腺病毒介導IL-24基因誘導皮膚鱗狀細胞癌細胞COLO 16的凋亡

馬欣欣 張孟麗 李玲君 曹玉萍 吳秋菊 馬鵬程

腺病毒介導IL-24基因誘導皮膚鱗狀細胞癌細胞COLO 16的凋亡

馬欣欣 張孟麗 李玲君 曹玉萍 吳秋菊 馬鵬程

目的 探討腺病毒介導IL-24基因表達載體（Ad-IL-24）對皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）細胞COLO 16的凋亡的影響，并探討其作用機制。方法 將構建的Ad-IL-24腺病毒感染COLO 16細胞，qPCR法檢測IL-24基因的表達，MTT法檢測IL-24過表達對細胞生長的影響，流式細胞儀檢測IL-24過表達對COLO 16細胞凋亡的影響，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察在IL-24過表達后COLO 16細胞凋亡的形態變化，Western印跡檢測Bax，Bcl-2以及活化的caspase 3蛋白水平，qPCR法檢測Bax、Bcl-2基因mRNA的表達，免疫熒光方法，檢測IL-24過表達后Bax，Bcl-2的表達情況。結果 MTT結果顯示，Ad-IL-24組的細胞從第4天開始出現明顯抑制，第6天差異最明顯（P＜0.05），并呈現時間依賴性，而Ad-GFP組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。流式細胞儀顯示，Ad-IL-24組的COLO 16細胞凋亡率（13.10±0.92）%，顯著高于對照組（3.69±0.36）%（P＜0.05）和空載體組（3.39±1.06）%（P＜0.05），后兩組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。激光掃描共聚焦顯微鏡顯示，Ad-IL-24組細胞加速凋亡。免疫熒光、Western印跡法和QPCR法結果顯示，IL-24過表達后Bax在細胞中的表達明顯升高，而Bcl-2在細胞中的表達卻明顯下降。Western印跡法和qPCR法顯示，Ad-IL-24組的Bax、Bcl-2的蛋白及mRNA水平分別與對照組和空載組比較，出現了明顯的上升和下降，在蛋白水平上產生與抗cleaved caspase 3抗體結合的特異性條帶。結論 Ad-IL-24可誘導鱗癌細胞COLO 16細胞凋亡，其機制可能與上調Bax基因、下調Bcl-2基因表達，并活化caspase 3有關。

腫瘤，鱗狀細胞；白細胞介素24；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；COLO-16

皮膚鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）是起源于表皮或附屬器角質形成細胞的一種惡性腫瘤，發生轉移的風險為2%～3%，是最常見的非黑素瘤皮膚癌。關于鱗癌的發病機制普遍認為與紫外線及化學藥物等有關，但關于其發病的分子機制尚不清楚［1］。IL-24又稱黑素分化相關基因7（MDA-7），主要由黑素瘤細胞和巨核細胞產生，是Jiang等［2］于1995年發現，由于其染色體定位在IL-10家族的基因族［3］；IL-24具有抑制多種腫瘤細胞生長和腫瘤新血管形成并誘導凋亡功能［4-7］，但不會影響正常細胞［4］。本實驗用腺病毒介導IL-24基因表達載體，研究其對人鱗癌細胞COLO 16的生長抑制和致凋亡作用，并探討Ad-IL-24對鱗癌作用的分子機制，為鱗癌的基因治療提供實驗依據。

資料與方法

一、資料

人鱗癌細胞COLO 16為本實驗室保存。由漢恒生物科技（上海）有限公司提供攜帶白介素24（IL-24）的腺病毒表達載體（Ad-IL-24）、以及腺病毒Ad-GFP體（Ad-GFP）。噻唑藍（MTT）［西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］。引物設計及合成［英濰捷基（上海）貿易有限公司］（表1）。FastStart Universal SYBRGreenMaster（美國Roche公司），碘化丙錠（PI）染色試劑盒（美國Southern Biothech公司），FITC-annexinV染色試劑盒（上海吉凱基因化學技術有限公司），AlexaFluor594熒光染料（美國Lifetechnologies公司），cleavedcaspase3一抗（美國CellSignalling公司，Bcl-2和Bax一抗（美國Abcam公司）。

