姜黃素對人表皮黑素細胞活性、遷移及c-kit mRNA表達量的影響

李其林 陸小娟 牛牧

姜黃素對人表皮黑素細胞活性、遷移及c-kit mRNA表達量的影響

李其林 陸小娟 牛牧

目的 探討姜黃素對人表皮黑素細胞活性、黑素細胞遷移及c-kit mRNA相對表達量的影響。方法 不同濃度（5、10、20、30 μmol/L）姜黃素對人表皮黑素細胞活性影響實驗，分為陰性對照組（添加MelM-2完全培養基＋細胞）、藥物對照組（MelM-2完全培養基＋姜黃素）、空白對照組（僅添加MelM-2完全培養基）及實驗組（MelM-2完全培養基＋姜黃素＋細胞），用MTS法分別檢測培養24 h、48 h后細胞活性。劃痕實驗檢測黑素細胞遷移的情況，實時熒光定量PCR檢測黑素細胞c-kit mRNA相對表達量。實驗分為對照組（僅添加MelM-2完全培養基＋細胞）及3個濃度（5、10、20 μmol/L）實驗組。結果 不同濃度（5、10、20、30 μmol/L）姜黃素培養基培養黑素細胞24 h、48 h時，與對照組相比，30 μmol/L組均可明顯抑制黑素細胞的增殖（P＜0.05），其他濃度差異無統計學意義（均P＞0.05）。劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，在培養48 h時，5、10、20 μmol/L姜黃素均能顯著抑制黑素細胞遷移（均P＜0.05）。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與對照組相比，經各濃度（5、10、20 μmol/L）姜黃素作用48 h后，均可明顯抑制黑素細胞c-kit mRNA相對表達量（均P＜0.05）。結論 低濃度的姜黃素（≤20 μmol/L）對黑素細胞無明顯細胞毒性，30 μmol/L的姜黃素能夠促進黑素細胞的凋亡。姜黃素（≤20 μmol/L）可抑制黑素細胞的遷移，并下調人表皮黑素細胞c-kit mRNA的相對表達量。

黑素細胞；姜黃素；細胞運動；原癌基因蛋白質c-kit；基因表達

黃褐斑是常見的色素增多性皮膚病，發病與色素代謝障礙［1］、氧化與抗氧化損傷系統失衡［2］、激素（孕激素、雌激素）、精神因素、遺傳等因素有關［3］。臨床上黃褐斑治療方法較多，但療效欠佳。姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取出的一種植物多酚，研究發現其具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抑制酪氨酸酶活性及抑制腫瘤生長等多種藥理作用［4-5］。為了進一步研究姜黃素對黃褐斑等色素沉著性疾病的作用，我們用姜黃素處理體外培養人表皮黑素細胞，探討對人表皮黑素細胞活性、遷移及與遷移密切相關的c-kit mRNA相對表達量的影響，為姜黃素對人表皮黑素細胞的調節作用提供更多實驗依據，也為臨床治療黃褐斑等色素沉著性疾病拓展新的方向。

資料與方法

一、資料

1.細胞來源：正常人表皮黑素細胞來自廣州市紅十字會醫院泌尿科手術室提供的青少年男性包皮環切術的包皮組織。本研究經過醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑：姜黃素為美國Sigma公司產品，以二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10 mmol/L的母液，置于-20℃冰箱避光保存，保質期半個月，藥品臨用前加新鮮MelM-2完全培養基（美國Sciencell公司）調配至實驗所需濃度。人黑素細胞生長添加劑MelGS-2（美國Sciencell公司），鼠抗人HMB-45單克隆抗體（美國Abcam公司），RNase（上海瑞齊生物科技有限公司），熒光定量PCR試劑（日本Takara公司）。

二、方法

1.黑素細胞的分離培養：收集包皮組織，70%乙醇消毒后沖洗，剔除真皮及皮下脂肪組織，將組織剪成1 mm×2 mm長方形，加入0.25%DispaseⅡ分離酶，消化16～18 h后，分離表皮、真皮。加入胰蛋白酶室溫下消化后制成黑素細胞懸液。過濾，離心，接種至25 cm2無菌培養瓶中。

