA濃度，按照如下體系進行連接：10 ng pShuttle酶切產物，2 μL T4 ligasion buffer，1 μL T4連接酶，實驗組加入pGL3-Basic-RARE-Luc酶切產物補平至20 μL，對照組則加入等體積的ddH2O至20 μL室溫連接過夜。連接產物取10 μL用于轉化XL-1 Blue感受態（轉化步驟同前），涂含有Kam抗生素LB平板，37℃培養過夜，挑單克隆送上海博尚測序公司測序。

1.2.4 重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc的構建 取測序正確pShuttle-Basic-RARE-Luc質粒10 μg用Pme1酶切：cutsmart buffer 44 μL，BSA 0.4 μL，Pme I μL。37℃恒溫培養箱酶切5 h。酶切產物用DNA膠回收純化試劑盒進行純化，用50 μL ddH2O洗脫，取一半用于轉化BJ5183感受態（同XL-1 Blue轉化步驟，37℃搖床活化30 min，涂Kam LB 平板，37℃恒溫培養箱培養過夜，挑取單克隆）。用質粒小抽試劑盒提取質粒，用50 μL ddH2O洗脫，取30 μL用PacI酶切鑒定：30 μL洗脫的質粒，buffer I 4 μL，BSA 0.4 μL，Pac I 0.7 μL ddH2O補平到40 μL。37℃酶切5 h后，用0.8%瓊脂糖凝膠鑒定，如果酶切產物有30 kb左右和4.5 kb（或3 kb）兩條片段，則認為Adeasy-Basic-RARE-Luc重組質粒構建正確，可轉XL-1 Blue，搖菌并中抽質粒，可用于包裝腺病毒。

1.2.5 腺病毒包裝與擴增 取60 μg重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc在30 μL Buffer I，15 μL BSA和15 μL Pac I體系酶切4 h，酶切產物用DNA回收純化試劑盒純化，最后用50 μL ddH2O洗脫。在長到80%左右的10 cm MGH培養皿中加入純化過的酶切產物，37℃細胞培養箱培養1-2周，等細胞幾乎全部漂起，收培養基得到第一代包裝成功的腺病毒。選取活力較好，可在傳代后3 d內長滿的MGH細胞，在MGH 長滿的15 cm 細胞培養皿中加入包裝成功的第一代腺病毒。等待細胞全部漂起后，收取培養基，加入到6個長滿的MGH 15 cm細胞培養皿中，等待細胞全部漂起，收獲的培養基再感染30個長滿的MGH 15 cm細胞培養皿，收獲全部漂起的細胞，6 000 r/min 離心8 min，離心下來的細胞沉淀用10 mL PBS重懸，補足到20 mL，在液氮中凍融3次，每次10 min，儲存在-80℃。把上清收集到一個新的廣口瓶，按照242.3 g/L加入硫酸銨，在室溫攪拌2 h，6 000 r/min離心6 min，去掉上清，沉淀用10 mL PBS重懸，補足到20 mL，儲存在-80℃。

1.2.6 原代肝細胞分離與重組腺病毒活力檢測 準備肝原代分離所需的緩沖液：沖洗緩沖液（HBSS+50 mmol/L HEPES+5 mmol/L EGTA）， 消 化 緩 沖 液（HBSS+50 mmol/L HEPES+5 mmol/L EGTA+5 mmol/L CaCl2+30 mmol/L膠原酶），預熱到37℃。選取正常C57小鼠，稱重，按照6 μL/g體重腹腔注射10%水合氯醛。等老鼠麻醉后，打開老鼠腹腔，將針管刺入肝門靜脈，打開蠕動泵，灌流沖洗緩沖液把血沖干凈，換消化緩沖液灌流。關掉蠕動泵，把整個肝臟組織剪下來，放入沖洗緩沖液中，在超凈臺用鑷子和剪刀把細胞刮下來，用250 μmol/L尼龍濾網進行過濾，濾液600 r/min 離心2 min。去掉上清，加入無血清的M199培養基重懸混勻，600 r/min 離心3 min，去掉上清，用30 mL含有10% FBS的M199培養基重懸混勻，取100 μL重懸液與100 μL臺盼藍染液混勻涂板計數，按照每個孔20萬細胞種在已經包被好的24孔板。37℃培養4 h后，去掉培養基，換成無血清M199培養基，在實驗組加入重組腺病毒，對照組加入GFP腺病毒，培養過夜。第2天換液加入RA 1 μmol/L，2 h后去掉上清，裂解細胞，檢測熒光素酶報告基因表達。

