寬譜中波紫外線對人表皮黑素細胞非經典Wnt通路的作用研究

王輝 林彤 王千秋

寬譜中波紫外線對人表皮黑素細胞非經典Wnt通路的作用研究

王輝 林彤 王千秋

目的 探討寬譜中波紫外線（BB-UVB）照射對黑素細胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑素含量的影響。方法 分別用0、10、20、30、40、50、100、200、300 mJ/cm2BB-UVB照射原代培養的黑素細胞，采用CCK8法測定黑素細胞增殖率、多巴比色法測定酪氨酸酶活性、NaOH溶解法測定黑素含量。分別用0、30、50、100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細胞，實時熒光定量PCR檢測非經典Wnt通路相關基因mRNA的表達。100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細胞，用Western印跡檢測作用前后非經典Wnt通路相關基因蛋白的表達。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。結果 與對照組相比，10～300 mJ/cm2BB-UVB照射后，細胞增殖率均逐漸降低，BB-UVB劑量＞100 mJ/cm2時細胞存活率＜50%，同時，10～100 mJ/cm2BB-UVB照射后酪氨酸酶活性逐漸增加，100 mJ/cm2BB-UVB組黑素含量明顯增加，差異有統計學意義（均P＜0.05）。30、50、100 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1 mRNA的表達均較對照組逐漸減少，JNK、MITF、RAC1、TYR的表達均較對照組逐漸升高，而30、50 mJ/cm2BB-UVB組WNT5A mRNA表達量均較對照組降低，100 mJ/cm2BB-UVB組WNT5A mRNA表達量則明顯升高（P＜0.05）。100 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1蛋白的表達量較對照組降低，WNT5A、JNK、MITF、RAC1、TYR蛋白表達較對照組升高（P＜0.05）。結論 紫外線照射降低黑素細胞增殖率，提高黑素細胞酪氨酸酶活性和黑素含量。WIF-1基因可能抑制黑素生成。WIF-1基因表達降低可能通過非經典通路Wnt蛋白的綜合作用激活JNK/MITF/TYR通路，最終促進黑素合成。

黑素細胞；紫外線；Wnt信號通路；細胞增殖；黑素合成

Wnt信號通路包括經典通路和非經典通路，主要由Wnt配體蛋白、細胞膜上受體、胞質內信號轉導和核內轉錄調控等部分組成，與腫瘤、骨質疏松、衰老、退化障礙等多種疾病有關［1］。經典通路主要通過調節細胞質中β連環蛋白的水平調節黑素細胞黑素合成與樹突形成［2］。非經典通路也參與了黑素合成的調節，但其作用的具體調節機制仍不清楚［3］。波長為275～320 nm的中波紫外線是紫外線生物學效應最活躍的部分，促進上皮細胞生長、黑素生成及抑制變態反應，但該作用產生的具體機制亦不清楚。我們用寬譜中波紫外線（BB-UVB）照射黑素細胞，觀察黑素細胞增殖、黑素合成變化及非經典Wnt通路中黑素細胞黑素生成相關基因的表達，初步探討非經典Wnt信號通路相關基因在紫外線誘導的黑素生成中的作用。

資料與方法

一、主要試劑與儀器

Medium254黑素細胞培養基、HMGS添加劑、左旋多巴（L-Dopa）、分離酶（Protease typeⅨ）（美國Sigma公司），完全1640培養基（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Amresco公司），CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Wnt5A/RAC1小鼠單克隆抗體、WIF-1/MITF/ JNK兔單克隆抗體、TYR兔多克隆抗體（英國Abcam公司），Tripure Isolation Reagent（瑞士Roche公司）。一步法RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。SS-04B型寬譜中波紫外線光療儀、BB-UVB輻照度監視器（上海希格瑪高技術有限公司）。

