泌尿生殖道支原體感染檢測及藥敏分析進展

毛得斌

【關鍵詞】 泌尿生殖道；支原體感染檢測；藥敏分析

中圖分類號：R518.5 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.05.029

近年隨著時代的變遷，泌尿生殖道支原體感染發病率呈上升趨勢，現已成為臨床上最常見的性傳播疾病之一，其傳播速度快、感染性極強，影響了人們的健康及正常生活狀態[1]。近年來在治療泌尿生殖支原體感染過程中，由于抗生素的不合理使用，臨床分離株耐藥性日益嚴重，抗菌藥物治療效果下降，經驗用藥治療失敗病例不斷增多。本文從泌尿生殖道支原體感染的檢測和藥敏分析進行綜述如下。

1 泌尿生殖道支原體的概念及其臨床意義

支原體是目前最簡單的原核生物，多以球體的形式存在，體內依然有DNA、RNA和蛋白質等基礎物質。其中在特定環境下，解脲支原體（Uu）、人型支原體（Mh）以及生殖支原體（Mg）可導致非特異性尿道炎（NGU）、慢性前列腺炎、附睪炎等疾病[2]。其釋放的侵襲性酶和毒性產物有可能成為致病物質[3]。此類患者大多年齡在22～55歲，其感染人群更集中在性生活比較活躍的年輕人，也表明了此病在不潔性行為傳播比較頻繁[4，5]。以上表明，泌尿生殖道支原體感染檢測對性病防治及優生保健工作有重要的指導意義。

2 泌尿生殖道支原體感染的檢測方法

泌尿生殖系統感染的檢測方法有經典的液體培養法、固體培養法，但隨著微生物學、免疫學、分子生物學的發展，像金標免疫斑點法、聚合酶鏈式反應（PCR）、熒光定量PCR（FQPCR）、連接酶鏈反應、熒光核酸恒溫擴增技術（SAT）、恒溫擴增試紙條技術（LAMP）、反向斑點雜交技術（RDB）等新手段讓泌尿生殖道支原體感染的檢測走進了更深的層次。

2.1 液體培養法

作為WHO推薦診斷NGU的首選方法，液體培養法對實驗條件要求不高，而且操作簡便、快捷。其最常應用的是鑒定藥敏一體化試劑盒法，目前國內很多醫院的實驗室普遍采用肉湯體液培養法檢測泌尿生殖道感染，以肉湯顏色改變來判斷結果。其原理是肉湯培養液中含有酚紅指示劑和尿素。泌尿生殖道支原體在生長過程中產生的尿素酶分解尿素或精氨酸產堿時，使培養液堿化而變紅色，再過24～48 h來判讀陽性結果。由于泌尿生殖道標本菌群復雜，混雜的腸桿菌、真菌（白色念珠菌）及某些葡萄球菌也能分解尿素，如果不能被液體中抑制劑抑制，在其倒置繁殖過程中分解尿素可導致培養液變紅，從而引起檢測的假陽性[6]。有研究發現即使培養基中加入青霉素以抑制細菌生長，但隨著細菌耐藥率的增高，仍有部分耐藥菌在培養液中大量繁殖[7]；此外當不產脲酶真菌濃度高時，支原體與真菌混合感染培養液明顯渾濁，可能造成假陰性。因此要提高泌尿生殖支原體檢測的準確率，降低假陽性率，不僅培養基中抗生素的配制要合理，而且培養液中要選擇有效抑制真菌的抑制劑，控制假陰性的產生。

2.2 固體培養法

固體培養法檢出率較低，不能用于藥敏試驗，而且檢測成本相對昂貴。但由于其特異性高，可作為確診的標準。該法能形成“油煎蛋”樣特征菌落和經典的棕褐色顆粒菌落，顯示支原體生長。由于固體培養過程中需要CO2，藥敏試驗需要培養后再轉種，導致使用成本高、耗時長，制約了其在臨床上的廣泛應用。上海同濟大學程瓊等學者[8]研制的一種固體培養基中增加血清含量，添加含有多胨等基礎營養成分和0.9%瓊脂，添加促進支原體生長的細胞培養液（10%DMEM）；除傳統的青霉素外，抑菌劑還添加了非抗生素類抑菌成分；操作中將150 μL（5～6滴）的洗脫液在新型固體培養基上均勻平鋪，標記好后置于CO2培養箱中孵育，保持培養箱37℃恒溫，每24 h、48 h各觀察一次，培養48 h后，用低倍鏡進行觀察。周良佳等[9]研究發現該新型固體培養基的優點在于靈敏度高，選擇性強，支原體菌落出現早，檢測限低，微生物診斷的直接證據是通過顯微鏡觀察支原體特有的菌落形態，在傳統培養基的基礎上新型固體培養基增加血清含量，添加了促進支原體生長的細胞培養液（10%DMEM），使培養周期縮短。由于支原體菌落較小而無法用肉眼看到，所以需要用顯微鏡等觀測儀器進行觀察，且雜菌具有較高的污染率，有時會影響鏡下觀察效果導致假陰性判斷，因此應在防治真菌污染方面做進一步的分析研究。