2 結果

2.1 pGL3-Basic-RARE-Luc的活性鑒定

將測序正確的定點PCR突變產物pGL3-Basic-RARE-Luc在293T細胞中瞬轉，以RSV-Renillla作為對照，6 h后加入RA，18 h后檢測報告基因的表達，結果（圖1）顯示，用Renilla檢測值校正后，pGL3-Basic-RARE-Luc的報告基因活性明顯高于空白對照，相對活性約為1.4（Luc/Renilla），具有統計學意義，說明pGL3-Basic-RARE-Luc能在293T細胞中正常表達。加入RA后，表達活性增強4倍左右，RA能促進pGL3-Basic-RARE-Luc報告基因的表達，差異均具有統計學意義。

圖1 pGL3-Basic-RARE-Luc在293T中報告基因活性檢測及對RA的響應

2.2 pGL3-Basic-RARE-Luc對RA的響應受RARβ和CRY1調控

在293T細胞中瞬轉pGL3-Basic-RARE-Luc，同時過表達RARβ，以RSV-Renillla作為對照，6 h后加入RA，從10 μmol/L依次10倍稀釋，設置8個濃度梯度，18 h后檢測報告基因的表達，繪制曲線求得EC50。結果（圖2-A）顯示RARβ過表達后，pGL3-Basic-RARE-Luc對RA響應的EC50值從53 μmol/L降低到93 nmol/L，差異具有統計學意義，說明RARβ增強RARE-Luc對RA刺激響應的敏感性。以RARβ作為陽性對照，β-Gal作為空白對照，在293T細胞中過表達HA-CRY1，檢測RA刺激（1 μmol/L）下RARE-Luc報告基因表達，結果（圖2-B）顯示與對照組比，RA顯著促進RARE-Luc的表達，約為對照的2-3倍；與β-Gal空白對照相比，RARβ增強RARE-Luc對RA刺激的響應，而HA-CRY1下調RA促進的RARE-Luc的表達，差異均具有統計學意義。

圖2 RARβ和CRY1調控 RARE-Luc在293T細胞對RA的響應

2.3 重組穿梭質粒pShuttle-Basic-RARE-Luc的構建

對載體pShuttle和構建正確的pGL3-Basic-RARE-Luc用Kpn I-HF和Sal I-HF進行雙酶切，以酶切前質粒作為對照，用瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行檢測。載體pShuttle雙酶切產物瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖3），與酶切前對比，在6 000 bp左右有一條清晰的帶，與理論值相符，pGL3-Basic-RARE-Luc酶切前條帶在靠近5 500 bp處，雙酶切后產物顯示有兩條清晰的條帶，分別在3 500 bp和2 500 bp，2 500 bp和1 500 bp之間，RARE-Luc酶切片段理論值應該在1 700 bp左右，即靠下面的一條（1 500 bp和2 500 bp之間）。切下來正確的片段用于膠回收以及后續的連接反應，構建重組穿梭質粒pShuttle-Basic-RARE-Luc。

圖3 重組穿梭質粒pShuttle-Basic-2RARE-Luc構建中載體和插入片段雙酶切圖

2.4 重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc的酶切鑒定

重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc陽性克隆鑒定。首先將測序鑒定正確的pShuttle-Basic-RARE-Luc用Pme I酶切后轉化BJ5183感受態，涂含Kam的平板，挑取陽性克隆搖菌培養，小抽提取質粒，用Pac I酶切后的產物在1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。結果（圖4）顯示有兩條清晰條帶，和Adeasy空載體酶切產物比較，分別在大于5 500 bp，以及3 500 bp和2 500 bp之間，和理論值30 kb和3 kb符合，酶切鑒定結果為陽性。