二、黑素細胞原代培養

取小兒包皮環切術后標本，新鮮培養基浸泡，送至實驗室。碘伏浸泡10 min后用生理氯化鈉溶液沖洗3次。去除皮下組織，剪成10 mm×20 mm細條，置于0.5%分離酶中4℃過夜或37℃3～4 h。眼科鑷輕輕分離表真皮，表皮用生理氯化鈉溶液洗2次，置于0.1%胰酶與0.02%EDTA 1∶1混合液中37℃孵育10min，加入完全1640培養基中止消化，200目濾器過濾，收集過濾液置入離心管內300×g離心10 min，棄上清后重懸，以106個/ml細胞種入25 cm2無菌培養瓶內，37℃、5%CO2孵箱內孵育，差速黏附法獲取純化的黑素細胞［4］。每2～3天換液，取第2～5代細胞進行實驗。

三、黑素細胞活力測定

采用CCK8法，用胰酶將步驟1中細胞消化下來，96孔板中，每個孔種5 000個細胞。種板第2天去除培養基，用37℃預熱的PBS洗1次，分別用10、20、30、40、50、100、200、300 mJ/cm2BB-UVB照射，以未接受BB-UVB照射為對照組。照射光源采用SS-04B型寬譜中波紫外線光療儀，細胞距紫外光源15 cm，用BB-UVB輻照度監示器標定輻照度，UVB劑量=UVB輻照度［mJ/（cm2·s）］×時間（s）。BB-UVB照射后每個孔加入培養基100 μl，培養48 h后，每個孔加入CCK8溶液10 μl，放入細胞培養箱中培養約2 h后，于酶標儀490 nm波長下測吸光度值。細胞增殖率（%）=［（實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白對照吸光度值）］×100%。

四、多巴比色法檢測黑素細胞酪氨酸酶活性、NaOH溶解法測定黑素含量

將細胞接種于6 cm培養皿中，待細胞生長至80%融合時，去除培養基，用已在37℃水浴鍋中預熱過的PBS洗1次，去除PBS，分別用10、20、30、40、50、100、200、300 mJ/cm2BB-UVB照射，時間分別為7 s、14 s、21 s、28 s、35 s、70 s、140 s、210 s。以未接受BB-UVB照射的細胞為對照組。BB-UVB處理后，加入培養基培養，48 h后用胰酶消化細胞，加入培養基和胰酶后，將細胞均勻轉移至微量離心管中，300×g、4℃離心5 min。離心后去除培養基，用PBS洗2次，離心去上清液備用。

將上述細胞加入到200 μl的0.1%Triton-X100中重懸，放在冰上將細胞裂解30 min，將裂解液一分為二，其中一個加入等體積的1 g/L L-Dopa 37℃反應4 h，于酶標儀490 nm波長處測吸光度值；另一部分裂解液，4℃、3 600×g離心10 min，對于上清液采用BCA試劑盒做蛋白定量，而沉淀則用1 mol/L NaOH重懸，50℃反應1 h，于酶標儀490 nm波長處測吸光度值。各實驗組及對照組測得吸光度值后分別除以上清液蛋白含量為平均吸光度值。細胞酪氨酸酶活性（或細胞黑素含量）（%）=［（實驗組平均吸光度值-空白對照組吸光度）/（對照組平均吸光度值-空白對照組吸光度值）］×100%。

五、實時RT-PCR檢測非經典Wnt通路中黑素細胞黑素生成相關基因mRNA的表達

將細胞接種于6 cm培養皿中，待細胞生長至80%融合時，去除培養基，用已在37℃水浴鍋中預熱過的PBS洗1次，去除PBS，分別用30、50、100mJ/cm2BB-UVB照射，以未接受BB-UVB照射的細胞為對照組。BB-UVB處理后加入培養基培養，48 h后吸去培養基，按照Tripure總RNA提取試劑盒說明書抽提細胞總RNA。分別設計各目的基因的特異性引物，引物序列見表1。按反轉錄試劑盒說明書合成反轉錄脫氧核糖核苷酸（cDNA），按qPCR試劑盒說明書擴增目的條帶。采用Thermal cycler軟件包計算Ct值，分析熒光強度。mRNA相對表達量采用2-△△Ct表示。

