組合培養下Hep-2對EPCs的影響

賴怡　張怡　劉肖珩★　曾燁　吳江

·基礎研究·

組合培養下Hep-2對EPCs的影響

賴怡張怡劉肖珩★曾燁吳江

目的 探討喉鱗癌細胞與內皮祖細胞組合培養后對兩種細胞的影響。方法 在組合培養后，觀察內皮祖細胞的細胞增殖、凋亡、細胞周期以及成血管能力變化。通過免疫組化檢測細胞表面分子標注物的變化。結果 在與喉鱗癌細胞組合培養后，內皮祖細胞的細胞增殖和凋亡均增加，上調細胞表面標志物。喉鱗癌細胞Fascin-1表達上調，內皮祖細胞的成血管能力加強。結論 內皮祖細胞與喉鱗癌細胞組合培養可以導致細胞生物學特性和成血管能力的變化，從而促進腫瘤血管生成。

Fascin-1 組合培養 喉鱗癌細胞 內皮祖細胞 腫瘤血管生成

喉鱗癌是一種常見的頭頸部惡性癌癥，在大部分病例中治療療效較差［1］。腫瘤微環境，能夠促進血管和細胞外基質生成，誘導腫瘤細胞的遷移，研究透徹其相關因素將有助于腫瘤治療［2］。循環祖細胞如內皮祖細胞［3］、胚胎祖細胞均參與內皮細胞介導的新生血管形成過程中。作者自2011年1月至6月采用喉鱗癌細胞（Hep-2）與內皮祖細胞（EPCS）組合培養后，觀察內皮祖細胞在組合培養后細胞生物特性和細胞成血管、遷移能力的變化，探討EPCs對腫瘤血管新生的作用和在抗癌治療中的潛在作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物 Beagle實驗用犬，雌性，成年，四川大學華西醫院動物實驗中心提供。

1.2主 要 試 劑 Transwell小 室（Costar，USA）；EBM-2培養液（Lonza，USA）；MPA、淋巴細胞分離液，均購自Sigma USA。CD34、CD133、VWF、VEGR-2購自Santa Cruz USA。

1.3EPCs的分離培養和鑒定 無菌抽取犬骨髓5ml，肝素抗凝，置于淋巴細胞分離液（1.077）上，密度梯度離心（2113r/min，25min）。吸出離心后的單個核細胞層，PBS洗滌兩次（1494r/min，10 min），以EBM-2重懸細胞，接種于FN預包被的培養瓶中，37℃、5%CO2培養。4d后首次換液，以后換液1次/3d，待細胞長至90%匯合后傳代并檢測其表面標志因子CD34、CD133、VWF。本實驗采用3～5代細胞。

1.4細胞增殖、細胞周期和凋亡檢測 取對數生長期細胞加入96孔（2.5×103/孔）板中，檢測EBM-2培養基和M199（10%胎牛血清）培養液情況下細胞增殖情況。MTT法測定吸光度值（OD），連續7d，繪制EPCs的生長曲線。EPCs細胞以5×105/孔接種于6孔板中，48h后收集細胞，70%冰乙醇固定后加入碘化丙醇（PI）染色，流式細胞儀分析細胞周期和凋亡率。

1.5Transwell組合培養 在上室或下室分別接種Hep-2 或 EPCs，在各自生長融合后，進行組合培養。設置對照組，組合培養后分別進行免疫組化、細胞周期和細胞凋亡及體外血管形成實驗。

1.6體外血管生成實驗 Matrigel （100 μl） 接種到24孔板中，在37℃ 孵化30 min 。EPCs 細胞消化重懸后，加至鋪設Matrigel的孔板中。在不同時間段觀測評價血管形成情況，評價顯微鏡下三個隨機區域毛細血管樣管狀結構的數量。

1.7細胞遷移試驗 取對數生長期細胞4×104/孔接種于Transwell上室中。置于恒溫培養箱內孵育24h。用棉簽小心刮除未遷移過膜的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.2%結晶紫染色后于光學顯微鏡下觀察，隨機取10個視野計數遷移過膜的細胞。

1.8統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料均以（x±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1喉鱗癌組織、臍帶及內皮細胞免疫組化情況 見圖1。

