糖尿病大鼠海馬組織自噬減少與SIRT2下調有關

趙 攀庹 磊徐 潔陳思其徐 東詹 琳袁新初袁 瓊*

（1 武漢科技大學醫學院藥學系，湖北 武漢430081；2 武漢科技大學醫學院組織胚胎學教研室，湖北 武漢 430081）

糖尿病大鼠海馬組織自噬減少與SIRT2下調有關

趙 攀1庹 磊1徐 潔1陳思其1徐 東1詹 琳1袁新初2袁 瓊1*

（1 武漢科技大學醫學院藥學系，湖北 武漢430081；2 武漢科技大學醫學院組織胚胎學教研室，湖北 武漢 430081）

目的 探討自噬與SIRT2在糖尿病大鼠海馬組織中的表達及意義。方法 采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，60 mg/kg）建立1型糖尿病大鼠（T1DM）模型，采用激光共聚焦檢測LC3蛋白表達，采用免疫組化檢測海馬SIRT2蛋白表達水平。結果 與正常組相比，T1DM大鼠海馬組織自噬減少，SIRT2表達降低，而胰島素[4 U/（kg?d）]治療后促進細胞自噬并上調SIRT2表達。結論 高血糖下調海馬神經元SIRT2表達并抑制自噬發生，這可能與糖尿病腦病的發生與發展相關。

糖尿病腦病；SIRT2；自噬；高血糖；LC3

糖尿病腦病是糖尿病主要并發癥之一。它主要是以電生理改變和中樞神經系統結構改變為特點[1-2]。慢性高血糖引起的糖尿病腦病是認知功能障礙的主要危險因子之一[3-5]。

自噬是維持系統穩態的不可缺少的分解代謝過程。它通過用雙膜結構的自噬體清除受損的細胞器或者有缺陷的蛋白，并通過溶酶體降解并以此對環境變化做出反應[6]。很多研究人員已經證實誘導自噬與中樞神經系統疾病例如阿爾茨海默病相關。然而那，研究人員最近在發生AD的臨床前期階段研究發現淀粉樣蛋白（Aβ）（1-42）水平明顯升高，而自噬現象減少[7]。至今，沒有證據證實自噬和糖尿病腦病之間的相關性。在本實驗中我們將證實糖尿病腦病與自噬間的相關性。

SIRT2屬于高保守的NAD+-依賴性去乙酰化酶家族，該家族有7中亞型分別為SIRT1-SIRT7，這其中亞型定位于不同的亞細胞器，而他們的底物包括了組蛋白和轉錄因子以及酶類[8-9]。敲除SIRT2表達能增加自噬并不正常的延長微管抑制劑引起的細胞有絲分裂阻滯[10]，過度SIRT2能抑制溶酶體介導自噬體的形成[11]，異常蛋白聚集被認為是許多神經退行性疾病的共同病理過程[12]。SIRT2能通過抑制蛋白酶干擾神經細胞自噬降解聚集蛋白的功能。因此，我們推測SIRT2能通過調節自噬介導糖尿病腦病的發生。本研究采用1糖尿病大鼠模型來研究在糖尿病腦病發展過程中SIRT2表達與自噬的相關性。

1　方法與材料

1.1實驗動物、主要藥物、試劑：SD大鼠30只，雄性，體質量180～200 g，由武漢大學實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素（STZ）購于美國Sigma公司，蛋白抽提試劑盒購于北京博奧森生物公司，LC-3、SIRT2、辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗均購于美國Santa Cruze公司，S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物有限公司，DMR+Q550病理圖像分析儀購于德國萊卡公司。

1.21型糖尿病大鼠模型建立和分組：鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma-Aldrich，MO，USA）溶于0.1 mol/L pH=4.3的枸櫞酸鈉緩沖液。SD大鼠環境適應1周后，通過腹腔注射的STZ（65 mg/kg）。空白對照組腹腔注射與STZ劑量相同的枸櫞酸鈉緩沖液。在72 h后，測量空腹血糖，血糖水平高于11.1 mmol/L模型建立成功。體質量和血糖水平在實驗結束時測定。大鼠分成以下3組（每組6～9只）：①空白對照組：無糖尿病；②1型糖尿病組；③1型糖尿病組+胰島素[按4 U/（kg?d）]進行皮下注射胰島素）。糖尿病模型建立12周后，收集樣本，檢測相應指標。

1.3免疫組織化學SP法檢測蛋白表達：造模結束后處死大鼠，取腦組織海馬部位，用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，采用SP法嚴格按照說明書操作檢測SIRT2蛋白表達，SIRT2一抗稀釋度為1∶200，檸檬酸抗原熱修復，DAB顯色，PBS代替一抗做陰性對照。在圖像分析儀上，SIRT2陽性細胞的平均百分比是從六個領域的海馬組織切片用光鏡觀察計算（400×放大）。

1.4激光共聚焦檢測LC3蛋白表達：脫蠟，血清封閉2 h，山羊抗大鼠LC3（1∶100）4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，FITC-抗山羊二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，DAPI染液孵育10 min，緩沖甘油封片，置于激光共聚焦顯微鏡（日本）進行掃描分析。

1.5統計分析：所有數據均用（x-±s）EM表示。組間差異采用Oneway ANOVA和Student-Newman-Keuls多重比較檢驗分析。雙側P<0.05認為差異有統計學意義。