表1 實時RT-PCR擴增引物序列

六、Western印跡測定黑素細胞蛋白表達

將細胞接種于6 cm培養皿中，待細胞生長至80%融合時，去除培養基，用已在37℃水浴鍋中預熱過的PBS洗1次，去除PBS，用100 mJ/cm2BBUVB照射，以未接受BB-UVB照射的細胞為對照組。BB-UVB處理后加入培養基培養，48 h后吸去培養基，按細胞全蛋白提取試劑盒方法提取細胞總蛋白，蛋白樣品加熱變性后經電泳、轉膜、與一抗、二抗孵育，ECL發光法壓片顯色。采用Quantity One灰度分析軟件對所得條帶進行灰度分析，根據目的條帶與內參條帶的比值計算相對灰度值。

七、統計分析

結果

一、不同劑量BB-UVB照射對黑素細胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素含量的影響

10、20、30、40、50、100、200、300 mJ/cm2BB-UVB照射原代培養的黑素細胞，培養48 h后進行測定。結果顯示，與對照組相比，10～300 mJ/cm2BB-UVB組細胞增殖率均降低，10～100 mJ/cm2BB-UVB組酪氨酸酶活性均增加，100 mJ/cm2BB-UVB組黑素含量明顯增加，差異有統計學意義（均P＜0.05）。當BB-UVB劑量＞100 mJ/cm2時，細胞的增殖率已＜50%，培養皿中的黑素細胞大量漂浮、死亡，存活細胞很少，如此時再檢測酪氨酸酶活性和黑素含量誤差較大，遂未再檢測200 mJ/cm2、300 mJ/cm2時酪氨酸酶活性和黑素的生成量。見表2。

表2 不同劑量BB-UVB照射后黑素細胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑素含量（±s）

表2 不同劑量BB-UVB照射后黑素細胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑素含量（±s）

注：n=3。與對照組比較，a：P＜0.05，b：P＜0.01

BB-UVB劑量（mJ/cm2）檢測指標（%）細胞增殖率 酪氨酸酶活性 黑素含量對照組 100.00±8.23 100.00±6.04 100.00±4.24 10 74.64±4.87a 114.92±10.76b 93.26±5.33 20 69.78±6.73a 114.22±6.36b 99.38±5.66 30 66.67±4.33a 121.1±5.21a 94.55±4.44 40 62.10±1.90a 125.85±4.84a 96.17±3.17 50 57.87±2.95a 130.41±8.73a 113.35±9.57 100 51.51±2.41a 175.36±5.27a 185.19±18.38a 200 33.62±3.02a - -300 22.20±0.22a - -F值 67.93 34.46 42.77 P值 0.00 0.00 0.00

二、不同劑量BB-UVB照射后Wnt非經典通路基因mRNA表達的變化

不同劑量BB-UVB照射后，各組WIF-1、WNT5A、JNK、MITF、RAC1、TYR mRNA表達量差異均有統計學意義（F值分別為 150.44、322.67、130.70、259.57、310.11、40.35，均P＜0.01）。兩兩比較結果顯示，30、50、100 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1 mRNA表達量均較對照組降低，JNK、MITF、RAC1、TYR mRNA表達量均較對照組升高，差異有統計學意義（均P＜0.05）。而30、50 mJ/cm2BB-UVB照射后WNT5A mRNA表達量均較對照組降低，100 mJ/cm2BB-UVB照射后WNT5A mRNA表達量較對照組升高，差異有統計學意義（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同劑量BB-UVB照射后非經典通路各基因mRNA相對表達量 1A～1F：分別為不同劑量BB-UVB照射后WIF-1、WNT5A、JNK、MITF、RAC1、TYR mRNA相對表達量

三、100 mJ/cm2BB-UVB照射后Wnt非經典通路基因蛋白表達變化

100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細胞后，48 h測定各組基因蛋白水平的表達變化。將對照組蛋白表達量設為1，各基因100 mJ/cm2BB-UVB照射組蛋白表達水平如圖2所示。

