谷氨酰胺對饑餓小鼠小腸乳脂肪球上皮生長因子E8表達的影響

張利娟　王穎　夏立亮　吳標　朱莎莎　杜雋銘★

谷氨酰胺對饑餓小鼠小腸乳脂肪球上皮生長因子E8表達的影響

張利娟王穎夏立亮吳標朱莎莎杜雋銘★

目的 觀察谷氨酰胺對饑餓小鼠小腸乳脂肪球上皮生長因子E8（MFG-E8）表達的影響。方法 將25只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組（NC組，n=5），全饑餓組（S組，n=5）和谷氨酰胺灌胃組（G組，n=15）。其中谷氨酰胺灌胃組根據不同的灌胃量［1g/（kg·d）、3g/（kg·d）、5g/（kg·d）］分為3個亞組G1組（n=5）、G3組（n=5）、G5組（n=5）。NC組正常飲食，飲水。S組和G組僅正常飲水。G組給予不同劑量谷氨酰胺水溶液灌胃，1次/d，0.5ml/次，共3次。NC組和S組給予生理鹽水灌胃0.5ml/d。72h后脫頸法處死小鼠，取小腸組織。HE染色觀察小腸絨毛發育；TUNEL法檢測細胞凋亡；實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡法檢測小腸組織MFG-E8mRNA及MFG-E8蛋白表達。結果 饑餓72h后小腸絨毛呈現萎縮狀態，絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積均明顯降低；黏膜上皮細胞凋亡增加；MFG-E8在基因水平和蛋白水平表達均增加。谷氨酰胺灌胃后小腸絨毛萎縮狀態改善，黏膜上皮細胞凋亡減少，MFG-E8mRNA和蛋白均較單純饑餓組降低，且mRNA降低與谷氨酰胺灌胃量呈劑量依賴。結論 MFG-E8可作為饑餓后反映小腸代償功能的標志，MFG-E8升高可能是小腸饑餓損傷后的一種自我保護性反應。

谷氨酰胺 饑餓 小腸絨毛發育 凋亡 乳脂肪球上皮生長因子E8

臨床上食管狹窄、腸瘺或上消化道根治性手術等術后的患者不能進食、不宜進食或不能經消化道直接進食，將導致腸黏膜的廢用狀態，出現腸黏膜饑餓。MFG-E8在維持腸道穩態中發揮重要作用。一方面可促進凋亡細胞的清除［1，2］，另一方面也可以促進腸上皮細胞的再生與修復［3］。本文分析小鼠在饑餓狀態及谷氨酰胺灌胃后小腸的病理改變和MFG-E8的表達變化，探討MFG-E8在小腸黏膜饑餓損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑 L-谷氨酰胺（北京普博欣生物科技有限責任公司）；MFG-E8多克隆抗體（美國R&D公司）；辣根過氧化物酶標記的猴抗山羊IgG（美國Jackson公司）；actin抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（美國Jackson公司）；化學發光檢測（ECL）試劑盒（美國Milipore公司）；細胞凋亡原位檢測試劑盒，POD（德國羅氏公司）。

1.2動物模型制備與分組 雄性C57BL/6小鼠25只（上海交通大學醫學院附屬新華醫院動物房代購），8～10周齡，體重（21±2）g。適應性喂養1周后隨機分為對照組（NC組，n=5），饑餓組（S組，n=5），谷氨酰胺組（G組，n=15）。其中谷氨酰胺灌胃組根據不同的灌胃量［1g/（kg·d）、3g/（kg·d）、5g/（kg·d）］分為3個亞組G1組（n=5）、G3組（n=5）、G5組（n=5）。NC組給予正常飲食、飲水。S和G組僅正常飲水。G組分別予以不同劑量谷氨酰胺水溶液灌胃，0.5ml/次，共3次。NC組和S組給予生理鹽水0.5ml/d灌胃。72h后脫頸法處死小鼠，取小腸組織，一部分多聚甲醛固定，其他標本置液氮中速凍后-80℃凍存備用。