2.多巴染色法鑒定黑素細胞：將細胞接種于蓋玻片，貼壁后，加入預熱至37℃的4%甲醛固定。將蓋玻片浸潤于左旋多巴（L-Dopa）染色液中，置于37℃下孵育40 min，隨后更換新染液。約3 h后，染液呈棕色或黑色，停止染色。漂洗，蘇木素復染細胞核，脫色，梯度酒精法逐級脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。

HMB-45免疫化學染色法鑒定黑素細胞：爬片固定后，加入過氧化物酶溶液，孵育后沖洗，再加入0.1%Triton X100/PBS，室溫下放置30 min。每張細胞爬片滴入1滴正常非免疫動物血清，置于孵箱中30 min，用槍頭吸取血清后，加入一抗置4℃冰箱過夜。次日，將細胞爬片溫箱中30min，沖洗后每張細胞爬片加入1滴生物素標記二抗，置于孵箱中30 min，PBS緩沖液清洗。每張細胞爬片滴入1滴鏈霉素抗生物素過氧化物酶溶液后，置于37℃溫箱中孵育30 min，PBS緩沖液沖洗后，加入DAB顯色，觀察到棕黃或棕褐顆粒為陽性，終止顯色。蘇木素復染細胞核，脫色，梯度酒精法逐級脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。

3.姜黃素對人表皮黑素細胞活性的測定（MTS法）：設立陰性對照組（添加MelM-2完全培養基＋細胞）、藥物對照組（MelM-2完全培養基＋姜黃素）、空白對照組（僅添加MelM-2完全培養基）及實驗組（MelM-2完全培養基＋姜黃素＋細胞），實驗組設4個復孔。根據預實驗結果，設定姜黃素的實驗濃度。將黑素細胞接種于96孔細胞培養板中，細胞貼壁后棄上清液，分別加入新鮮配制的濃度分別為5、10、20、30 μmol/L的姜黃素完全培養基100 μl；陰性對照組更換MelM-2完全培養基100 μl；藥物對照組分別添加上述濃度姜黃素培養基100 μl；空白對照組僅添加MelM-2完全培養基100 μl。培養24、48 h后分別加入冷藏的MTS顯色液，每孔20 μl，4 h后終止培養。將96孔細胞培養板置于酶標儀490 nm波長處行各孔光吸收值（A）的檢測。用增殖比例表示細胞增殖情況，即各實驗組的細胞增殖比例=（A實驗組-A藥物對照組）/（A陰性對照組-A空白對照組）× 100%。本實驗重復3次，取均值。

4.姜黃素對人表皮黑素細胞遷移能力的測定（劃痕實驗）：設立對照組（僅添加MelM-2完全培養基）及3組實驗組（設定姜黃素的實驗濃度為5、10、20 μmol/L）。先用絲裂霉素提前16 h作用于黑素細胞，再將黑素細胞接種于6孔培養板內。在黑素細胞完全融合的6孔板細胞內，采用無菌的1 ml槍頭在每孔中劃出等寬的直線劃痕，然后用PBS緩沖液輕輕洗去脫落細胞的碎片，分別加入含有各試驗濃度的姜黃素完全培養基（不含FBS和MelGS-2），置于培養箱中繼續培養。48 h后拍照并使用圖像分析軟件IPP 6.1分析。倒置顯微鏡下觀察、照相、計數、計數劃痕部位各組遷移細胞數量，本實驗重復3次，取均值。

5.熒光定量PCR檢測姜黃素對c-kit mRNA相對表達量的影響（SYBR Green法）：設立對照組（僅添加MelM-2完全培養基）及3組實驗組（設定姜黃素的實驗濃度為5、10、20 μmol/L），每組設3個復孔。將黑素細胞接種于6孔細胞培養板，置于培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后棄上清液，分別加入上述新配制的姜黃素完全培養液繼續孵育。對照組更換MelM-2完全培養基。各實驗組與對照組均于48 h后終止培養并檢測各項指標。