表1 PCR引物序列

二、方法

1.細胞培養以及腺病毒感染：COLO 16細胞的培養基為含10%小牛血清的DMEM完全培養基，細胞置于含5%CO2的細胞培養箱中，在37℃、相對飽和濕度95%條件下培養。實驗分3組：①Ad-IL-24組：將細胞接種于96孔板，當細胞融合率達到50%時，換液，再加入攜帶IL-24的腺病毒表達載體Ad-IL-24后培養2 h，換液后供使用；②Ad-GFP組：將細胞接種于96孔板，當細胞匯合率達到50%時，細胞換液，再加入腺病毒Ad-GFP體Ad-GFP后培養2 h，換液后供本實驗使用；③空白組：未做任何處理的COLO 16細胞。參照漢恒生物公司腺病毒感染手冊，貼壁細胞加入的病毒范圍在MOI=20～ 50內，經預實驗摸索，本實驗每組均加入病毒量為MOI=40。

2.qPCR法檢測：上述3組細胞于37℃、5%CO2條件下繼續培養72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態變化。收集感染72 h后的COLO 16細胞，PBS洗滌3次，按RNA抽提試劑盒說明書提取細胞總RNA，吸去培養基，PBS洗細胞1次，加入RNAiso Plus裂解細胞，并按照提取步驟提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄生成cDNA，進行實時PCR反應，步驟參照FastStart Universal SYBR Green Master說明書。

3.MTT法檢測：將對數生長期的COLO 16細胞按1×104/孔的密度接種于96孔板，實驗分組及處理方法同上。分別于0、1～6 d加MTT每孔10 μl，繼續孵育4 h后加入溶解劑DMSO 150 μl，在微量振蕩儀上適度振蕩8 min，用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度，繪制生長曲線。

4.流式細胞儀檢測：實驗分組及處理方法同2。培養72 h后，收集細胞懸液，PB洗滌3次，70%冷乙醇固定后，加入PI等試劑，流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期變化。

5.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：實驗分組及處理方法同2。PI染色：培養72 h后，收集細胞懸液，PBS洗滌3次，4%甲醛固定，按照FITC-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒說明操作，每孔加入binding buffer 100 μl和Annexin V 2 μl，室溫下孵育10 min。DAPI染色：細胞培養72 h后，將一定濃度的DAPI加入培養基中與細胞共同孵育過夜，再用PBS緩沖液漂洗6次。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態改變以檢測細胞的早期和晚期凋亡。

6.Western印跡檢測：實驗分組及處理方法同2。培養72 h后，收集細胞，加細胞裂解液進行充分裂解，離心，取總蛋白上清，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；然后將凝膠蛋白轉移到硝酸纖維膜上，經5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；加入兔抗人Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3，37℃孵育1 h，TBST洗滌；再加山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌后將NC膜與發光工作液充分接觸，室溫孵育3 rain，暗室進行壓片、曝光、顯影和定影。

7.qPCR法檢測：實驗分組及處理方法同2。培養72 h后，按試劑盒說明步驟抽提細胞總RNA，經反轉錄獲得cDNA。進行實時PCR，具體步驟參照FastStart Universal SYBR Green Master試劑說明書。

8.免疫熒光方法檢測：實驗分組及處理方法同2。培養72 h后，PBS洗滌3次，4%甲醛固定10 min，透化液處理30 min，加入兔抗人Bax、Bcl-2，4℃孵育過夜，CONTROL洗滌；再加山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，封片，留待鏡下觀察。

三、統計學處理

結果

一、IL-24腺病毒轉染效率的驗證

將Ad-IL-24、Ad-GFP感染COLO 16細胞，72 h收細胞進行定量PCR試驗，檢測病毒效價（圖1）。感染了Ad-IL-24的細胞中，IL-24基因的表達較感染Ad-GFP以及空白組有明顯上升（P＜0.05）。