2　結果

2.11型糖尿病大鼠代謝異常：見表1所示，與正常對照組相比，1型糖尿病大鼠體質量（225.7±23）g顯著減輕，血糖水平（23.2±1.3）mmol/L升高，糖化血紅蛋白水平（11.9±1.4）%升高。而胰島素治療組，1型糖尿病大鼠的代謝特征包括體質量，血糖水平，糖化血紅蛋白參數均與空白對照組的大鼠相似。

表1　1型糖尿病大鼠體質量、血糖和糖化血紅蛋白水平

2.2高血糖癥對糖尿病大鼠海馬神經細胞自噬的影響：LC3是自噬的標記蛋白，本實驗采用激光共聚焦檢測該蛋白表達水平。見圖1所示，與正常對照組相比，1型糖尿病大鼠海馬神經細胞核周點狀的LC3蛋白表達下調，而胰島素治療后，在海馬中LC3的表達得到調整。這些結果表明高血糖在糖尿病腦病初期抑制細胞自噬。

圖1　激光共聚焦檢測糖尿病腦病大鼠海馬LC3表達

2.3高血糖癥對糖尿病大鼠海馬神經細胞SIRT2表達的影響：見圖2A所示，1型糖尿病大鼠海馬內SIRT2的免疫反應性降低，1型糖尿病腦病SIRT2的免疫組化得分（3.2±0.5）明顯低于空白對照組的得分（6.3 ±0.6；P<0.01，圖2B）。用胰島素治療進行逆轉治療明顯反轉了高血糖對SIRT2表達的影響（5.8±0.5， P<0.01；圖2）。

圖2　免疫組化檢測海馬SIRT2蛋白表達。A：免疫組化代表性圖片。棕色的顆粒為染色陽性；B：SIRT2免疫組化評分統計圖。n=6–7，**P<0.01vs. control；++P<0.01vs.T1DM

3　討論

自噬是一種維持細胞環境穩態的降解過程，去除異常細胞成分起著重要的作用[13]。在自噬過程中，靶蛋白和細胞器被送入雙層膜的自噬溶酶體內降解[14]。因此，在神經系統中的細胞自噬主要是維持細胞蛋白形成與降解之間的正常平衡，而抑制自噬通路與多種神經退行性疾如阿爾茲海默癥[15]、帕金森病[16]相關。近來，研究證實抑制細胞自噬與β-淀粉樣蛋白引起的神經元功能障礙有關。錯誤折疊的蛋白質進入線粒體，導致氧化磷酸化功能障礙[17]并阻斷隨后的自噬激活[18]。因此，自噬率降低能導致神經元β-淀粉樣蛋白積累[19]。作為老年癡呆癥的一個危險因素，高血糖能損害海馬的功能并造成糖尿病的認知能力下降[20-21]。本研究中發現在1型糖尿病腦病的早期階段，高血糖抑制腦海馬組織神經元自噬，而降低血糖水平能逆轉細胞自噬。這提示神經元細胞自噬功能受損導致異常蛋白聚集在細胞參與糖尿病腦病的發展。

SIRT2是sirtuin蛋白家族的一員，是一種胞質蛋白，能使靶蛋白脫乙酰基調節細胞有絲分裂。最近的研究表明，SIRT2可能參與自噬調控，在去除錯誤折疊蛋白、受損的細胞器和內生膜系統的激活和動員有重要的作用[11,22]。在應激反應中，FoxO1被SIRT2去乙酰化，而乙酰化的FoxO1能結合Atg7，促進自噬從而導致細胞死亡[23]。此外，在蛋白酶體的抑制作用下，干擾SIRT2表達能抑制自噬介導的神經元細胞中蛋白質聚集體的降解[11]。本研究結果顯示1型糖尿病大鼠海馬內SIRT2表達下調，胰島素治療組能上調糖尿病大鼠海馬組織SIRT2蛋白表達。糖尿病腦病時，SIRT2的表達與自噬發生呈正相關。因此，我們推測高血糖能通過抑制海馬神經元細胞SIRT2表達從而抑制自噬，使細胞內穩態發生變化導致無法對應激狀態下產生的受損蛋白或者細胞器清除從而促進糖尿病腦病的發生。然而確切機制尚有待進一步探討。

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Relationship of Autophagy and SIRT2 in the Hippocampus of T1DM Rats

ZHAO Pan1, TUO Lei1, XU Jie1, CHEN Si-qi1, XU Dong1, ZHAN Lin1, YUAN Xin-chu2, YUAN Qiong1*
(1 Department of Pharmacology, Medical College, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China; 2 Department of Histology and Embryology, Medical College, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430065, China)

Objective To demenstrate the relationship of autophagy and SIRT2 in the hippocampus of type 1 diabetic mellitus(T1DM) rats. Methods The rat model of T1DM was established by intraperitoneal injection of streptozotocin(60 mg/kg) for one time. LC3 expression was detected by confocal analysis; SIRT2 expression was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the normal rats, autophagy was inhibited in hippocampus of T1DM rats; the expression of SIRT2 was also downregulated.Treatment of insulin[4 U/(kg?d)] reverased the effect of hyperglycemia on autophagy and SIRT2 expression.

Diabetic encephalopathy; Autophagy; SIRT2; Hyperglycemia; LC3

R587.1

B

1671-8194（2015）36-0010-03

Conclusion The expression of SIRT2 downregulation may be involved in the inhibition of autophagy, which was associated with the progression and pathogenesis of diabetic encephalopathy.