1.3光鏡測小腸絨毛發育 在距回盲部約1cm遠處取約0.5cm長小腸組織，4%多聚甲醛固定24h，后梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片。HE染色切片后應用奧林巴斯（中國）有限公司Cell Sens顯微圖象軟件測定小腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積，并觀察小腸黏膜形態在發育中的變化。

1.4TUNEL法測凋亡 操作步驟按羅氏試劑盒說明書進行。取組織切片常規脫蠟水合，3%H2O2甲醇室溫下封閉10min，3%BSA室溫封閉20min，20μg/ml蛋白酶K作液，室溫反應10min，滴加50μl TUNEL反應混合液（酶反應液與標記液的比例為1：9），濕盒中37℃避光反應1h。再滴加50μl POD轉換液，濕盒中37℃避光濕潤反應30min，DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片。結果判斷：胞核呈現棕黃色為陽性細胞。

1.5Real-Time PCR 總RNA提取采用TRIzol法，按照Invitrogen公司的TRIzol說明書提取細胞總RNA。提取后的總RNA 的濃度及純度用ND-1000（美國NanoDrop Technologies公司）核酸蛋白定量儀測定。提取的RNA（2μg）采用Oligo（dT）引物（上海捷瑞生物工程有限公司）進行逆轉錄反應（反應體系：25μl）。Real-Time PCR反應采用TaKaRa公司的SYBR? Premix Ex taqTMReal-time PCR的操作步驟，在ABI Prism 7300熒光定量PCR儀上檢測。反應體系20μl，擴增條件： 95℃預變性30s，40個循環（95℃5s，60℃31s）， 溶 解 曲 線（95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s）。目的基因及內參照引物序列如下：MFG-E8 forward：5'-CCTTCACCCTTTCCCTCAC-3'，reverse：5'-CACATACCCCAACTTCACTCTT-3'；β-actin：forward：5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3'，reverse：5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'。

1.6MFG-E8蛋白含量測定 采用蛋白質免疫印跡法。用Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate蛋白定量，取蛋白樣本100μg經質量分數為7.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將蛋白電轉移至用甲醇活化后的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1h，用封閉液稀釋MFG-E8多抗（0.1μg/ml）或actin（1：1000）抗體，4℃孵育過夜，含0.05%吐溫（Tween）20的0.05mol/L Tris-NaCl溶液（TBST）洗脫3次，室溫下用辣根過氧化物酶標記的二抗溶液（1：2500）孵育2h，TBST洗脫3次，ECL顯色。

1.7統計學方法 采用SPSS13.0軟件。計量資料以（x±s）表示，行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1一般情況 NC組小鼠一般情況良好，S組小鼠體重下降明顯，饑餓24h體重下降最快。饑餓24h后出現明顯覓食行為，多動；48h毛色失去光澤，掉毛明顯；72h活動明顯減少，但無小鼠死亡。谷氨酰胺灌胃后體重下降較單純饑餓組略減輕，其中3g/（kg·d）組改善最明顯。

2.2光鏡測小腸絨毛發育 對照組小腸黏膜形態未見異常，絨毛濃密，上皮細胞排列整齊（見圖1a）。饑餓組黏膜層厚度變薄，絨毛數量減少、短粗，隱窩上皮細胞缺失，隱窩結構破壞，深度降低、呈萎縮樣改變（見圖1b）。谷氨酰胺灌胃后絨毛生長發育明顯改善，絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積均明顯升高，尤其以灌胃3g/（kg·d）組絨毛發育為佳（見圖1c、1d、1e）。S組小腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積均明顯低于NC組；G3組小腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積均明顯高于S組；G1和G5僅隱窩深度較S組明顯升高（P＜0.01）見圖2。