圖2 100 mJ/cm2BB-UVB照射后Wnt非經典通路基因蛋白電泳圖

圖3 100 mJ/cm2BB-UVB照射前后黑素細胞樹突變化（倒置顯微鏡，×100） 紫外線照射前原代培養的黑素細胞，生長較密集，樹突以2～3個為主

圖4 100 mJ/cm2紫外線照射后48 h，黑素細胞數目減少，體積增大，樹突明顯增多

四、100 mJ/cm2BB-UVB照射后細胞樹突變化

如圖3所示，紫外線照射前黑素細胞生長較密集，樹突以2～3個為主。100mJ/cm2BB-UVB照射后48h黑素細胞數目減少，體積增大，樹突明顯增多，見圖4。

討論

本研究中黑素細胞經不同劑量BB-UVB照射后，隨著照射劑量的升高，細胞增殖率明顯降低，可能與黑素細胞在UVB照射后可生成嘧啶二聚體及活性氧類，導致細胞死亡有關。有研究［5］檢測1.25、2.5、5、10、25、50、100 mJ/cm2BB-UVB作用后黑素細胞的活力變化發現，小劑量（1.25 mJ/cm2）BB-UVB照射后細胞少量增殖，2.5 mJ/cm2以上BB-UVB照射后細胞活力開始降低，25 mJ/cm2BB-UVB照射后細胞活力為對照組的60%。不同研究所得毒性劑量的不同，可能與細胞活力測定方法不同、原代細胞來源個體差異、紫外線照射方式（UVB照射間隔時間）不同有關。本研究顯示，＜100 mJ/cm2BB-UVB照射后，細胞存活率在50%以上，100 mJ/cm2BBUVB照射后黑素細胞酪氨酸酶活性增加，黑素細胞黑素含量較對照明顯增加，所以我們選用30、50、100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細胞，觀察目的基因mRNA的變化，同時選擇該范圍內酪氨酸酶活性和黑素含量升高最明顯的BB-UVB劑量，即采用100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細胞后檢測目的基因蛋白含量的變化。

WIF-1屬于分泌型卷曲相關蛋白（sFRP）家族，通過直接與Wnt分子結合，抑制Wnt信號的經典和非經典途徑。Kim等［6］發現黃褐斑皮損WIF-1的表達明顯降低，將WIF-1基因沉默后，酪氨酸酶的表達升高，黑素小體生成增多，推測WIF-1可能抑制了黑素的生成。Park等［7］對黃褐斑患者皮損區基因的表達進行檢測，發現皮損區WIF-1的表達升高，WIF-1可能促進黑素合成。本研究用30 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1的mRNA表達低于對照組，TYR基因mRNA表達高于對照組，隨著紫外線劑量升高，WIF-1的mRNA表達降低，TYR基因mRNA表達逐漸升高。在蛋白水平上，100 mJ/cm2BB-UVB照射后，WIF-1蛋白生成量小于對照組，TYR蛋白的表達高于對照組，所以正常狀態下WIF-1基因產物可能通過對經典途徑和非經典途徑的綜合作用對黑素細胞酪氨酸酶基因有抑制作用，進而抑制黑素的生成，紫外線照射后抑制作用降低，黑素合成增多。

WNT5A是非經典通路重要的胞外調控因子。Zhang等［8］研究認為，WNT5A不僅能抑制黑素細胞的增殖，還能通過下調色素形成相關基因的表達減少黑色素的合成，且這種作用是通過調節細胞內JNK的表達實現的。而在Park等［7］的研究中，黃褐斑皮損中WNT5A的表達也是上調的。本研究中30、50 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細胞后，WNT5A mRNA表達量低于對照組，而在BB-UVB劑量上升至100 mJ/cm2時，WNT5A的mRNA及蛋白的表達量均明顯升高，與下游JNK及MITF、TYR等基因的表達趨勢不一致。推測原因可能有以下兩點：①WNT5A對下游基因的調控可能以綜合作用為主，也就是說該基因對下游基因的調控可能不是單向的，而是通過對下游數個通路如Ca2+通路、JNK通路甚至經典通路的綜合作用實現的［9］；②JNK的表達也受上游多個非經典通路因子的綜合作用。低劑量紫外線照射可能以Wnt非經典通路的其他基因對JNK的調控作用為主，當BB-UVB的劑量增大至100 mJ/cm2時，WNT5A對JNK/MITF/TYR通路發揮促進作用。