圖1 各組COLO 16細胞中IL-24基因的表達情況 a：與空白組比較，P＞0.05；b：與空白組比較，P＜0.05

二、Ad-IL-24對COLO 16細胞增殖的影響

圖2 可見，第1～3天，3個組間的細胞增殖差異無統計學意義；第4天開始，Ad-IL-24組的細胞增殖顯著低于Ad-GFP組和空白組（P＜0.05），第6天差異最大，并在4 d后Ad-GFP組細胞呈現時間依賴性抑制；而Ad-GFP組與空白組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 MTT法檢測Ad-IL-24對COLO 16細胞生長的抑制 第1～3天，3個組間的細胞增殖差異無統計學意義；第4天開始，Ad-IL-24組的細胞增殖顯著低于Ad-GFP組和空白組（P＜0.05），第6天差異最大，并在4 d后Ad-GFP組細胞呈現時間依賴性抑制；而Ad-GFP組與空白組間的差異無統計學意義（P＞0.05）

三、Ad-IL-24對COLO 16細胞的凋亡的影響

經流式細胞儀檢測（圖3）發現，Ad-IL-24組COLO 16細胞凋亡率（13.10±0.92）%，顯著高于空白組凋亡率（3.69±0.36）%（P＜0.05）和Ad-GFP組凋亡率（3.39±1.06）%（P＜0.05），而空白組與Ad-GFP組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。圖3顯示，Ad-IL-24組的細胞早期凋亡（右下方）與空白組和Ad-GFP組有一定差異，而晚期凋亡（右上方）更明顯。

圖3 Ad-IL-24對COLO 16細胞凋亡的影響 Ad-IL-24組細胞凋亡率（13.1±0.92）%，顯著高于空白組凋亡率（3.69±O.36）%（P＜0.05）和Ad-GFP組凋亡率（3.39±1.06）%（P＜0.05），Ad-IL-24組的細胞早期凋亡（右下方）與空白組和Ad-GFP組有一定差異，而晚期凋亡（右上方）更明顯

四、Ad-IL-24病毒感染人鱗癌細胞COLO 16后的細胞形態學變化

感染Ad-IL-24病毒的COLO 16細胞，72 h后可出現明顯的細胞毒性（圖4A），細胞變圓，聚集成團，部分細胞漂浮，數量明顯減少，Ad-GFP組和空白組COLO 16細胞呈貼壁生長，狀態良好，形態完整。分別對空白組、Ad-GFP組、Ad-IL-24組COLO 16細胞行DAPI染色及PI染色后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到 Ad-IL-24組COLO 16細胞有明顯的早期凋亡信號（圖4B）并出現細胞體積縮小、核濃縮、邊集、碎裂并形成凋亡小體（圖4C），而空白組和Ad-GFP處理的COLO 16細胞的細胞核均呈彌散均勻的熒光。

圖4 Ad-IL-24感染后COLO 16細胞的形態學變化（×400） 4A：未做任何處理的細胞組普通顯微鏡觀察；4B：PI染色，Ad-IL-24組細胞熒光染色明顯，說明有明顯的早期凋亡信號；4C：DAPI染色，通過藍色熒光可見Ad-IL-24組細胞體積縮小、核濃縮、邊集、碎裂并形成凋亡小體

五、Ad-IL-24對人COLO 16細胞凋亡相關基因的影響

免疫熒光結果（圖5）顯示，IL-24過表達后Bax在細胞中的表達明顯增加，而Bcl-2在細胞中的表達卻明顯減少。Western印跡（圖6）結果顯示，Ad-IL-24組Bax、Bcl-2的蛋白水平分別相對于空白組和Ad-GFP組出現了明顯的上升和下降。Ad-IL-24組產生了相對分子質量為17 000和19 000并能與抗活化的caspase 3抗體結合的特異性條帶，而空白組和Ad-GFP組則在相應位置均未出現上述條帶。

圖5 免疫熒光（×200） 熒光明顯為表達升高，可見Ad-IL-24組中，Bax在細胞中的表達明顯升高，Bcl-2在細胞中的表達明顯下降

圖6 COLO 16細胞Bax、Bcl-2蛋白和活化caspase 3的蛋白表達水平 1：空白組；2：Ad-GFP組；3：Ad-IL-24組；Ad-IL-24組產生了相對分子質量為17 000和19 000并能與抗cleaved caspase 3抗體結合的特異性條帶，而空白組和Ad-GFP組則在相應位置均未出現上述條帶

