生物合成γ-氨基丁酸釀酒酵母谷氨酸脫羧酶基因的克隆與表達

烏云達來，張博潤，郭雪娜，王肇悅，*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.中國科學院微生物研究所，北京 100101）

生物合成γ-氨基丁酸釀酒酵母谷氨酸脫羧酶基因的克隆與表達

烏云達來1，2，張博潤2，郭雪娜2，王肇悅2，*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.中國科學院微生物研究所，北京 100101）

為了提高酵母菌的γ-氨基丁酸產量，本研究以十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyl trimethy ammonium bromide，CTAB）提取的釀酒酵母28基因組DNA為模板，擴增 得到序列長度為1 758 bp的GAD1基因，經比對與S. cerevisiae S288c的一致性達到98.58%，并設計引物擴增包括GAD1基因上游啟動子及調控序列，下游終止子在內的全長基因序列，長度為3 490 bp。將全長基因序列克隆至高拷貝質粒pUG6，構建重組質粒p28。以菌株28作為出發菌株進行轉化，經G418抗性篩選得到轉化子，進一步經過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）實驗驗證，質粒提取及酶切驗證，確證得到重組子DL28。經重組質粒p28的特性研究得知，重組質粒p28具有良好的遺傳穩定性，無抗性傳代培養10 次重組質粒不丟失。轉化后進行酶活力測定，重組子DL28的谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）酶活力比菌株28提高73.8%。通過以上實驗結果得出結論，GAD基因高表達菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。

釀酒酵母菌；γ-氨基丁酸；谷氨酸脫羧酶；克隆；表達

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又名4-氨基丁酸和氨酪酸，廣泛存在于 從單細胞生物到哺乳動物的各種有機體活細胞中［1］，是哺乳動物中樞神經系統的一種主要的抑制性神經遞質［2］，具有許多重要的生理功能，如降血壓［3］、治療哮喘［4］、促進睡眠［5］、鎮痛［6］、抗衰老［7］、促進生長激素分泌［8］等，因此日益受到人們的關注，并作為一種功能性因子越來越廣泛地用于食品、醫藥及化工等行業。獲得GABA的方法有化學合成法和生物合成法。化學合成反應劇烈、得率低、副產物多，難以純化，產物缺乏安全性，不適宜作為食品添加劑，生物合成法包括植物富集法和微生物發酵法，其中微生物發酵法具有安全、成本低、速度快、培養簡單、分布廣等特點，因此以生物合成生產食品或醫藥級GABA是個理想的途徑，尤其是利用乳酸菌和酵母菌發酵生產GABA逐漸成為研究熱點［9-13］。

谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是生物體催化L-谷氨酸或鈉鹽脫羧反應生成非蛋白質組成的天然氨基酸GABA的唯一酶［14］，該酶已在多種生物中發現，可在合成GABA的微生物中，人們對大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶的研究最深入，但將大腸桿菌應用于食品生產存在潛在的安全威脅［15］。然而利用乳酸菌、酵母菌、霉菌等微生物通過微生物發酵法生產GABA或富含GABA的食品，具有不受資源、環境和空間的限制等顯著優點。為了檢測和提高酵母菌發酵生產GABA的產量，本研究對產GABA的釀酒酵母GAD1基因進行克隆和表達，并且對重組質粒特性和重組子進行研究，為構建高效表達GABA的酵母工程菌提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質粒

E. co li DH5α ［supE44 Δ lacU169（φ 80 lacZ ΔM15）hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1］用于質粒的構建；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）28［16］、質粒pUG6含有遺傳霉素抗性基因（KanMX和AmpR）的酵母菌-細菌穿梭質粒［17］由中國科學院微生物研究所工業微生物與生物技術研究室提供。

1.1.2培養基和培養條件

E. coli DH5α保存和培養用LB培養基，篩選大腸桿菌轉化子用含有200 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基；酵母菌保存和培養用YEPD培養基，酵母菌重組子篩選用含有200 μg/mL氨芐青霉素的YEPD培養基。