Rho家族小GTP酶尤其是RHOA，RAC1和CDC42在黑素細胞細胞骨架和樹突形成方面起重要作用［10］。RAC1可以增強c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸激酶活性，調節細胞板狀偽足的形成，使黑素細胞樹突增多［11-12］。本研究結果顯示，隨紫外線劑量的升高，RAC1基因的mRNA表達增多，100 mJ/cm2BB-UVB照射后蛋白的表達同步升高。在圖3中可以看到，100 mJ/cm2BB-UVB照射黑素細胞48 h后，細胞存活量較前減少，但存活細胞的樹突明顯增多，說明RAC1基因參與了黑素細胞樹突形成的調控，RAC1基因的表達增多促進黑素細胞樹突增多，因此，在紫外線照射黑素細胞后，黑素細胞黑素生成能力增加的同時黑素小體轉運能力甚至黏附功能同步提高。

MITF作為黑素細胞黑素生成最重要的轉錄因子，一方面可以誘導酪氨酸酶基因家族在黑素細胞中的特異性表達，另一方面參與外界刺激對黑素細胞黑素生成的調控。MITF調控酪氨酸酶相關蛋白家族的表達，而TYR的表達和活性決定著黑素生成的速度和產量，是影響黑素生成最核心的調節酶。本實驗中隨著BB-UVB劑量的增加，JNK、MITF、TYR的mRNA表達逐漸增多，且Western印跡顯示，100mJ/cm2BB-UVB照射后，JNK、MITF、TYR蛋白的表達均高于對照組，提示上游通路的各因子可能通過激活JNK/MITF/TYR通路最終促進酪氨酸酶的表達及黑素生成。

［1］Maruotti N,Corrado A,Neve A,et al.Systemic effects of Wnt signaling［J］.J Cell Physiol,2013,228（7）:1428-1432.

［2］王輝,王千秋,林彤.Wnt通路及抑制因子對黑素細胞調控作用的研究進展［J］.國際皮膚性病學雜志,2015,41（2）:125-128.

［3］LimX,NusseR.Wntsignalinginskindevelopment,homeostasis,and disease［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5（2）:a008029.

［4］趙志國,丁克云,金城,等.人表皮成黑素細胞培養條件的初步探討［J］.中華皮膚科雜志,2009,42（1）:49-51.

［5］Cho TH,Lee JW,Lee MH.Evaluating the cytotoxic doses of narrowband and broadband UVB in human keratinocytes, melanocytes,and fibroblasts［J］.Photodermatol Photoimmunol Photomed,2008,24（3）:110-114.

［6］Kim JY,Lee TR,Lee AY.Reduced WIF-1 expression stimulates skin hyperpigmentation in patients with melasma［J］.J Invest Dermatol,2013,133（1）:191-200.

［7］Park TJ,Kim M,Kim H,et al.Wnt inhibitory factor（WIF）-1 promotes melanogenesis in normal human melanocytes［J］.Pigment Cell Melanoma Res,2014,27（1）:72-81.

［8］Zhang J,Li Y,Wu Y,et al.Wnt5a inhibits the proliferation and melanogenesis of melanocytes［J］.Int J Med Sci,2013,10（6）: 699-706.

［9］Topol L,Jiang X,Choi H,et al.Wnt-5a inhibits the canonical Wnt pathway by promoting GSK-3-independent beta-catenin degradation［J］.J Cell Biol,2003,162（5）:899-908.

［10］Jackson TA,Koterwas DM,Morgan MA,et al.Fibroblast growth factors regulate prolactin transcription via an atypical Racdependent signaling pathway［J］.Mol Endocrinol,2003,17（10）: 1921-1930.