6.引物探針設計合成：在基因庫上查找目的基因mRNA序列，在CDS區設計特異性引物使用Primer express 2.0軟件設計引物探針，序列如下：HC-KIT（擴增片段長度121 bp）上游引物：5′-GGCAG CCAGAAATATCCTCCT-3′，下游引物：5′-CACAGG TAGTCGAGCGTTTCCT-3′。H-β肌動蛋白（擴增片段長度106 bp）上游引物：5′-GCATGGGTCAGAAG GATTCCT-3′，下游引物：5′-TCGTCCCAGTTGGTGA CGAT-3′。RNA的提取：各實驗組及對照組的黑素細胞總RNA采用Trizol一步法進行提取。β肌動蛋白作為內參照。去基因組：使用Nase-free的DNaseⅠ（美國Promega公司）以下體系配置反應液，37℃消化30 min，65℃滅活10 min。反轉錄反應：取4 μl RNA模板做反轉錄反應，反應條件為37℃15 min，然后85℃5s。熒光定量PCR反應：反應條件為93℃2 min，93℃15 s，55℃25 s，72℃25 s，共40個循環。每個樣本重復3次。

結果

一、正常人表皮黑素細胞的培養及鑒定

培養24 h時大部分細胞可貼壁，鏡下可見散在分布的梭形或多角形細胞，樹突少而細長，少量呈圓形、胞質透明的細胞。24 h后首次換液，以后每隔2～3 d換1次液，鏡下可觀察到黑素細胞逐漸增多，樹突數量逐漸增加至2個以上，角質形成細胞也呈“鋪路石樣”聚集。約8～15 d黑素細胞及角質形成細胞接近80%融合，此時可傳代。見圖1。

圖1 正常人表皮黑素細胞（×100）

L-DOPA染色鑒定人表皮黑素細胞：正常人表皮黑素細胞經L-DOPA染色后，可呈陽性反應，各細胞樹突及胞質呈灰棕色或棕褐色。見圖2。

圖2 L-DOPA染色陽性人表皮黑素細胞（×100）

HMB-45免疫組化染色鑒定：經HMB-45染色，鏡下胞質呈棕黃色或棕褐色，表明染色結果為陽性，證明該細胞可正常合成黑素，為成熟黑素細胞。見圖3。

圖3 HMB-45染色陽性人表皮黑素細胞（×100）

二、不同濃度姜黃素對黑素細胞活性的影響

各組數據經兩因素多個水平的析因設計與方差分析檢驗后，結果顯示不同濃度姜黃素溶液對黑素細胞增殖的影響不同（F=43.617，P=0.000），差異有統計學意義，即姜黃素溶液濃度越高對黑素細胞越有抑制作用。不同時間對黑素細胞的增殖也有影響（F=11.459，P=0.000），差異有統計學意義，即隨著姜黃素溶液作用時間越長對黑素細胞越有抑制作用。不同濃度姜黃素溶液與時間有交互作用（F=3.168，P＜0.05），差異有統計學意義，即隨著姜黃素溶液濃度的增加及作用時間的增長，對黑素細胞的抑制作用增強。見表1。

三、不同濃度姜黃素對黑素細胞遷移的影響

培養48 h時觀察細胞遷移情況。單因素方差分析結果顯示，F=1534.467，P＜0.001，不同濃度姜黃素對黑素細胞遷移率的差異有統計學意義。Levene方差齊性檢驗顯示，F=1.181，P=0.376，按α=0.1水準，滿足方差齊性。采用SNK法進行多重比較顯示，與對照組（80.25%±1.48%）相比，5、10、20 μmol/L的姜黃素可明顯抑制黑素細胞的遷移，遷移率分別為 65.82% ±0.63%，51.30% ±0.92%，21.50% ± 0.92%；差異均有統計學意義（P值分別為0.004、＜0.001、＜0.001）。

表1 不同濃度姜黃素對黒素細胞活性的影響（±s）

表1 不同濃度姜黃素對黒素細胞活性的影響（±s）

注：n=3。a：僅有培養基；b：培養基＋黑素細胞；c：培養基＋各濃度姜黃素；d：培養基＋黑素細胞＋各濃度姜黃素；e：與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）