1.1.3酶和試劑

實驗所用限制性內切酶、T4 DNA連接酶和Pfu Mix產品 寶生物工程（大連）有限公司；麥角甾醇 美國Sigma公司；溶菌酶、RNase和氨 芐青霉素 華美生物工程有限公司。

1.1.4儀器與設備

5415R型高速冷凍離心機、5804R型高速冷凍離心機、Mastercycler pro S型PCR儀 德國Eppendorf公司；Bio-Rad micropulser型電轉化儀、Bio-Rad Power Pac Basic型電泳儀 美國Bio-Rad公司；UV-2450型分光光度計日本島津公司；Tanon 4500型凝膠成像系統 上海天能科技有限公司。

1.2DNA操作

大腸桿菌感受態的制備、轉化和質粒的提取參照文獻［18］進行。酵母菌染色體DNA的制備及酵母菌的轉化參照文獻［19］進行。

1.3引物設計與GAD1基因的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

根據GenBank中釀酒酵母GAD1基因的核苷酸序列設計引物P1：5'-ACGCGTCGACATGTTACA CAGGCACGGTTCTAAGCAGAAG-3'和P2：5'-CCGCT CGAGTCAACATGTTCCTCTATAGTTTCTC-3'，以釀酒酵母28的基因組DNA為模板，進行高保真的PCR擴增。PCR的反應參數為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環；最后72 ℃總延伸10 min，于4 ℃保存。

1.4目的基因的PCR擴增

根據GenBank中釀酒酵母S288c（登錄號：NM001182756）基因的核苷酸序列設計引物P1：5'-ACGCGTCGACATGTTACACAGGCACGGTTCT A AGCAGAAG-3'和P2：5'-CCGCTCTAGATCAAC ATGTTCCTCTATAGTTTCTC-3'，分別引入PvuⅡ和BglⅡ的識別位點（用下劃線標出）。以釀酒酵母28的基因組DNA為模板，進行高保真的PCR擴增目的基因（GAD全長序列），包括GAD基因上游啟動子及調控序列，下游終止子。

1.5重組質粒的構建與鑒定

純化后的目的基因片段與質粒pUG6經PvuⅡ和BglⅡ雙酶切后用T4 DNA連接酶37 ℃連接2 h，轉化E. coli DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素的YEPD平板，30 ℃培養。次日挑取單菌落增菌培養，提取質粒進行單酶切（PvuⅡ）和雙酶切（BglⅡ和EcoRⅤ）及測序鑒定，將陽性重組質粒命名為p28。

1.6重組質粒的酵母轉化

將純化的重組質粒p28與S. cerevisiae 28電轉化感受態細胞混勻后，轉入預冷的電轉化杯中，電擊參數：1.5 kV、25 ?F、200 Ω、4.98 mS。對重組質粒進行酶切、PCR和測序鑒定，將獲得的陽性重組子命名為DL28。

1.7谷氨酸脫羧酶活性測定

1.7.1GAD酶液的制備

將GAD酶液的制備方法根據參考文獻［20］進行，即將S. cerevisiae 28和重組子DL28（傳代10 次的末次培養物）的濕菌體3.0 g分別懸浮到30 mL pH 5.0的0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液中，內含0.01 mmol/L 5'-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate hydrate，PLP），1 mmol/L二硫蘇糖醇，冰浴中超聲波破碎（400 W，工作5 s，間隔15 s，全程90 min），4 ℃放置過夜，4 ℃離心收集上清液（8 000×g，20 min），作為GAD溶液。

1.7.2GAD活力測定［21］

GAD酶液的反應體系總體積為400 μL，其中GAD酶液100 μL，L-谷氨酸溶液（pH 4.5，40 mmol/L，含0.02 mmol/L PLP）100 μL，pH 4.5的0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液200 μL。混合后于40 ℃反應4 h，加入4 倍體積預冷的-20 ℃無水乙醇終止反應，然后參照文獻［22］方法測定GABA含量，實驗重復3 次，數據用SAS 9.2進行數據分析。在測定條件下將1 min生成1 μmol GABA所需酶量定義為1 個酶活力單位（U）。

