實時超聲造影技術分析兔VX2肝癌模型的實驗研究

朱培華　黃敬垣★　葉萌　楊繼東　洪勇強

實時超聲造影技術分析兔VX2肝癌模型的實驗研究

朱培華黃敬垣★葉萌楊繼東洪勇強

目的 探討應用實時超聲造影（CEUS）技術檢查兔 VX2肝癌模型的臨床價值。方法 選取30只新西蘭大白兔制成VX2肝癌模型，分別行常規超聲檢查及經兔耳緣靜脈注射超聲造影劑行CEUS檢查，觀察肝癌模型的影像學特點，獲得并分析肝癌模型中腫瘤組織的CEUS定量參數的特點，并與肝癌模型的病理切片比較分析。結果 兔VX2肝癌結節進行CEUS檢查時均表現為典型的“快進快退”增強特點。兔VX2肝癌組織的AS、PI、AUC較周圍鄰近正常肝組織明顯增高（P＜0.05）；AT、TTP較周圍鄰近正常肝組織明顯減少（P＜0.05）。CEUS檢查對兔VX2肝癌結節的總體檢出率及對微小肝癌、小肝癌的敏感度和準確度均高于常規超聲檢查（P＜0.05）。CEUS對直徑0.3～0.5cm微小肝癌的檢出率（85.71%）高于常規超聲（P＜0.05）。與直徑＞1.0cm小肝癌比較，直徑＜1.0cm微小肝癌的CEUS定量參數AT、TTP明顯增加（P＜0.05）。結論 CEUS不僅能提供肝癌病灶的微小血管形態結構信息，而且能實時反映其血流灌注情況，有助于小肝癌及微小肝癌的檢出及定性診斷。

兔 VX2肝癌模型 原發性肝細胞癌 實時超聲造影技術

原發性肝細胞癌（HCC）在我國較為常見，因其惡性程度高，且對放療化療均不敏感，預后差。臨床對小肝癌、微小肝癌常難以早期發現。作者應用實時超聲造影 （CEUS）技術對兔VX2肝癌模型進行觀察，探討HCC 的CEUS實時動態增強效應特征及其定量參數特點，旨在提高HCC診斷率及檢出率。

1　材料與方法

1.1實驗動物模型 30只健康純種新西蘭大白兔由浙江大學動物實驗中心提供，雌雄不作限制，所有實驗兔均為CL級，體質量2.0～3.0kg。

1.2常規超聲檢查及CEUS檢查 實驗兔VX2成瘤組織種植完畢于21d后，由中級職稱以上且經驗豐富的超聲診斷醫師對其進行常規超聲檢查及CEUS檢查。使用Philips iU22超聲診斷儀（L9-3寬頻線陣探頭，頻率為10MHZ，機械指數設定為0.07）。采取仰臥位將實驗兔固定于實驗操作臺上。首先采用常規二維超聲多方位多切面觀察兔VX2肝癌模型，觀察內容主要包括：腫瘤病灶的部位、大小、形態、內部回聲、邊界、數量。啟動彩色多普勒觀察肝癌腫瘤病灶的血供情況。將意大利博萊科公司提供的Sonovue加入0.9%的氯化鈉5ml稀釋備用。以24G的靜脈留置針于實驗兔的耳緣靜脈建立靜脈通道。進行實時超聲造影時，采用1ml注射器按照0.1ml/kg的劑量經靜脈通道進行團注，隨后以2ml生理鹽水進行超聲造影劑團注后的沖管。團注造影劑的同時，立刻啟動實時動態超聲造影計時器，并對造影影像資料作記錄（記錄時長約3min），保存至超聲診斷儀的主機內置硬盤中，作后續分析觀察。對超聲造影進行時間-強度分析時，使用QLAB軟件完成，并獲取感興趣區域（腫瘤組織以及其周邊鄰近正常肝組織）的CEUS分析參數：曲線下面積（AUC）、峰值強度（PI）、開始增強時間（AT）、曲線增強上升斜率（AS）、達峰時間（TTP）［1］。CEUS時相判斷：動脈相-CEUS開始后10s～30s；門脈相-CEUS開始后30～120s；延遲相-CEUS開始后120～360s。CEUS腫瘤組織“增強程度”判斷標準：以腫瘤病灶周邊鄰近正常的肝組織回聲作參照進行比較，呈現四個級別（“高增強”、“等增強”、“低增強”、“無增強”）。

1.3病理學檢查 動物實驗結束后，采用空氣栓塞法將實驗兔全部處死，切除實驗兔的肝臟，觀察兔VX2肝癌模型腫瘤標本的情況，記錄實驗兔肝癌結節的數目并精確測量每個結節的大小。將標本浸入濃度為10%的甲醛液內行標本固定，常規石蠟包埋后進行連續切片（厚度為3.0μm），常規HE染色后并以中性樹膠進行封片，將制作好的組織標本進行病理分析觀察。