圖1　光鏡測小腸絨毛

2.3TUNEL法測凋亡 NC組可見一定程度凋亡，但不明顯；S組較NC組凋亡明顯增加，以絨毛頂端為甚，主要為絨毛上皮細胞。G組各亞組凋亡情況相較于S組均減少，G3組為甚，見圖3。

圖2　各組絨毛形態比較

圖3　鏡下凋亡情況

2.4real-time PCR S組 MFGE8mRNA表達高于NC組（P＜0.05）。G組MFG-E8mRNA水平較S組下降，且隨著谷氨酰胺灌胃劑量的增加MFG-E8mRNA降低越明顯，其中G3和G5組與S組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5Western Blot 對照組、饑餓組和谷氨酰胺組小腸組織均有MFG-E8蛋白表達。S組MFG-E8表達高于NC組，G組表達減少。見圖5。

圖4　各組MFG-E8表達比較

圖5　各組Western Blot檢測MFG-E8比較

3　討論

MFG-E8（又名乳凝集素，BA46等）是一種具有EGF1-EGF2-C1-C2樣結構域的分泌型糖蛋白［4］。MFG-E8最初以乳汁脂肪球膜表面的鑲嵌型外周蛋白的形式被發現，近來發現其在幾乎所有組織器官中均有表達，尤其在脾臟和淋巴結表達較多，腸道的表達量相對較少［5］。2002年，MFG-E8促進凋亡細胞被吞噬細胞清除的功能被發現［6］，表明對其的認識到了一個新的臺階，后來一系列研究均證實其在凋亡細胞的清除過程中發揮重要作用。同時，研究發現MFG-E8在維持腸道穩態，促進腸黏膜的修復中發揮重要作用［5，7］，意味著其作為一種新型的潛在的腸道炎癥的治療措施進入人們的視野。Chogle等報道指出在DSS誘導的C57BL/6J小鼠結腸炎的急性期MFG-E8的表達升高，炎癥恢復階段MFG-E8表達下降，在恢復時期給予重組MFG-E8蛋白治療后炎癥減輕并且上皮修復加強［8］。

本資料顯示小鼠饑餓72h后小腸黏膜萎縮，絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積較對照組均有不同程度的下降，這與饑餓后腸道缺少刺激，黏膜細胞更新減少有關。作為血液循環和體內游離氨基酸池中含量最豐富的氨基酸，谷氨酰胺是小腸黏膜細胞的主要能源物質，也是所有快速增殖細胞特別是免疫細胞的能源物質［9］。在饑餓、創傷、感染等病理狀態下，補充外源性谷氨酰胺能夠促進腸黏膜的生長，防止腸黏膜萎縮，維持腸黏膜的完整性［10，11］。本資料顯示谷氨酰胺灌胃后腸黏膜的萎縮狀態得以一定程度改善，小腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積較單純饑餓組均增加。饑餓后黏膜萎縮的同時，作者還發現小腸上皮細胞凋亡的增加。谷氨酰胺灌胃后上皮細胞凋亡的改善進一步驗證谷氨酰胺在腸黏膜應激狀態下可發揮積極作用。同時，作者發現饑餓72h后小鼠小腸MFG-E8蛋白和mRNA均升高，谷氨酰胺灌胃后下降。據此，推測饑餓72h后小腸MFG-E8表達的增高，可能是機體自身的一種代償保護機制：一方面，MFG-E8可促進腸上皮細胞沿隱窩-絨毛軸遷移［3］，使上皮細胞更新率增加以維持黏膜的完整性和上皮的穩態。MFG-E8升高促進小腸黏膜上皮細胞的增生和遷移，修復饑餓后損傷的黏膜屏障，另一方面清除凋亡細胞，避免凋亡細胞累積后發生繼發性壞死，損害機體。谷氨酰胺灌胃后一定程度上改善了小腸的應激狀態，因此MFG-E8表達隨之下降。

本實驗首次揭示饑餓72h后小鼠小腸MFG-E8在基因及蛋白水平的表達均升高，谷氨酰胺灌胃后MFG-E8表達較饑餓組減少。提示MFG-E8可作為小腸饑餓性損傷后自身保護作用的一種代償分子，為今后采取干預措施，防治長期禁食患者的腸道黏膜損傷提供新的思路。

1Aziz M， Jacob A， Matsuda A， et al. Review： milk fat globule-EGF factor 8 expression， function and plausible signal transduction in resolving inflammation. Apoptosis， 2011， 16（11）： 1077～1086.