1.8重組子質粒遺傳穩定性測定

1.8.1重組子質粒穩定性檢測

根據文獻中質粒遺傳穩定性測定方法［23］，并作適當修改。將重組子DL28按1%體積比例接種于3 mL YEPD培養基中，30 ℃、200 r/min條件下培養12 h；每隔12 h傳代一次，進行連續傳代培養10 次；利用重組質粒p28中含有G418抗性基因的特性，每傳代一次進行質粒穩定性測定；質粒穩定性等于從不含G418的平板上選取100 個單菌落，點種于含G418的平板上最后長出的菌落數。具體過程如下：將重組子DL28的單菌落，分別接種于3 mL有選擇性培養基（含200 μg/mL G418的YEPD培養基）和無選擇性培養基（不含G418的YEPD培養基），30 ℃、230 r/min培養12 h，12 h后轉接，如是10 次。將每次傳代的有選擇性培養物和無選擇性培養物，劃線培養于對應的有選擇性和無選擇性的YEPD平板，從每個平板上挑取100 個單菌落，分別接種于有選擇性和無選擇性的YEPD平板，計數生長菌落數，計算重組質粒p28的遺傳穩定性。

1.8.2重組子質粒抗性檢測

將重組子DL28接種于3 mL YEPD培養基（含200 μg/mL G418）中，30 ℃、200 r/min條件下培養12 h，并對菌液進行稀釋，稀釋倍數為10-3、10-4、10-5。然后點種于分別含0、100、200、400、600、800 μg/mL G418的YEPD平板，計數生長菌落數，確定重組子的抗生素抗性。以供試菌株（S. cerevisiae 28）作為對照實驗。

2　結果與分析

2.1S. cerevisiae 28 GAD基因編碼區序列的PCR擴增及分析

根據GenBank中釀酒酵母GAD基因序列為參考設計引物P1和P2，通過PCR順利擴增出菌株28的GAD1基因的編碼區序列，測序結果表明，菌株28的GAD1基因編碼區序列長度為1 758 bp（圖1），與釀酒酵母S288c的谷氨酸脫羧酶基因編碼區序列的一致性達到98.58%。

圖1　1 GAD1GAD1基因序列Fig.1　GAD1 gene sequence

2.2目的基因的PCR擴增

據釀酒酵母S288c的基因核苷酸序列設計引物P1和P2對目的基因進行PCR擴增，并對其進行測序得知，目的基因片段長度為3 490 bp（圖2），包括目的基因全部序列長度、兩個酶切位點（PvuⅡ和BglⅡ）以及保護堿基。該序列在國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）進行BLAST比對，發現其與S. cerevisiae的菌株S288c基因序列一致性達到99%。

圖2　目的基因的PCR擴增序列Fig.2　Target gene sequence

2.3重組質粒的構建及鑒定

將目的基因片段與質粒p UG6經雙酶切后用T4 DNA連接酶連接構建的重組質粒p28的策略見圖3，重組質粒p28堿基序列的理論長度為7 480 bp。

圖3　重組質粒的構建Fig.3　Construction of recombinant plasmid

利用酵母菌質粒提取試劑盒提取重組質粒p28，并以重組質粒為模板擴增目的基因，并純化重組質粒，然后進行單酶切（PvuⅡ）和雙酶切（BglⅡ和EcoRⅤ）產物在8 g/L的瓊脂糖凝膠中用Tris-乙酸緩沖溶液進行電泳，結果見圖4。

圖4　重組質粒的酶切鑒定和PCR鑒定Fig.4　Identification of recombinant plasmid by endonuclease reaction and PCR

由圖4可知，泳道1重組質粒單酶切結果表明，該質粒大小與預期大小一致，重組質粒雙酶切（泳道2）得到片段大小也與預期的分析一致由此可以確定，所得到的重組質粒中已經含有所需的外源基因，重組質粒構建正確。