討論

IL-24基因是一個既能夠抑制腫瘤細胞的生長、誘導期的凋亡、調控腫瘤細胞的分化，又能抑制血管生成，刺激免疫細胞表達細胞因子的抑癌基因［8-9］，還能增強放療敏感性和免疫調節作用［10］，而對正常細胞和組織無毒副作用。已有文獻報道，IL-24基因可以明顯抑制胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的生長，但對鱗癌細胞生長的影響未見報道。

本研究以人鱗癌皮損培養獲得的皮膚鱗癌細胞COLO 16［11］為模型，將腺病毒載體介導的Ad-IL-24感染該細胞后，IL-24蛋白在COLO 16細胞內可高表達，感染4 d后能明顯抑制細胞增殖且呈現時間依賴性抑制。同時，IL-24能明顯誘導COLO 16細胞凋亡，在激光共聚焦顯微鏡下也能觀察到明顯的早期凋亡信號和凋亡小體。流式細胞儀檢測結果表明，Ad-IL-24組的COLO 16細胞凋亡率顯著高于空白組和Ad-GFP組（P＜0．05），而圖3顯示Ad-IL-24組的細胞晚期凋亡比早期凋亡更明顯，說明IL-24主要誘導COLO 16細胞的晚期凋亡。

Bcl-2是抗細胞凋亡家族中的基本成員，與其相關的Bax則具有促進細胞凋亡的作用，兩者形成Bax/Bcl-2異源二聚體，一般認為Bax/Bcl-2的比值決定細胞是否凋亡［12］。Bax的過表達可促進細胞色素C從線粒體釋放，或直接與凋亡蛋白酶激活因子、caspase 9結合成3元復合物，并激活后者，激活的 caspase 9進一步酶切并活化 caspase 3，而caspase 3是一種促凋亡因子，caspase級聯放大效應是誘導細胞凋亡的主要機制之一［13-14］。本實驗結果表明，Ad-IL-24可以使COLO 16細胞中的Bax基因的蛋白和mRNA表達水平明顯上調，而使Bcl-2基因的蛋白和mRNA表達明顯下調，Bax/Bcl-2比值顯著增高；并且感染Ad-IL-24的COLO 16細胞中出現了活化的cleaved caspase 3特異性條帶。結果提示，Ad-IL-24感染導致COLO 16細胞凋亡，與提高Bax/Bcl-2比值、激活easpase-3等級聯反應機制有關。

［1］Verburg M,Lang M,Muhlstadt M,et al.Cutaneous squamous cell carcinoma with perineural invasion:report on eight cases and review of the literature［J］.Dermatology,2015,230（2）:135-142.

［2］Jiang H,Lin JJ,Su ZZ,et al.Subtraction hybridization identifies a novel melanoma differentiation associated gene,mda-7,modulated during human melanoma differentiation,growth and progression［J］.Oncogene,1995,11（12）:2477-2486.

［3］Caudell EG,Mumm JB,Poindexter N,et al.The protein product of the tumor suppressor gene,melanoma differentiation-associated gene 7,exhibits immunostimulatory activity and is designated IL-24［J］.J Immunol,2002,168（12）:6041-6046.

［4］Dent P,Yacoub A,Hamed HA,et al.MDA-7/IL-24 as a cancer therapeutic:from bench to bedside［J］.Anticancer Drugs,2010,21（8）:725-731.

［5］潘巍巍,曹利仙,徐營,等.IL-24基因重組腺病毒載體轉染的樹突狀細胞促進宮頸癌CaSki細胞凋亡［J］.中國病理生理雜志, 2014,30（1）:41-47.

［6］王睿,王郡甫,劉娣,等.白細胞介素-24對喉癌細胞的增殖抑制效應及機制［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2014,28（12）: 902-907.

［7］農衛霞,潘歆,魏娟,等.白細胞介素24對急性白血病骨髓單個核細胞生長的影響［J］.實用醫學雜志,2014,30（11）:1760-1763.

［8］Conti P,Kempuraj D,Frydas S,et al.IL-10 subfamily members: IL-19,IL-20,IL-22,IL-24 and IL-26［J］.Immunol Lett,2003,88（3）:171-174.