1.4統計學處理 采用 SPSS 16.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，用t檢驗；計數資料以%表示，用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兔VX2肝癌模型的CEUS檢查 超聲造影劑經實驗兔耳緣靜脈通道注入后約5s左右即開始出現動脈相增強，病灶結節周邊可見漸進性的“環狀”增強或“樹枝狀”增強。門脈相超聲造影劑即開始出現廓清，因該時相正常肝組織的造影回聲不斷增強，而病灶結節的增強即不斷減弱，兩者比較，病灶結節呈低回聲。整個CEUS過程表現為惡性腫瘤的典型增強方式：“快進快退”型。如病灶中央出現壞死區時僅見病灶周邊的“環狀”增強。

2.2肝癌病灶組織與周圍鄰近正常肝組織的CEUS定量參數比較 見表1。

表1　肝癌組織與正常肝組織CEUS定量參數比較 （x±s）

2.3常規超聲檢查和CEUS檢查對兔VX2肝癌結節的檢出情況比較 病理檢查發現兔VX2肝癌結節63個，其中37個為1.1～3.0cm的小肝癌，11個為0.3～1.0cm的微小肝癌。（1）常規超聲檢查：發現肝癌結節47個（結節直徑范圍0.5cm～4.3cm），其中包括微小肝癌7個（4個病理解剖證實，結節直徑＞1cm）、小肝癌28個（3個病理解剖證實，結節直徑＞3cm）。常規超聲檢查對肝癌結節總體檢出率74.60%。小肝癌敏感度67.57%、特異度88.46%、準確度76.19%，陽性預測值89.29%、陰性預測值65.71%。微小肝癌敏感度27.27%、特異度92.31%、準確度80.95%，陽性預測值42.86%、陰性預測值85.71%。（2）CEUS檢查：發現肝癌結節59個（結節直徑范圍0.4～4.1cm），其中包括微小肝癌10個（1個病理解剖證實，結節直徑＞1cm）、小肝癌35個（1個病理解剖證實，結節直徑＞3cm）。CEUS檢查對肝癌結節總體檢出率93.65%；小肝癌敏感度91.89%、特異度96.15%、準確度93.65%、陽性預測值97.14%、陰性預測值89.29%；微小肝癌敏感度81.82%，特異度98.08%、準確度95.24%，陽性預測值90.00%、陰性預測值96.23%。（3）CEUS檢查與常規超聲檢查比較：CEUS檢查對兔VX2肝癌結節總體檢出率（χ2值=8.558、P值=0.003）、微小肝癌的敏感度（χ2值=6.600、P=0.010）、準確度（χ2=6.130，P值=0.013）及小肝癌的敏感度（χ2=6.773，P=0.009）、準確度（χ2=7.499，P=0.006）均高于后者，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩種檢查方法對兔VX2微小肝癌特異度（χ2=1.891，P=0.169）、小肝癌的特異度（χ2=1.083，P=0.298），差異均無明顯統計學意義（P＞0.05）。

2.4CEUS對微小肝癌的檢出情況 CEUS對微小肝癌的總檢出率（81.82%）明顯高于常規超聲（27.27%），差異有統計學意義（χ2=6.600、P=0.010）。CEUS對直徑0.3～0.5cm微小肝癌的檢出率（85.71%）明顯高于常規超聲（14.29%），差異有統計學意義（χ2=7.143、P=0.008）。CEUS對直徑0.5～1.0cm微小肝癌的檢出率（75%）高于常規超聲（50%），但差異無統計學意義（χ2=0.533、P=0.465）。

2.5直徑＜1.0cm微小肝癌CEUS參數特征 見表2。

表2　微小肝癌與小肝癌的CEUS參數比較（x±s）

3　討論

臨床上將腫瘤病灶直徑為1～3cm的肝癌稱為小肝癌，而直徑＜1cm的肝癌稱為微小肝癌，其早期可無明顯的臨床癥狀。如何提高小肝癌、微小肝癌的檢出率及診斷準確率成為目前肝癌醫學影像學研究的熱點。

肝癌的發生發展過程中，肝癌的新生血管最先生成，包繞肝癌病灶邊緣后通過分支伸入肝癌病灶內部滋養肝癌實質，最終形成血供豐富的新生血管網，在這網架結構基礎上繼而出現肝癌細胞增生。本資料中，所有兔VX2肝癌模型的腫瘤病灶在進行CEUS檢查時均可探及較豐富的動脈血供，并表現出“快進快退”的造影特征，即動脈期腫瘤病灶出現快速增強，門脈期即表現為快速廓清［2］。這是CEUS對腫瘤良惡性作出鑒別診斷的基礎。這與腫瘤病灶的血供以肝動脈供血占絕對優勢有關。肝癌組織的供血動脈異常增生、移位、變形、包繞、擴張及動靜脈瘺形成，可使超聲造影劑快速到達腫瘤病灶的內部組織，一般為造影開始后的5～10s［3］，以致于動脈相早期CEUS即可顯示腫瘤病灶的灌注情況及滋養血供情況。因此利用CEUS能更加敏感地顯示小肝癌、微小肝癌結節。有利于小肝癌、微小肝癌的早期檢出，為肝癌患者的臨床治療提供早期客觀的醫學影像學依據。