2.4谷氨酸脫羧酶活力的測定

2.4.1GABA標準曲線的建立

通過Berthelot比色法獲得的GABA標準曲線回歸方程式為Y = 0.014 4X+0.137 4（R2=0.999 1）。因此，待測液中GABA濃度在12.5～100.0 mmol/L的范圍內與吸光度的相關性較好。

2.4.2重組子DL28的酶活力

本研究通過聚合酶鏈反應和核酸體外擴增技術，從生物合成GABA的釀酒酵母28基因組DNA為模板，通過設計引物擴增包括GAD1基因上游啟動子及調控序列，下游終止子在內的全長基因序列，將全長基因序列克隆至高拷貝質粒pUG6，構建重組質粒p28，并以菌株28作為出發菌株進行轉化，經G418抗性篩選得到重組子DL28，成功地構建了該基因的真核表達 載體及基因工程菌。通過測定轉化液中GABA含量確定GAD酶活力，測定結果見圖5。據報道，提高GABA產量方法主要有溫度、pH值、底物濃度等發酵條件的優化［21，24］；正突變體的選育［25］、真核表達或原核表達等基因改造［26-27］等。由圖5可知，重組子DL28的GAD酶活力比供試菌株28提高73.8%，因此，通過分子生物學法高效表達GAD活力是可行的，具有應用價值。酵母菌是單細胞真核生物，在我國已有兩千多年的使用歷史，也是我國重要的微生物資源。因此，篩選產GABA的酵母菌菌株具有較高的經濟效益，并且通過篩選優良、高產、安全的酵母菌發酵生產GABA，具有成本低、產率高、且安全等優點。

圖5　轉化液中GAD的活力Fig.5　GAD activity in transformation liquid

2.5重組子質粒遺傳穩定性

2.5.1重組子質粒穩定性檢測

將重組子DL28接種于選擇性培養基（YEPD培養基+200 ?g/mL G418）和無選擇性培養基（YEPD培養基），每隔12 h傳代一次，進行連續傳代培養10 次，檢測重組質粒p28的穩定性，結果見圖6和圖7。重組質粒p28分別在選擇性培養基和無選擇性培養基上傳代培養10 次，菌落數比值均為100%，說明重組質粒p28的遺傳穩定性良好。

圖6　重組子質粒穩定性檢測Fig.6　Stability of recombinant plasmids

圖7　重組子質粒穩定性檢測菌落形態圖Fig.7　Morphology of clones from recombinant plasmids

2.5.2重組子質粒抗性檢測

圖8　重組子質粒的抗性Fig.8　Resistance of recombinant plasmids to G418 at various concentrations

將重組子DL28點種于分別含0、100、200、400、600、800 μg/mL G418的YEPD平板，確定重組子的抗生素抗性結果見圖8。重組子在含800 μg/mL G418的YEPD平板上也能生長，而對照組（供試菌株28）只能在不含G418的YEPD平板上才能生長，因此重組子顯示了很好的抗生素抗性。

3　結 論

隨著經濟發展和人們生活水平的提高，患高血壓、肥胖、糖尿病等慢性疾病的人數顯著增多。尤其，隨著人們生活節奏的加快，由于精神長期處于緊張狀態和用腦過度使得越來越多的人患失眠、焦慮和記憶力下降等精神病，因此人們越來越重視食物的營養和保健功能。據研究報道，γ-氨基丁酸是一種抑制性神經傳遞物質［2］，具有諸多保健功能，因此，本研究以釀酒酵母28基因組DNA為模板，擴增到該菌株的谷氨酸脫羧酶基因的編碼區序列（GAD1），其長度為1 758 bp，經比對與釀酒酵母S. cerevisiae S288c的同源性達到98.58%；在此基礎上又擴增出包括GAD基因上游啟動子及調控序列、下游終止子在內的全長基因序列，長度為3 490 bp，該序列與S. cerevisiae S288c基因序列一致性達到99%。將全長基因序列克隆至高拷貝質粒pUG6，構建重組質粒p28。以菌株28作為出發菌株進行轉化，經G418抗性篩選得到轉化子，進一步經過PCR實驗驗證，質粒提取及酶切驗證，確證得到重組子DL28。經重組質粒p28的特性研究得知，重組子DL28具有良好的遺傳穩定性，無抗性傳代培養10 次重組質粒不丟失。轉化后進行酶活力測定，重組子DL28的GAD酶活力比菌株28提高了73.8%，這為提高重組子DL28的生物保健品產能具有較高的參考價值。

［1］ UENO Y， HAYAKAWA K， TAKAHASHI S， et al. Purification and characterization of glutamate decarboxylase from Lactobacillus brevis IFO 12005［J］. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 1997，61（7）： 1168-1171.