圖4 重組腺病毒Adeasy-Basic-RARE-Luc用Pac I酶切鑒定圖

2.5 RA促進腺病毒Adeasy-Basic-RARE-Luc在肝原代細胞表達

在肝原代細胞中感染Adeasy-Basic-RARE-Luc重組腺病毒顆粒，饑餓過夜后加入RA刺激，1 h后檢測熒光素酶報告基因表達活性，結果（圖5）顯示，加入腺病毒感染后，肝原代細胞中報告基因信號明顯被啟動，Luciferase報告基因信號強度約為空白對照的3倍左右，加入RA刺激，可以增強報告基因的表達，信號強度為刺激前的2倍左右，差異均具有顯著統計學差異。

圖5 重組腺病毒在肝原代細胞中表達活性檢測及對RA的響應

3 討論

類維生素A（以下簡稱維生素A）既指食物中存在的天然物質，又包含人工合成的化學藥劑。研究表明 VA缺乏飲食的大鼠在食物攝入量差異不大的情況下，丙糖肝糖異生能力下降，肝糖原消耗增加［10］，飲食攝入的維生素A和胡蘿卜素與NAFLD的發展負相關［11-13］，目前關于維生素A缺乏對肝臟脂肪代謝的影響還沒有定論。McGrane等［14］發現在維生素A缺失飲食的小鼠，其肝臟線粒體和脂肪酸氧化相關基因表達量下降，并發展為脂肪肝。但Oliveros的研究發現在維生素A缺失引起大鼠肝臟脂肪酸合成減少，線粒體脂肪酸氧化增強［15］。由于在動物模型上維生素A缺乏研究結果不一致，在基因水平上維生素A相關蛋白研究成為一個新的熱門方向，有研究表明通過肝細胞中表達負顯性RARα的轉基因小鼠能抑制肝臟中維生素A信號通路［16］，以及利用RAR信號通路的激動劑，通過小鼠腹腔注射atRA建立維生素A過量模型，脂肪酸合成及肝臟甘油三酯量均下降［17］。目前關于維生素A信號通路還沒有深入報道，由于小鼠模型的復雜性及其耗費大量的時間和資源，如果能在已有研究提示的基礎上，建立一個體外的研究模型，利用熒光素酶報告基因系統的靈敏性，可以更直觀深入的研究維生素A相關基因作用。類維生素A中最具有轉錄活性的視黃酸（RA），通過與RARs/RXRs異源二聚體及RARE結合，調控靶基因的轉錄。RARE序列位于眾多類維生素A靶基因的啟動子中，含有兩個重復的PuG（G/T）TCA的位置。類維生素A主要通過RA代謝旺盛組織的基因調控，在肥胖和糖尿病發展過程中發揮重要作用，成為一個重要的治療靶點。因此以RARE作為類維生素A調節代謝與節律信號通路的關鍵位點，來尋找可能的調控基因，對于研究RA及其信號通路調控的具體分子機制，深入探討維生素A在肝臟節律與代謝調節中的作用，具有重要的臨床意義。本研究采用定點突變PCR的方法，在pGL3-Basic的質粒中插入RARE序列，用熒光素酶報告基因檢測系統鑒定重組質粒pGL3-RARE-Luc在293T表達活性及對RA的響應，建立由RA刺激RARE調控熒光素酶報告基因的表達系統，與已有的小鼠模型相比，可以簡便高效地篩選影響RA對RARE調控作用的基因，更直接地研究其作用機制，為進一步研究維生素A及其通路在代謝中的作用提供體外細胞篩選模型。

