健脾補腎方對BALBc鼠大腸癌肝轉移VEGF表達影響的實驗研究*

金妙妙　傅健飛

（浙江省金華市中心醫院，浙江金華321000）

·研究報告·

健脾補腎方對BALBc鼠大腸癌肝轉移VEGF表達影響的實驗研究*

金妙妙傅健飛

（浙江省金華市中心醫院，浙江金華321000）

目的探討健脾補腎方對BALBc鼠大腸癌肝轉移血管內皮生長因子（VEGF）表達影響性。方法先對BALBc鼠大腸癌肝轉移進行模型，隨機分成環磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補腎方組，各組均進行各自藥物灌胃處理，每日1次，共2周，檢測每組VEGF表達情況。結果抑瘤率上，生理鹽水組為0，環磷酰胺組為35.40%，健脾補腎方組為29.90%，3組兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）；脾臟指數上，生理鹽水組為（8.97±0.31）mg/g，環磷酰胺組為（8.22±0.14）mg/g，健脾補腎方組為（9.11±0.13）mg/g，生理鹽水組和環磷酰胺組、環磷酰胺組和健脾補腎方組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；VEGF表達率上，生理鹽水組“-”“+”“++”分別占8.33%、8.33%、83.33%，環磷酰胺組分別占41.67%、25.00%、33.33%，健脾補腎方組分別占33.33%、25.00%、41.67%，環磷酰胺組和健脾補腎方組VEGF表達比較差異無統計學意義（P＞0.05），而生理鹽水組和環磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補腎組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論健脾補腎方能通過降低BALBc鼠大腸癌肝轉移VEGF表達提高臨床效果。

健脾補腎方BALBc鼠大腸癌肝轉移血管內皮生長因子

結直腸癌是臨床上常見惡性腫瘤，其中肝轉移是造成死亡的最常見原因。研究［1］稱，血管內皮生長因子（VEGF）是結直腸癌肝轉移特異性指標。中醫學認為，大腸癌肝轉移是本虛標實證，素體正氣不足，加上飲食不潔、脾腎虧虛、內生痰濕，滯留腸道氣機受阻，運行不暢阻于脈絡后形成大腸癌，隨著病情日漸惡化，濕毒瘀滯造成正氣日漸虧虛，在臨床上常見是脾腎兩虛證，其中正虛表現為脾虛和腎虛，邪實是熱毒、瘀血和濕熱等外在原因造成，故其主要原因是脾腎虧虛。本次研究就觀察健脾補腎方對BALBc鼠大腸癌肝轉移VEGF表達影響性，以期尋找其中相關性，提高臨床診治水平。現報告如下。

1　資料與方法

1.1動物與細胞隨機選取36只BALBc小鼠為研究對象，分成3組，每組12只，均為雄性，平均體質量（50.00±10.00）g，均購自中山大學實驗動物中心提供，合格證編號為20130112C。選用細胞為結腸癌細胞株CT26細胞，保證選用細胞為50代以內對數生長期CT26細胞。

1.2試劑與儀器健脾補腎方，藥物組成為黃芪30 g，白術15 g，熟地黃15 g，補骨脂10 g，蛇六谷15 g，神曲20 g，甘草6 g等，均由上海中醫藥大學附屬醫院提供，雙蒸水震蕩混勻，使用超聲促使藥物混合均勻，每毫升藥液含0.2185 g生藥，-20℃冰箱內保存。環磷酰胺（國藥準字H22022988，通化茂祥制藥有限公司）200 mg混合0.9%氯化鈉注射液20 mL備用。VEGF抗體購自美國西門子公司，凝膠制備試劑盒、蛋白抽取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒等均購自天云生物技術有限公司。高精確電子天平、臺式高速冷凍離心機、電熱恒溫水浴鍋等均購自南京天科生物科技有限公司提供。

1.3分組與造模隨機將小鼠分成環磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補腎方組，每組12只。取已禁食12 h的小鼠麻醉后在背側中部、左側腋中線和腋后線間，取1.5 cm切口進入腹腔內，暴露脾臟，按0.2 mL/只注入對數生長期大腸癌CT26細胞懸液，按壓無出血后將脾臟置于原位，縫合腹壁，直至出現肝轉移。

1.4給藥方法造模后對每組予相應藥物治療，生理鹽水組予0.9%氯化鈉注射液0.4 mL；環磷酰胺組予環磷酰胺20 mg/kg；健脾補腎方組予健脾補腎方0.2 mL。各組均每日灌胃治療1次，持續兩周。