［2］ GOLDBERG J S. Selected gamma aminobutyric acid （GABA）esters may provide analgesia for some central pain conditions［J］. Perspectives in Medicinal Chemistry， 2010， 4： 23-31.

［3］ AKAMA K， KANETOU J， SHIMOSAKI S， et al. Seed-specific expression of truncated OsGAD2 produces GABA-enriched rice grains that influence a decrease in blood pressure in spontaneously hypertensive rats［J］. Transgenic Research， 2009， 18（6）： 865-876.

［4］ LU Weiyang. The potential use of GABAergic drugs in the treatment of asthma［J］. Future Medicinal Chemistry， 2011， 3（2）： 145-147.

［5］ OKADA T， SUGISHITA T， MURAKAMI T， et al. Effect of the defatted rice germ enriched with GABA for sleeplessness， depression，autonomic disorder by oral administration［J］. Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology， 2000， 47（8）： 596-603.

［6］ RILEY R， TRAFTON J， CHI S， et al. Presynaptic regulation of spinal cord tachykinin signaling via GABA （B） but not GABA （A） receptor activation［J］. Neuroscience， 2001， 103（3）： 725-737.

［7］ LEVENTHAL A G， WANG Y， PU M， et al. GABA and its agonists improved visual cortical function in senescent monkeys［J］. Science，2003， 300： 812-815.

［8］ 江湖， 蘇虎， 付金衡. γ-氨基丁酸的功能及其在發芽糙米中富集的研究進展［J］. 江西農業學報， 2011， 23（11）： 146-148.

［9］ BRON P A， BENCHIMOL M G， LAMBERT J， et al. Use of the alr gene as a food-grade selection marker in lactic acid bacteria［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2002， 68（11）： 5663-5670.

［10］ HICKEY R M， TWOMEY D P， ROSS R P， et al. Exploitation of plasmid pMRC01 to direct transfer of mobilizable plasmids into commercial lactococcal starter strains［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2001， 67（6）： 2853-2858.

［11］ SAWAI Y， YAMAGUCHI Y， MIYAMA D， et al. Cycling treatment of anaerobic and aerobic incubation increases the content of gammaaminobutyric acid in tea shoots［J］. Amino Acids， 2001， 20（3）：331-334.

［12］ UENO H. Enzymatic and structural aspects on glutamate decarboxylase［J］. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2000，10（1/3）： 67-79.

［13］ KONO I， HIMENO K. Changes in gamma-aminobutyric acid content during beni-koji making［J］. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 2000， 64（3）： 617-619.

［14］ 杜昭， 李世峰， 李逸平. 谷氨酸脫羧酶在神經系統及雄性生殖系統中的功能［J］. 生命的化學， 2013， 33（2）： 96-100.

［15］ 林謙， 姜康怡， 韋素娟， 等. 產GABA發酵乳桿菌的篩選、發酵條件優化及其谷氨酸脫羧酶基因的克隆［J］. 廣東農業科學， 2014（8）：192-197.

［16］ 烏云達來， 王肇悅， 郭雪娜， 等. 產γ-氨基丁酸酵母菌的篩選及菌種鑒定［J］. 內蒙古農業大學學報： 自然科學版， 2013， 34（6）： 110-114.

［17］ GULDENER U， HECK S， FIELDER T， et al. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast［J］. Nucleic Acids Research， 1996， 24（13）： 2519-2524.

［18］ GREEN M R， SAMBROOK J. Molecular cloning： a laboratory manual［M］. 4th ed. U.S.： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2012：11-210.