RA是生物節律調控因子，其信號通路中的許多基因具有節律震蕩，與節律通路互相調控。在節律通路中，BMAL1和CLOCK結合促進CRY/PER的轉錄，而CRY和PER上調后又抑制BMAL1/CLOCK，形成一個基于Ebox生物鐘反饋調節通路［18］。研究發現RARα與RARβ啟動子含有Ebox位點［19］，而且RA促進RARα/RXRα二聚體與BMAL競爭性和CLOCK結合，抑制BMAL/CLOCK轉錄活性［20］。此外發現在PER1/BMAL啟動子中含有RARE序列［21］，提示RA與節律通路的相互調節。本研究利用已經構建的RA刺激熒光素酶報告基因載體，在293T分別過表達CRY1和RARβ，檢測RARE-Luc對RA響應信號的變化，結果發現RARβ可以增強RARELuc對RA的響應，而CRY1則抑制RA刺激 RARELuc的表達。揭示了CRY1可能通過RARE啟動子對RA下游靶基因的調控作用，進而提示節律通路與RA互相作用，并為研究其具體作用機制提供一個新的突破點，具體靶基因的篩選待后續研究。

為了更好地模擬肝臟中RA調控通路，用已構 建 的pGL3-Basic-RARE-Luc把RARE序 列 及Luciferase報告基因構建到pShuttle穿梭質粒中，轉化到BJ5183大腸桿菌感受態中，成功構建重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc，在小鼠肝原代細胞中響應RA刺激，可用于更好地在體內研究CRY1及其他可能的調控因子與RA信號通路調控的機制，更深入闡釋維生素A代謝紊亂與肥胖糖尿病等疾病的關系。

4 結論

本研究利用定點突變PCR方法構建了RARE啟動子調控的熒光素酶報告基因載體，在293T細胞中，RA刺激RARE-Luc表達，RARβ增強RA刺激RARE-Luc表達，發現CRY1抑制RARE-Luc對RA的響應，并利用pGL3-Basic-RARE-Luc載體，進一步成功構建出在肝原代被RA刺激表達的Adeasy-Basic-RARE-Luc的腺病毒載體。

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（責任編輯 李楠）

Construction and Application of RARE-regulated Luciferase Reporter Gene System Stimulated by Retinoid Acid

Yuan Yuan Chen Yaqiong
（Institute for Nutritional Science，Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Science，Shanghai 200031）

Biostearin plays a crucial role in the development of metabolic diseases by target gene regulation of retinoic acid（RA）in metabolically active tissues and interaction with circadian pathway. The luciferase reporter gene system regulated by retinoic acid response element（RARE）was constructed and expressed in 293T and primary hepatocyte of a mouse， which provides the possibility for studying biostearin and circadian， as well as signaling molecules of upstream regulation of target genes in researching metabolism. By PCR-based sitespecific mutagenesis， RARE promoter was inserted into multiple clone sites of pGL3-Basic vector. In 293T cells， we detected the gene expression and half maximal effective concentration（EC50）of RARE responding to RA and screened the possible target genes of regulating RARE. The pGL3-RARE-Luc plasmid and pShuttle vector were digested by restriction enzyme and ligated. Through transformation into competent cell BJ518 the recombinant adenovirus vector Ad-Basic-RARE-Luc was obtained and amplified after transfection to MGH cells. The activity of recombinant adenovirus was detected in primary hepatocyte of a mouse with Dual-luciferase Reporter Assay System. The results indicated that luciferase reporter gene vector regulated by RARE in 293T cells was stimulated by RA. RARβ promoted the stimulation of RA in RARE regulation， and CRY1 prohibited the response of RARE-Luc to RA. The adenovirus vector Adeasy-Basic-RARE-Luc responding to RA stimulation in primary hepatocyte of a mouse was constructed successfully.

retinoid acid；RARE；luciferase reporter gene；circadian；metabolism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.033

2014-11-24

袁源，碩士研究生，研究方向： 二型糖尿病與肥胖的分子病理研究 ；E-mail：stacyy116@hotmail.com

陳亞瓊，博士，研究方向：二型糖尿病與肥胖的分子病理研究；E-mail：yqchen@sibs.ac.cn