［11］Yamauchi J,Miyamoto Y,Sanbe A,et al.JNK phosphorylation of paxillin,acting through the Rac1 and Cdc42 signaling cascade, mediates neurite extension in N1E-115 cells［J］.Exp Cell Res, 2006,312（15）:2954-2961.

［12］Sigal YJ,Quintero OA,Cheney RE,et al.Cdc42 and ARP2/3-independent regulation of filopodia by an integral membrane lipidphosphatase-relatedprotein［J］.JCellSci,2007,120（Pt2）:340-352.

Effects of broadband ultraviolet B on non-canonical Wnt pathways in human epidermal melanocytes

Wang Hui, Lin Tong,Wang Qianqiu.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China
< class="emphasis_italic">Corresponding authors:Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com;Wang Qianqiu,Email:wangqq@ncstdlc.org

s:Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com;Wang Qianqiu,Email:wangqq@ncstdlc.org

ObjectiveTo investigate the effects of broadband ultraviolet B（BB-UVB）on the proliferation of, tyrosinase activity and melanogenesis in melanocytes.MethodsMelanocytes isolated from human foreskin were subjected to primary culture.Some cultured primary melanocytes were irradiated with BB-UVB at 10,20,30,40,50,100, 200 and 300 mJ/cm2.Then,CCK-8 assay was performed to evaluate the proliferative activity of melanocytes,dopa oxidation assay to estimate the activity of tyrosinase,and sodium hydroxide（NaOH）-lysis method was used to determine melanin content.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was conducted to measure the mRNA expressions of genes involved in non-canonical Wnt pathways in melanocytes after irradiation with BB-UVB at 30,50 and 100 mJ/cm2. Western blot was carried out to determine the expressions of proteins involved in non-canonical Wnt pathways in melanocytes before and after irradiation with BB-UVB of 100 mJ/cm2.The melanocytes receiving no treatment served as the control group.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance followed by least significant difference（LSD）-ttest for multiple group comparisons and by the independent samplettest for two-group comparisons.ResultsAfter irradiation with BB-UVB at 10－300 mJ/cm2,the proliferative activity of melanocytes was gradually reduced compared with the control group（allP＜0.05）,and the survival rate of melanocytes was less than 50%when the irradiation dose of BB-UVB was higher than 100 mJ/cm2.Furthermore,tyrosinase activity gradually increased in melanocytes after irradiation with BB-UVB at 10-100 mJ/cm2compared with the control group,and the increase was statistically significant at the radiation dose of 100 mJ/cm2（P＜0.05）.Compared with the control group,the WIF-1 mRNA expression level decreased,while c-Jun N-terminal kinase（JNK）,microphthalmia-associated transcription factor（MITF）,Ras-related C3 botulinum toxin substrate1（RAC1）and tyrosinase（TYR）mRNA expression levels increased in melanocytes after irradiation with BB-UVB at 30,50 and 100 mJ/cm2（allP＜0.05）;the WNT5A mRNA expression significantly decreased in melanocytes irradiated with 30 and 50 mJ/cm2BB-UVB,but increased in those irradiated with 100 mJ/cm2BB-UVB（allP＜0.05）.The radiation with 100 mJ/cm2BB-UVB significantly decreased the expression ofWIF-1 protein,but enhanced the expressions of WNT5A,JNK,MITF,RAC1 and TYR proteins in melanocytes compared with the control group（allP＜0.05）.ConclusionsBB-UVB can decelerate the proliferation of,elevate tyrosinase activity and melanin level in,melanocytes.The WIF-1 gene may inhibit melanogenesis,and the decrease in its expression may promote melanogenesis by activating the JNK/MITF/TYR pathway through the combined effects of proteins involved in non-canonical Wnt pathways.

Melanocytes;Ultraviolet rays;Wnt signaling pathway;Cell proliferation;Melanin synthesis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.007

江蘇省自然科學基金（BK2012507）

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所

林彤，Email：ddlin@hotmail.com；王千秋，Email：wangqq@ncstdlc.org

2015-04-27）

（本文編輯：吳曉初）