1.5標本采集及檢測1）給藥2周后停藥1 d，處死小鼠，剝離瘤塊標本，用0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，用濾紙吸干表面水分，稱瘤質量，計算抑瘤率，抑瘤率=1-（試驗組平均瘤質量/生理鹽水組瘤質量）。2）分離脾臟后用電子天平秤質量，計算脾臟指數，指數=脾臟質量/小鼠體質量。用免疫組化法檢測腫瘤細胞VEGF表達情況。3）分離腫瘤組織，用甲醛固定1 d，取腫瘤組織切成小塊流水沖洗30 min，經脫水-透明-浸蠟-包埋制成腫瘤組織石蠟標本。將石蠟用且片機切片，厚度為4 μm，切片經3次PBS清洗后滴加三抗，DAB顯色，復染、透明后封片。VEGF陽性表達采用SP免疫組化染色進行檢測，以出現棕黃色顆粒為陽性，陽性表達結合相關文獻［2］進行計分。計分由兩部分組成，一部分為細胞染色強度計分，不顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按顯色細胞比例計分，1/3以下為1分，1/3～2/3為2分，2/3以上為3分。積分數為以上兩部分乘積，陰性為乘積0分（“-”表示），弱陽性為乘積1～4分、低表達（“+”表示），兩者乘積在4分以上為強陽性，高表達（“++”表示）。

1.6統計學處理采用SPSS17.0統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，并對數據采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組抑瘤率指標比較見表1。各組抑瘤率比較，生理鹽水組和環磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補腎方組、環磷酰胺組和健脾補腎方組在抑瘤率上比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1　各組瘤質量、抑瘤率、脾臟指數比較

2.2各組脾臟指數比較各組比較，生理鹽水組和環磷酰胺組、環磷酰胺組和健脾補腎方組在脾臟指數上比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），而生理鹽水組和健脾補腎方組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3各組VEGF表達比較見表2。結果為生理鹽水組和環磷酰胺組、生理鹽水組和健脾補腎方組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而環磷酰胺組和健脾補腎方組VEGF表達比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2　各組VEGF表達比較n（%）

3　討論

雖然中醫學無大腸癌肝轉移確切病名，但古籍有記載“臟毒者，蘊毒流注肛門結成腫塊，有虛勞久嗽，痰火結腫，肛門如栗者，破必成漏，瀝盡氣血必亡”。中醫學認為瘀毒內結、脾氣虧虛、氣滯血瘀是腫瘤轉移的基本病機。研究［3］稱，健脾補腎能提高機體免疫力，能抑制腫瘤生長和復發轉移，對腫瘤血管生成有明顯抑制作用。

在本次研究中，以黃芪和補骨脂為君藥，黃芪有行氣健脾功效，補骨脂有溫補脾腎效果，兩者共用能達到VEGF是目前為止發現的可溶性最強，特異性最高的微血管生長正向調節因子，其能改善細胞外基質，增加微血管通透性，降解并轉化膠原結締組織，為腫瘤生成、侵襲和轉移提供適合基礎［6-7］。本次結果顯示，健脾補腎方組在VEGF表達上明顯低于生理鹽水組，這說明健脾補腎方能降低VEGF表達從而降低大腸癌浸潤和轉移。研究［8］稱，VEGF和腸癌分化程度、浸潤程度、轉移情況等均有相關性，分化程度越低、浸潤轉移越遠，其表達也相對越高。有研究［9］指出，黃芪皂苷能下調VEGF水平從而達到和環磷酰胺同樣的抗腫瘤效果，這在本次研究中有所體現，這說明了健脾補腎方能通過下調大腸癌肝轉移的VEGF因子表達從而達到抑制腫瘤生長、浸潤作用。

健脾補腎之能；白術是益氣健脾常用藥物，熟地黃可滋補腎陰，填精益髓；蛇六谷能散結消腫、燥濕化痰，神曲則消食，配合甘草調和諸藥，共達到補脾氣、填腎精、消結節等功效，能提高患者生存質量，減少復發和轉移［4］。現代藥理學認為，補骨脂能抑制癌細胞糖代謝，核酸代謝和能量代謝等，從而達到抗腫瘤效果；白術能促使淋巴細胞壽命延長，起到免疫調節作用，白術多糖能調節淋巴細胞功能和抗腫瘤作用；熟地黃能降低膜磷脂代謝并改善脂肪酸組成，影響細胞表面特性并轉運膜代謝，從而抑制腫瘤細胞增殖產生抗腫瘤作用［5］；黃芪對人體有雙向調節作用，蛇六谷能通過影響癌細胞能量代謝從而抑制腫瘤生長。結果看出，應用健脾補腎方治療后，患者在脾臟指數和抑瘤率上明顯得到改善，這說明了中醫藥對大腸癌肝轉移有很好療效。

伴隨著惡性腫瘤在臨床上發病率越來越高，中醫藥治療已經成為綜合治療很大一部分，中醫藥能提高患者對化療等耐藥性，改善生活質量，緩解不良反應，能減少手術后的腫瘤復發和轉移［10］，在一定程度上能延長患者生存時間，故有很大的實際臨床意義。

［1］周麗萍，馬科，馬治國，等.健脾補腎方對小鼠Lewis肺癌抑制作用及對VEGF、CD44V6表達的影響［J］.寧夏醫科大學學報，2012，34（4）：319-322.