［9］Zheng M,Bocangel D,Doneske B,et al.Human interleukin 24（MDA-7/IL-24）protein kills breast cancer cells via the IL-20 receptor and is antagonized by IL-10［J］.Cancer Immunol Immunother,2007,56（2）:205-215.

［10］Wang Z,Lv J,Zhang T.Combination of IL-24 and cisplatin inhibits angiogenesis and lymphangiogenesis of cervical cancer xenografts in a nude mouse model by inhibiting VEGF,VEGF-C and PDGF-B［J］.Oncol Rep,2015,33（5）:2468-2476.

［11］Moore GE,Merrick SB,Woods LK,et al.A human squamous cell carcinoma cell line［J］.Cancer Res,1975,35（10）:2684-2688.

［12］Yang E,Korsmeyer SJ.Molercular thanatopsis：a discourse on the Bcl-2 family and cell death［J］.Blood,1996,88（2）:386-401.

［13］Pan G,0′Rourke K,Dixit VM.Caspase-9,Bcl-XL,and Apaf-1 form a termary complex［J］．J Biol Chem,1998,273（10）:5841-5845.

［14］Shalini S,Dorstyn L,Dawar S,et al.Old,new and emerging functions of caspases［J］.Cell Death Differ,2015,22（4）:526-539.

Adenovirus-mediated IL-24 gene expression induces apoptosis in a human squamous cell carcinoma cell line COLO 16

Ma Xinxin,Zhang Mengli,Li Lingjun,Cao Yuping,Wu Qiuju,Ma Pengcheng.Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com

Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of adenovirus-mediated IL-24（Ad-IL-24）gene expression on the apoptosis in a human squamous cell carcinoma cell line COLO 16,and to explore the underlying molecular mechanism.MethodsCultured COLO 16 cells were divided into two groups to be transfected with an adenovirus vector carrying the IL-24 gene（Ad-IL-24 group）or green fluorescent protein（Ad-GFP group）,while those receiving no treatment served as the control group.After culture for different durations,qPCR was performed to quantify IL-24 gene expression,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay to evaluate the proliferative activity of COLO 16 cells,flow cytometry to detect the apoptosis of COLO 16 cells,laser scanning confocal microscopy（LSCM）to observe the morphological changes of COLO 16 cells,Western blot to determine the levels of Bax and Bcl-2 proteins and to evaluate the activation of caspase-3,qPCR to determine the levels of Bax and Bcl-2 mRNAs,an immunofluorescence assay to observe the expression of Bax and Bcl-2 proteins.Statistical analysis was carried out by a two-samplet-test with the SPSS 19.0 software.ResultsMTT assay showed that the proliferation of COLO 16 cells in the Ad-IL-24 group was significantly inhibited as early as 4 days after the transfection;thereafter,the inhibitory effect increased in a timedependent manner,and peaked on day 6（P＜0.05）.However,there was no significant difference in cellular proliferative activity between the Ad-GFP group and control group（P＞0.05）.Flow cytometry revealed that the apoptosis rate was significantly higher in the Ad-IL-24 group（13.10%±0.92%）than in the control group（3.69%±0.36%,P＜0.05）and Ad-GFP group（3.39%±1.06%,P＜0.05）,but no significant difference was observed between the control group and Ad-GFP group（P＞0.05）.LSCM demonstrated that the apoptosis of COLO 16 cells was accelerated in the Ad-IL-24 group. The immunofluorescence assay,Western blot and qPCR all showed that the mRNA and protein expressions of Bax were increased,but those of Bcl-2 were decreased in the Ad-IL-24 group compared with the Ad-GFP group and control group. Moreover,Western blot showed a protein band that could specifically bind to the anti-cleaved caspase-3 antibody in the Ad-IL-24 group,but not in the Ad-GFP group or control group.ConclusionsAd-IL-24 can induce apoptosis in humanCOLO 16 squamous cell carcinoma cells,probably by up-regulating Bax expression,down-regulating Bcl-2 expression,and activating caspase 3.

Neoplasms,squamous cell;Interleukin-24;Apoptosis;Caspase 3;COLO 16 cell

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.004

江蘇省臨床醫學科技專項（BL2012003）

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所

馬鵬程，Email：mpc815@163.com

2015-04-29）

（本文編輯：吳曉初）