2.3 金標免疫斑點法

又稱為ELISA法或金標法，根據抗原抗體反應來檢測特異性結合試劑的原理進行支原體檢測。臨床上對Uu常采用金標準方法，用于檢測Uu抗原的金標快速檢測試劑盒已經商品化，使得Uu感染患者的抗血清抗體能快捷檢測出來，可作為人群支原體感染的醫療檢測或篩選方法。由于正常人也存在低滴度的抗體水平，根據抗體測定法，將無法對患者是現癥感染還是既往感染做出有效的判斷，由于目前國內檢測支原體抗體試劑都是定性試劑，這就對支原體抗體試劑的定量化檢測有一定的要求。此外，即使患者在接受對癥治療后，血清抗支原體抗體不太可能在短時間內消失很多。因此，使用金標準方法復查治療后患者的治療效果，其結果多是陽性，可能會對臨床診斷產生誤導。

2.4 PCR

Uu感染中被識別的主要抗原為B（multiple banded）抗原，N端包含血清特異的和交叉反應的抗原決定簇[10]。取Uu陽性培養物根據MB基因序列設計的引物可進行PCR分型鑒定。由于PCR不受細菌存活與否的限制，且具有高敏感性及特異性，近幾年來被廣泛用于臨床標本Uu的檢測，使那些不能培養或很難培養的微生物也得到快速診斷，但是較難解決混合感染的問題。由于在實驗過程中產物易污染，對實驗條件、試劑及操作人員要求較高。

2.5 FQPCR

該法通過熒光探針直接檢測病原體的特異DNA判斷是否有病原體存在，其靈敏度及特異度高，且快速簡便，該技術具有熒光技術和閉管檢測以及自動分析結果功能，使得PCR擴增產物的污染能定量，具有極高的使用價值。PCR擴增Ct的靶基因主要有MOMP、隱蔽性質粒基因和rRNA基因三種，隱蔽性質?；蛎舾行宰罡?。Uu的16sRNA、脲酶基因、MB抗原基因為Uu擴增的靶基因[11]。張中華等[12]采用三種方法檢測泌尿生殖道支原體，其中FQPCR法靈敏度高達95.3%，ROC曲線也證實其診斷價值高于另外的兩種檢測方法。實驗研究階段的FQPCR現已進入臨床應用階段，逐漸成為臨床快速診斷的重要技術。endprint

2.6 SAT

該技術核酸擴增在42℃下進行，直接以病原體特異性RNA為擴增靶標，以擴增產物RNA為檢測靶標，15～30分鐘即可將模板擴增109倍，其檢測靈敏度和準確性遠高于其他核酸檢測技術，SAT采用MMLV逆轉錄酶和T7RNA多聚酶進行核酸擴增，反應抑制物有效減少，假陰性結果也有效下降。擴增產物的污染是核酸檢測的控制難點。SAT采用實時熒光閉管檢測，擴增產物為RNA，其在環境中易降解，有效控制污染，從而使檢測結果大幅提高。鄭雅萍等[13]研究發現，在初診、未經治療的患者病原體檢測中SAT和FQPCR均可作為判斷病原體感染的方法，且作用相當，但FQPCR在治療過程中，不能排除患者治療后病灶處已經死亡的病原體殘留的DNA對檢測結果的影響，而SAT只檢測病原體的RNA，而完整的RNA片段只存在于活的病原體中，因此治療后SAT能有效排除病灶處已經死亡的病原體，有利于臨床治療后的療效觀察及愈后判斷，避免過度治療。

2.7 LAMP

該法是基因擴增技術和免疫層析技術相結合建立的一種新型的檢測解脲支原體的方法，具有反應時間短、特異性強、擴增效率高等優點，擴增1～10個拷貝的目的基因能夠在1 h內完成，其擴增效率為普通PCR的10～100倍。潘克女等[14]基于環介導恒溫擴增技術，根據解脲支原體序列特征設計對引物進行解脲支原體DNA切口酶核酸恒溫擴增，擴增過程在一對引物中標記生物素，隨著擴增的進行生物素直接引入擴增片段中，擴增結束后產物在密閉裝置中進行免疫試紙條顯色反應，根據顯色卡的顏色判定結果的陰陽性。該技術檢測解脲支原體的靈敏度較實時熒光PCR技術要高10倍以上，其特異性與實時熒光PCR技術相當。由于該技術不需要昂貴的特殊儀器，試劑成本低，具有較高的臨床應用價值，可在各級醫院開展。