［2］王希勝，肖紅艮.健脾補腎方對Lewis肺癌移植瘤小鼠EGFR和VEGF表達的實驗研究［C］.2013年全國中醫腫瘤學術年會論文集，2013：395-398.

［3］周麗萍.健脾補腎方對小鼠Lewis肺癌生長抑制作用及其機制的實驗研究［D］.銀川：寧夏醫科大學，2012.

［4］肖紅根.健脾補腎方對Lewis肺癌移植瘤小鼠EGFR和VEGF表達的實驗研究［D］.咸陽：陜西中醫學院，2013.

［5］高軍，高國蘭，余筱琳，等.P53和VEGF在SKOV3荷瘤裸鼠不良心理應激模型血清及移植瘤中的表達及意義［J］.天津醫藥，2012，38（12）：1072-1075.

［6］秦躍紅，王功朝，劉濱，等.星形細胞腫瘤組織中VEGF-A、VEGF-C的表達變化及其與腫瘤血管生成的關系［J］.山東醫藥，2014，2（15）：1-3.

［7］宋冀東，閆繼東.Smad4和VEGF在人非小細胞肺癌組織中的表達及其相關性分析［J］.中國實驗診斷學，2014，5（11）：1781-1784.

［8］馬科，吳學勤，周麗萍，等.健脾補腎方對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞抑制作用及對Ki-67表達影響的研究［J］.時珍國醫國藥，2012，23（9）：2176-2177.

［9］董妙.健脾補腎方對Lewis肺癌移植瘤小鼠COX-2和PTTG表達的影響［D］.咸陽：陜西中醫學院，2014.

［10］張正，嚴燦，李艷，等.反復心理應激大鼠下丘腦及腦海馬氨基酸含量變化及調肝方、健脾方、補腎方、人參總皂苷作用的比較［J］.中國臨床康復，2012，9（48）：179-181.

Experimental Study of Jianpi Bushen Decoction on the Expression of VEGF in BALBc Rat with Liver Metastasis of Colorectal Cancer

Metastasis of Colorectal Cancer
JIN Miaomiao，FU Jianfei.Central Hospital of Jinhua City，Zhejiang Province，Zhejiang，Jinhua 321000，China

Objective：To investigate the effects of Jianpi Bushen Decoction on the expression of VEGF in BALBc rat with liver metastasis of colorectal cancer.Methods：At first，BALBc mouse model was made with liver metastasis of colorectal cancer，and randomly divided into the cyclophosphamide group，the saline group and Jianpi Bushen Decoction groups.Each group was treated with drug perfusion once per day，lasting for 2 weeks，and the expression of VEGF was detected.Results：As for the inhibition rate，the saline group was 0，the cyclophosphamide group 35.4%，Jianpi Bushen Decoction group 29.9%，with statistical significance（P＜0.05）；as for the spleen index，the saline group was（8.97±0.31）mg/g，the cyclophosphamide group（8.22±0.14）mg/g，Jianpi Bushen Decoction group（9.11±0.13）mg/g；there was statistical significance between the saline group and the cyclophosphamide group，and between the cyclophosphamide group and Jianpi Bushen Decoction group（P＜0.05）. As for the expression of VEGF，-，+，+of the saline group was respectively 8.33%，8.33%and 83.33%，the cyclophosphamide group 41.67%%，25.00%and 33.33%，Jianpi Bushen Decoction group 33.33%，25%，41.67%. The difference in the cyclophosphamide group and Jianpi Bushen Decoction group in VEGF expression was not statistically significant（P＞0.05），while the difference between the two groups was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：spleen and kidney in order by reducing BALBc mouse VEGF expression in colorectal liver metastases improve clinical results.

Jianpi Bushen Decoction；BALBc mouse；Liver metastasis of colorectal cancer；Vascular endothelial growth factor

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1906-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.008

2015-05-01）

·急癥建設管理·

浙江省自然科學基金項目（LY13H190006）