組別 24 h 48 h空白對照組a 0.009±0.001 0.008±0.001陰性對照組b 1.000±0.018 0.993±0.064藥物對照組c 5 μmol/L姜黃素 0.035±0.005 0.037±0.003 10 μmol/L姜黃素 0.031±0.004 0.033±0.004 20 μmol/L姜黃素 0.032±0.002 0.035±0.002 30 μmol/L姜黃素 0.039±0.003 0.040±0.002實驗組d 5 μmol/L姜黃素 1.007±0.064 0.959±0.029 10 μmol/L姜黃素 0.970±0.030 0.885±0.033 20 μmol/L姜黃素 0.870±0.066 0.877±0.025 30 μmol/L姜黃素 0.783±0.053e 0.637±0.015e

四、不同濃度姜黃素對黑素細胞c-kit mRNA表達的影響

培養48 h時，單因素方差分析結果顯示，F= 39.115，P＜0.001，不同濃度姜黃素組黑素細胞c-kit mRNA相對表達量不完全相同。方差齊性檢驗顯示，F=3.640，P=0.064，按α=0.10水準，尚不能認為4組資料方差齊。采用Tamhane T2進行多重比較，與對照組（3.371±0.352）相比，5、10、20 μmol/L姜黃素在培養 48 h時均能顯著抑制黑素細胞 c-kit mRNA表達（c-kit mRNA相對表達量分別為1.799± 0.372，1.539±0.224，1.026±0.038），P值分別為0.025、0.012、0.021，且呈濃度依耐性，以20 μmol/L的姜黃素抑制最顯著。

討論

研究發現，姜黃素具有抗炎、抗細菌、抗氧化、抗腫瘤、抑制酪氨酸酶活性的作用［6-7］。林茂等［8］通過探討姜黃素對體外原代培養的正常人表皮黑素細胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影響，推測姜黃素對黃褐斑等色素性皮膚病有一定的治療作用。但其具體機制仍不清楚，為了進一步研究姜黃素治療色素沉著性疾病的作用及其機制，我們通過體外培養人表皮黑素細胞，探討姜黃素對人表皮黑素細胞活性、遷移及與遷移密切相關的c-kit mRNA相對表達量的影響。

黑素細胞分別經5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素培養基作用24、48 h后，細胞形態學上未見明顯改變。但經30 μmol/L濃度的姜黃素培養基處理24 h后，部分黑素細胞出現了核固縮，樹突收縮及折光性減弱，且細胞數目較空白對照組減少。采用MTS法檢測細胞活性，發現當姜黃素達到30 μmol/L時對黑素細胞有明顯的毒性作用，提示低濃度的姜黃素對黑素細胞無明顯毒性作用，但30 μmol/L的姜黃素可直接引起細胞凋亡。有關黑素細胞凋亡的具體機制，目前仍然不清楚。研究發現，19 000磷蛋白靶向作用可以消除活化的黑素細胞，其表達上調或下調都會抑制黑素細胞的活性，從而黑素含量和酪氨酸酶活性都會降低。19 000磷蛋白1是正常分化的黑素細胞直接的抑制開關，而能調節19 000磷蛋白l的因子是治療局限性色素沉著的潛在途徑之一。姜黃素是如何引起黑素細胞的凋亡，其凋亡是否與上述凋亡蛋白酶相關，這些尚待進一步研究。

有學者認為，黑素細胞的遷移是依賴于膜結合的c-kit受體，c-kit受體通過跨膜二聚化或突變體的基底目標而改變上皮內黑素細胞定位、存活及與上皮細胞的粘附［9］。Oba-Shinjo等研究發現黑素細胞的黏附、遷移與細胞外基質具有密切關聯。黑素細胞為貼壁生長的細胞，自身不能分泌細胞外基質，但可與周圍的細胞外基質黏附從而發生一系列變化［10］。有學者發現，當黑素細胞處于增殖狀態時，與細胞外基質纖維連接蛋白的黏附性可增強［11］。本研究為觀察姜黃素對表皮黑素細胞的遷移情況，我們的預實驗用絲裂霉素提前16 h作用于黑素細胞，以期在不損傷細胞活性的前提下終止黑素細胞的增殖，觀察姜黃素對黑素細胞遷移情況的影響，結果提示5、10、20 μmol/L的姜黃素可抑制黑素細胞的遷移，差異有統計學意義，且隨著的濃度的增大，對黑素細胞的抑制越顯著。我們采用熒光定量PCR檢測經不同濃度姜黃素作用后人表皮黑素細胞c-kit mRNA的相對表達量，結果顯示，姜黃素在20 μmol/L的范圍內，可下調黑素細胞c-kit mRNA的相對表達量。因此，通過本研究，我們認為姜黃素在低濃度時對黑素細胞無明顯細胞毒性，30 μmol/L的姜黃素可引起黑素細胞的凋亡從而直接抑制局部黑素細胞的增殖。姜黃素可下調黑素細胞c-kit mRNA相對表達量，并對黑素細胞的遷移能力有抑制作用。這些結果表明，姜黃素具有開發為美白產品的潛能，為治療黃褐斑等色素沉著性疾病提供了一定的依據，但姜黃素是如何抑制酪氨酸酶活性及黑素細胞的遷移，它通過什么途徑誘導黑素細胞的凋亡，尚待進一步研究。