［19］ ADAMS A， COTTSCHLING D E， KAISER C A， et al. Methods in yeast genetics： a cold spring harbor laboratory course manual［M］. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1997： 81-88.

［20］ 楊勝遠. 利用唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus salivarius subsp. thermophilus）Y-2生產γ-氨基丁酸的研究［D］. 南京： 南京農業大學， 2006.

［21］ 李云， 楊勝遠， 楊韻晴， 等. 產γ-氨基丁酸屎腸球菌的鑒定及其谷氨酸脫羧酶酶學性質［J］. 生物技術， 2010， 20（1）： 27-30.

［22］ 王芳權， 陳蔚青， 陳虹. 比色法快速測定酶轉化反應中γ-氨基丁酸質量分數［J］. 氨基酸和生物資源， 2006， 28（2）： 78-81.

［23］ 汪川， 張朝武， 杜江， 等. 表達型質粒載體pMG36e在宿主菌中的遺傳穩定性研究［J］. 衛生研究， 2005， 34（2）： 214-216.

［24］ 錢森和， 黃祖耀， 薛正蓮， 等. 糞腸球菌HX-3-6產γ-氨基丁酸發酵條件的優化［J］. 中國生物制品學雜志， 2013， 26（2）： 268-274.

［25］ 張穎， 高年發， 宋磊， 等. N+離子誘變選育高產γ-氨基丁酸突變株［J］.中國釀造， 2011， 30（8）： 117-121.

［26］ 李杰. 生物合成γ-氨基丁酸酵母菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆及表達［D］.金華： 浙江師范大學， 2009.

［27］ 繆存影. 高產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選鑒定、條件優化及谷氨酸脫羧酶基因的克隆［D］. 金華： 浙江師范大學， 2010.

Molecular Cloning and Expression of Glutamic Acid Decarboxylase Gene from Saccharomyces cerevisiae for Biosynthesis of γ-Aminobutyric Acid

Wuyundalai1，2， ZHANG Borun2， GUO Xuena2， WANG Zhaoyue2，*
（1. College of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China；2. Institute of Microbiology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China）

Glutamic acid decarboxylase （GAD） is a rate-limiting enzyme for the biocatalysis of γ-aminobutyric acid（GABA）. Therefore， GAD gene is the key gene to regulate the production of GABA. In order to improve the productive capacity of GABA in yeasts， in the present study， we used the CTAB method to purify S. cerevisiae 28 genomic DNA as the template. A 1 758 bp gene fragment was amplified and sequenced as the GAD1 gene that had 98.58% homology with the S. cerevisiae S288c gene. The primers were designed for amplifyi ng the 3 490 bp sequence of GAD1 full-length ge ne，including GAD1 gene upstream promoter， regulatory sequence and downstream terminator. The full-length gene sequence was cloned into plasmid pUG6， to construct the recombinant plasmid p28. The strain 28 was used as the starting strain for the conversion， and the transformant was gained by G418 resistance screening， and further verified by PCR， plasmid extracti on and double digest identification as the recombinant DL28. By exploring the characteristics of the recombinant plasmid p28， we found that it had good genetic stability， and the recombinant plasmid was still stable after subculture for 10 generations without resistance training. The enzyme activity was determined after transformation， and the GAD activity of recombinant DL28 was improved by 73.8% when compared with the strain 28. Therefore， GAD gene is highly expressed in recombinant DL28， which also has higher G418 resistance.

S. cerevisiae； γ-aminobutyric acid； glutamic acid decarboxylase； cloning； expression

Q939.97

A

1002-6630（2015）13-0131-06

10.7506/spkx1002-6630-201513025

2014-08-27

內蒙古自治區應用技術研發資金計劃項目（20130438）；內蒙古自然科學基金面上項目（2014MS0358）

烏云達來（1975—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：wydl@imau.edu.cn

王肇悅（1967—），女，副研究員，博士，研究方向為工業酵母代謝工程及調控。E-mail：wangzhaoyue@126.com