圖1　喉鱗癌組織、臍帶及內皮細胞免疫組化情況

2.2EPCs細胞的分離、培養、鑒定及其生物學特性（1）倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況：剛分離的細胞多呈圓形，周圍有較多血細胞，較難分辨出 EPCs，在各種內皮系生長因子的作用下，隨培養天數增加，在培養瓶中的貼壁細胞形態開始出現改變，形成內皮樣細胞，按照條索狀分布，逐漸形成集落，從而細胞進入對數增長期（見圖2A）。（2）細胞鑒定：免疫細胞化學的結果，表明所分離的細胞表達CD133、CD34、VEGFR-2。EPCs可攝取乙?；兔芏戎鞍祝╝c-LDL）并與荊豆凝集素－1（UEA-1）反應（見圖2B）。用紅色熒光標記的是 DiI-acLDL，用綠色熒光表示 FITCUEA-1 染色情況。分離出來的細胞均表達這兩種蛋白，為正在分化的EPCs（見圖2C）［4］。（3）MTT法繪制細胞生長曲線：若僅在M119中添加VEGF等一系列生長因子，EPCs從2 d起較采用EBM-2培養的細胞生長明顯落后。盡管生長明顯減緩，但各組細胞仍可以在5d達到生長的高峰期，在此后的時間內，生長速度開始逐漸下降。細胞接種密度同樣也可以影響細胞成長情況。當EPCs接種密度為105，在同等情況下（M199或EBM-2），細胞生長均顯著高于接種密度為104的細胞。值得關注的是，接種密度為104且采用EBM-2培養的EPCs，可以見到在5d后，細胞均數仍在增長（見圖2D）。（4）體外血管生成：顯示細胞接種不同時間后，體外血管形成的情況。接種后0 h，細胞懸浮在培養液中，分布較均勻接種。＞1h，細胞形態無明顯變化。接種＞2h，在Matrigel不同層面，逐漸貼壁，向周圍延伸，細胞間形成連接。接種＞4h，可有血管網絡的形成。接種8h后，細胞相互接觸更為顯著，逐漸形成小的血管分支。接種＞12h后，Matrigel各層均有管狀連接形成，可認為EPCs形成血管的能力較強，并在三維空間上生長并延伸（見圖2E）。

圖2　EPCs細胞生物學特性檢測

2.3組合培養后EPCs和Hep-2細胞的生物學特性變化。（1） 組合培養后EPCs和Hep-2細胞形態的變化：組合培養1 d后，EPCs 的細胞形態較之前有明顯變化，細胞變得細長，胞漿減少，隨著培養時間增加，EPCs 的形態繼續變化，胞漿持續減少，至組合培養第4 d，細胞形態變化最為顯著。Hep-2 細胞的變化較之前并無顯著性變化（圖3A）。（2） 組合培養后EPCs和Hep-2細胞周期和細胞凋亡的變化：組合培養后 EPCs的 PI 較單獨培養的EPCs 有顯著性增高（P＜0.05）；組合培養后 Hep-2 的 PI 較單獨培養的Hep-2的PI有顯著性增高（P＜0.01）。以上結果表明，在組合培養后，EPCs、Hep-2 兩種細胞增殖均明顯增加，Hep-2 的增殖更為顯著。組合培養后 EPCs 的 AI 較單獨培養的 EPCs 有顯著性增高（P＜0.01）；同時，組合培養后 Hep-2 的 AI 較單獨培養的 Hep-2 的 AI 有顯著增高（P＜0.01）。以上結果表明，在組合培養后，EPCs、Hep-2 兩種細胞發生凋亡明顯增加，Hep-2 的凋亡更為顯著。（3）組合培養后EPCs和Hep-2細胞表面標志物的變化：在組合培養后EPCs表面標志物發生變化：CD133的表達略有減弱，而CD 34和VEGFR-2的表達增強。組合培養后Hep-2中Fascin-1的表達較之前顯著增加（P＜0.01），意味著組合培養可上調Fascin-1的表達。（4）組合培養后EPCs體外血管生成情況變化：在接種4 h后，細胞間開始出現連接趨勢；在5 h，細胞開始逐漸形成網狀結構；到7 h可見這些細胞形成網狀結構，且并不局限于一個層面，而是在多個層次上延伸；到8 h血管結構已經非常明顯。