2Fricker M， Neher J J， Zhao J W， et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. The Journal of Neuroscience， 2012， 32（8）： 2657～2666.

3Bu HF， Zuo XL，Wang X，et al.Milk fat globule-EGF factor 8/ lactadherin plays a crucial role in maintenance and repair of murine intestinal epithelium. J Clin Invest，2007，117（12）：3673～3683.

4Shi J， Gilbert G E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood， 2003，101（7）： 2628～2636.

5Aziz MM， Ishihara S， Mishima Y，et al.MFG-E8 Attenuates Intestinal Inflammation in Murine Experimental Colitis by Modulating Osteopontin-Dependentvβ3 Integrin Signaling.J Immunol，2009，182（11）： 7222～7232.

6Hanayama R， Tanaka M， Miwa K， et al.Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.Nature，2002，417（6885）：182～187.

7Wu R， Dong W， Wang Z， et al. Enhancing apoptotic cell clearance mitigates bacterial translocation and promotes tissue repair after gut ischemia-reperfusion injury. Int J Mol Med. 2012，Sep，30（3）：593～598.

8Chogle A， Bu HF， Wang X， et al. Milk Fat Globule-EGF Factor 8 Is a Critical Protein for Healing of Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Molecular Medicine， 2011， 17（5～6）： 502.

9Reeds PJ， Burrin DG. The gut and amino acid homeostasis. Nutrition，2000，16：666～668.

10Neu J， DeMarco V， Li N. Glutamine： clinical app lications and mechanisms of action. CurrOp in Clin NutrMetab Care， 2002， 5：69275.

11Reeds PJ， Burrin DG. Glutamine and the bowel. J nutr， 2001， 131（9 Suppl）：2505s～2508s.

ObjectiveTo observe the effect of glutamine on intestinal milk fat globule-EGF factor 8 expression on thehungry mice. Methods Twenty-fi ve C57BL/6 male mice were randomly divided into fi ve groups： normal control group （NC，n=5），starvation group （S，n=5）and glutamine group（G，n=15）. G group received Glu 1.0 or 3.0 or 5.0 g/kg by gastric feeding once a day from the day of starvation and named G1 or G3 or G5 group respectively. NC group ate food and drank water freely.S and G group drank water only and were of no food supply.The mice were sacrifi ced in 72 hours after starvation.The intestine specimens were sampled for histological examination by HE staining and cell apoptosis detection by TUNEL assay.The expression of MFG-E8mRNA and protein was measured by Real-Time PCR and Western Blot. Results Starvation resulted in damage to the intestinal mucosa. Villus heights，crypt depths and villus areas were signifi cantly reduced and the intestine epithelial apoptosis was increased.The expression of MFG-E8 protein and mRNA were increased.Glutamine ameliorated villous atrophy and epithelial apoptosis.At the same time，glutamine decreased the MFG-E8 expression compared to S group. ConclusionAs a kind of protective protein which is closely related to intestinal mucosa damage repair，mice intestinal MFG-E8 protein and mRNA expressions increase after starvation and decrease after Glutamine gastric feeding.This suggests MFG-E8 may be a type of protective response to intestinal damages.

Glutamine Starvation Intestinal villus development Apoptosis MFG-E8

200092上海交通大學醫學院附屬新華醫院（張利娟朱莎莎 杜雋銘）201203上海人類基因組研究中心（王穎 夏立亮 吳標）