2.8 RDB

該技術是利用堿基互補配對原理，特異性探針與擴增的靶基因互補結合，產生一種雜交信號，該技術以其高通量、簡便快捷等優點在多種病原體的快速檢測中優勢明顯[15]。石正琪等[16]利用RDB技術結合多重PCR方法可單管擴增并可同時進行多種病原體的檢測，該方法通過GenBank獲取相關基因序列，并對gD糖蛋白基因和保守序列16SrRNA進行對比，設計2對通用引物，分別擴增HSV1、HSV2的gD糖蛋白基因和Ng、Ct、Mg的16SrRNA基因。該研究證實通用引物的保守性，結合寡核苷酸的特異性和減少多病原體DNA擴增中的引物對數，以達到對病原體的鑒定，同時優化雙重PCR和雜交的反應條件，使其具有很好的雜交強度和擴增效率，這種方法具有較高的檢出率，能同時檢測多種病原體，在病因學篩查和性病的快速診斷等方面意義重大。

3 泌尿生殖道支原體感染的藥敏分析

3.1 喹諾酮類藥物的作用機理

由于支原體無細胞壁，所以β內酰胺類抑制細胞壁合成的抗菌藥對其無效，環丙沙星、氧氟沙星等是Uu、Mh、Mg耐藥率較高的抗生素，主要是通過抑制脲支原體屬DNA回旋酶來破壞DNA合成，通過干擾脲支原體屬生長而達到抗菌的效果[17]。由于喹諾酮類藥物的濫用，位于支原體屬染色體上的旋轉酶基因發生突變，導致支原體DNA旋轉酶靶位發生改變，從而使喹諾酮類藥物阻斷支原體DNA的復制能力降低[18]。

3.2 常見抗生素耐藥的原因

由于支原體對影響細胞蛋白合成的抗生素非常敏感，在臨床上大多數醫療機構都會選擇一些核蛋白體、抑制或影響菌體蛋白合成的抗生素，如四環素、大環內酯類抗生素。有研究證實Uu可以形成生物膜[19～21]，可以改變細菌表面細胞膜的通透性，細菌可以采用各種不同方式阻止抗生素進入細菌內部，這樣抗生素也不能輕易地滲透到細菌內，因此生物膜的形成使Uu對大環內酯類、喹諾酮類、四環素類等多種常用抗生素的抵抗力也有所增強。

3.3 大環內酯類抗生素藥敏分析

目前，國外性傳播疾?。⊿TD）治療指南推薦大環內酯類抗生素作為治療Mg陽性男性非淋菌性尿道炎的一線方案[22]，但有研究證實[23，24]，阿奇霉素1 g單劑量療法對Mg感染的清除率僅為67%～84%，這一現象可能反映阿奇霉素誘導Mg對大環內酯類抗生素耐藥性的出現，也提示了人群中已經存在對大環內酯類抗生素耐藥性的Mg。交沙霉素等類似藥物在人體的胃酸中穩定性極差，很容易被分解，人體胃腸反應較大，對其使用有一定的局限性。

3.4 半合成四環素的藥敏分析及作用機理

作為半合成四環素類抗生素，多西環素及米諾環素半衰期長，藥品脂溶性很高，容易滲透很多組織液或體液，能在核糖體水平抑制細菌蛋白質合成達到抑菌作用。它是通過阻斷氨酰基和核糖核蛋白體的合體，并且讓肽鏈的增長以及合成蛋白質的速度減慢甚至降至零，從而達到抑制細菌成長的作用。

3.5 支原體感染首選藥物

國內學者[25，26]研究發現，大環內酯類、喹諾酮類及四環素類抗生素是目前用于泌尿生殖道支原體感染治療的主要藥物，但無論是Uu單一感染還是Uu+MH混合感染，患者對喹諾酮類藥物的敏感性絕大部分都低于40%，藥敏實驗中米諾環素、交沙霉素、多西環素對Uu及Mh敏感率較高，其較高的體外抗菌活性，可用于支原體屬感染的首選用藥。

綜上所述，隨著科學技術的進步，泌尿生殖道支原體感染檢測水平不斷發展。目前各種檢測方法中，液體培養法可作為支原體感染的初篩手段，但需要固體培養法作為確診標準；PCR敏感性高但特異性稍差，易產生假陽性；FQPCR靈敏度及特異度高，但無法同時進行藥敏試驗；SAT、LAMP、RDB具有高通量、快速簡便等特點，是未來快速診斷、鑒定和病因學篩查的重要檢查方法。目前在治療泌尿生殖道支原體感染藥物中，喹諾酮類藥物敏感性差，已不適合作為經驗用藥的選擇，米諾環素、交沙霉素、多西環素可作為治療支原體感染的首選藥物。醫療機構應認真監測泌尿生殖道支原體藥物敏感試驗結果，分析其耐藥性變化，根據各地區耐藥及藥敏情況合理使用敏感抗菌藥物，對減少和防止耐藥菌株的產生和疾病傳播具有重要的意義。endprint

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（收稿日期：2015-07-17 修回日期：2015-10-25）

（編輯：潘明志）endprint