3　討論

Fascin 是一種關鍵的肌動蛋白結合蛋白，結合粘附在絲狀偽足上。Fascin在較多腫瘤中表達增高如乳腺癌、肺癌、子宮癌等，并引起腫瘤細胞的形態學變化，主要是源于對膜突起和遷移特性的加強［5，6］。研究表明，Fansin-1在喉鱗癌轉移和復發中起著重要作用［7］。喉鱗癌組織切片結果表明，Fascin-1的表達與喉鱗癌分化程度有關。Fascin-1可能會在喉鱗癌的腫瘤微環境的形成及發展過程中發揮作用。因此，有必要研究Hep-2 與EPCs組合培養后，兩種細胞生物學特性以及 Fascin-1 表達的變化。

組合培養3 d之后，EPCs的細胞形態發生顯著改變，而Hep-2在整個過程中變化不大。因此采用組合培養3 d后的EPCs和Hep-2用于實驗。EPCs 具有體外成血管能力，在接種4 h后開始出現網狀結構，在后續時間內逐漸增強連接，并在凝膠各層形成網狀結構，12 h后細胞趨于融合。而組合培養后，EPCs的血管生成情況發生變化，一旦細胞接觸形成，迅速形成網狀結構，并在各個層面延伸。到8 h時，細胞已趨于融合。這意味著，組合培養可促進EPCs 的成血管能力。

在EPCs和Hep-2組合培養后，PI和AI均較單獨培養組有顯著性差異，意味著組合培養可使兩種細胞的增殖和凋亡均增加。盡管組合培養可以同時影響細胞增殖和細胞凋亡，但數據顯示，細胞凋亡的程度較細胞增殖程度更為顯著。

組合培養可導致EPCs細胞表面標志物表達發生改變：CD133表達減弱，CD34和VEGFR-2表達增強，意味著組合培養可使EPCs從祖細胞向成熟內皮細胞分化［8，9］。可能是由于組合培養過程中，Hep-2分泌相關因子影響EPCs的增殖、凋亡、細胞表面標志物以及成血管能力。

組合培養后，Hep-2中Fascin-1的表達增強，即組合培養可使Hep-2侵襲性增強?？赡苁墙M合培養情況下，EPCs通過分泌相關因子對Hep-2產生影響。國內研究結果表明，采用EPCs與其他細胞組合培養，有促進其他細胞增殖的作用［10，11］，在使用VEGF抗體后將拮抗相關作用［12］。

本資料結果表明，Fascin-1可在高分化喉鱗癌、臍帶及內皮細胞中表達；EPCs與Hep-2組合培養可使兩種細胞增殖和凋亡增強；EPCs體外成血管能力增強；EPCs從祖細胞向成熟內皮細胞分化，Hep-2中Fascin-1的表達增強。因此，EPCs和Hep-2組合培養后，可改變兩種細胞的細胞生物學特性及Fascin-1的表達。因此，采用組合培養方式來分析Hep-2與EPCs在喉鱗癌發生發展中作用是切實可行的，為進一步在組合培養系統中研究喉鱗癌血管生成和侵襲的分子機制提供實驗依據。

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Aim In the present study，laryngeal squamous cell carcinoma cells were co-cultured with endothelial progenitor cells in transwell chamber experiments to investigate the infl uence of co-culture on both cell types. Methods After co-culturing，proliferation，apoptosis，cell cycle and tube formation by endothelial progenitor cells were measured. Changes in expression of cell surface markers and Fascin-1 were detected by immunocytochemistry. Results Both the proliferation and apoptosis indices increased in endothelial progenitor cells and laryngeal squamous cell carcinoma cells after co-culture. Co-culturing upregulated the expressions of endothelial progenitor cells surface markers. Fascin-1 expression in laryngeal squamous cell carcinoma cells was increased and the angiogenic capacity of EPCs was enhanced. Conclusion Co-culture of endothelial progenitor cells with laryngeal squamous cell carcinoma cells induces changes in biological characteristics and angiogenic capacity，thereby promoting tumor angiogenesis.

Fascin-1 Co-culture Laryngeal squamous cell carcinoma EPCs Tumor angiogenesis

國家自然科學基金No 81201477，10972148

610091成都市婦女兒童中心醫院中心實驗室（賴怡）610041 四川大學華西醫院西部婦幼研究院圍生醫學實驗室（張怡）610041四川大學基礎醫學院生物醫學工程實驗室（劉肖珩 曾燁 吳江）