正常肝臟供血來自于肝動脈以及門靜脈的雙重供血，而肝癌結節的供血即主要來自于肝動脈供血，兩者供血方式存在著差異。本資料中，腫瘤病灶組織的CEUS定量參數中AS、 PI、AUC較其周邊鄰近正常肝組織明顯增大（P＜0.05），提示兔VX2肝癌模型中腫瘤病灶組織內部具有異常豐富的新生微小動脈，必然導致肝癌病灶組織內血供隨之增加，提示HCC惡性的傾向［4］，有助于CEUS對腫瘤病灶結節的性質判定，即有助于小肝癌、微小肝癌的定性診斷。本資料中，與周邊鄰近正常肝組織比較，腫瘤病灶組織的CEUS定量參數中AT 、TTP明顯減少（P＜0.05），表明腫瘤病灶組織出現提前灌注。原因可能是一方面腫瘤病灶組織內新生微小動脈血管的異常增生，使肝動脈的優勢供血構成比例遠超門靜脈［5］，并占絕對性的主導地位，進入病灶結節組織的血流量較正常肝組織明顯增多。另一方面腫瘤病灶組織內新生血管具有極高的通透性，進一步提高超聲造影劑的灌注速度，縮短灌注時間［6］。CEUS檢查對肝癌病灶結節的檢出能力明顯優于常規超聲檢查，尤其對臨床上難以發現的直徑＜1.0cm的微小肝癌的診斷能力更突出，其臨床診斷的漏診率更低。且本資料中，CEUS對兔VX2肝癌結節的檢查較常規超聲檢查具有更高的準確度（P＜0.05），且對小肝癌的準確度達93.65%，對微小肝癌的準確度達95.24%，其值均＞0.75，表明CEUS檢查對肝癌病灶結節的診斷具有更高的臨床應用價值，尤其對小肝癌和微小肝癌的診斷檢查，CEUS明顯優于常規超聲檢查。

本資料中，與直徑＞1.0cm小肝癌比較，直徑＜1.0cm微小肝癌的CEUS定量參數AT及TTP明顯增加（P＜0.05），提示微小肝癌組織的超聲造影劑灌注遲于小肝癌。原因可能與微小肝癌直徑體積小，分化程度更高，癌結節內腫瘤細胞組織及血管結構分布更接近正常，異常增生小動脈相對較少，肝動脈供血相對較少，而門靜脈供血相對較多，致使AT、TTP增加，而隨著腫瘤體積增大及分化程度降低，腫瘤內血管結構分布越偏離正常，肝動脈供血越占優勢，血流灌注量不斷增加，造影劑灌注加快，即AT、TTP減小，且隨著腫瘤不斷生長增大，動靜脈瘺形成數量隨之增加，灌注進一步提前［7］。這同時提示不同大小的肝癌結節CEUS定量參數的變化特征與其分化程度以及惡性程度密切相關，有助于腫瘤性質的初步判斷，有利于肝癌的分期。

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4齊錚琴，趙玉珍，楊漪，等 .卵巢腫瘤經陰道彩色多普勒超聲與微血管密度的對比研究，中國醫學影像技術，2006，22（4）：603～605.

5周軍華，趙玉珍，董超，等.原發性肝癌超聲造影定量血流灌注參數與病理微血管密度對比分析.中國超聲醫學雜志，2008，24（1）：47～49.

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Objective To explore the clinical application value of that to check rabbit VX2 liver cancer model using contrast enhanced ultrasound （CEUS）. Methods 30 New Zealand white rabbits were made into VX2 liver cancer model .Respectively performed the conventional ultrasound check and CEUS check .Observed the imaging characteristics of liver cancer model .Obtained and analyzed the CEUS quantitative parameters of tumor tissue in the liver cancer model. And compared with the pathological slice of the liver cancer model . Results Rabbit VX2 liver cancer nodules show the typical enhanced features ："fast forward fast rewind" by CEUS. Compared with neighbour normal liver tissue，the AS，PI，AUC of rabbit VX2 liver cancer tissue were increased obviously （P＜0.05）；the AT、TTP were decreased signifi cantly （P＜0.05）.Compared with conventional ultrasound check，the overall detection rate of rabbit VX2 liver cancer nodules，as well as the sensitivity and accuracy of micro hepato cellular carcinoma（MHCC）、small hepato cellular carcinoma（SHCC） were higher using CEUS check （P＜0.05）. The detection rate of CEUS （85.71%）was higher than conventional ultrasound in MHCC with 0.3 ～ 0.5cm diameter（P＜0.05）.Compared with SHCC with diameter＞1.0 cm，the quantitative parameters of CEUS ：AT、TTP signifi cantly increased （P＜0.05） in MHCC with diameter＜1.0 cm. Conclusions CEUS can provide the information of tiny blood vessels structure in liver cancer，can refl ect the blood perfusion，help detect and diagnose to MHCC、SHCC.

Rabbit VX2 liver cancer model Hepatic cell carcinoma Contrast enhanced ultrasound

浙江省醫藥衛生科技計劃一般研究計劃項目（2013KYB015）

310013 浙江醫院超聲科