［1］Wu IB,Lambert C,Lotti TM,et al.Melasma［J］.G Ital Dermatol Venereol,2012,147（4）:413-418.

［2］Yamakoshi J,Sano A,Tokutake S,et al.Oral intake of proanthocyanidin-rich extract from grape seeds improves chloasma［J］. Phytother Res,2004,18（11）:895-899.

［3］Jang YH,Lee JY,Kang HY,et al.Oestrogen and progesterone receptor expression in melasma:an immunohistochemical analysis［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2010,24（11）:1312-1316.

［4］Grimes PE.Management of hyperpigmentation in darker racial ethnic groups［J］.Semin Cutan Med Surg,2009,28（2）:77-85.

［5］劉彥群,周琳,魏志平.姜黃素對小鼠黑素瘤的抑制作用及對核因子κB激活和生存素表達的影響［J］.中華皮膚科雜志,2007, 40（11）:684-687.

［6］Lee KH,Ab Aziz FH,Syahida A,et al.Synthesis and biological evaluation of curcumin-like diarylpentanoid analogues for antiinflammatory,antioxidant and anti-tyrosinase activities［J］.Eur J Med Chem,2009,44（8）:3195-3200.

［7］楊柳依,曹煜,魏羽佳,等.14種中藥提取成分對酪氨酸酶活性的抑制作用［J］.中華皮膚科雜志,2003,36（4）:207-209.

［8］林茂,盧珊姍,齊曉怡,等.姜黃素對正常人表皮黑素細胞黑素生成的影響［J］.中國中西醫結合皮膚性病學雜志,2011,10（1）:5-7.

［9］Tabone-Eglinger S,Wehrle-Haller M,Aebischer N,et al. Membrane-bound Kit ligand regulates melanocyte adhesion and survival,providing physical interaction with an intraepithelial niche［J］.FASEB J,2012,26（9）:3738-3753.

［10］Oba-Shinjo SM,Correa M,Ricca TI,et al.Melanocyte transformation associated with substrate adhesion impediment［J］. Neoplasia,2006,8（3）:231-241.

［11］Danen EH,Jansen KF,Klein CE,et al.Loss of adhesion to basement membrane components but not to keratinocytes in proliferating melanocytes［J］.Eur J Cell Biol,1996,70（1）:69-75.

Effect of curcumin on the activity and migration of as well as c-kit mRNA expression in melanocytes

Li Qilin, Lu Xiaojuan,Niu Mu.Department of Dermatology,Fourth Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Li Qilin,Email:qlli_cn@163.com

Li Qilin,Email:qlli_cn@163.com

ObjectiveTo explore the effect of curcumin on the activity and migration of as well as c-kit mRNA expression in melanocytes.MethodsHuman epidermal melanocytes were isolated from the prepuce in adolescents and subjected to primary culture.To estimate the effect of curcumin on the proliferative activity of melanocytes,some melanocytes were randomly divided into several groups to be cultured in the MelM-2 medium with or without the presence of 5,10,20 or 30 μmol/L curcumin,the MelM-2 medium containing curcumin of 5－30 μmol/L served as the drug control groups,and the MelM-2 medium without curcumin served as the blank control group.After 24 and 48 hours of culture, MTS assay was performed to evaluate the proliferative activity of melanocytes.Some cultured melanocytes were randomly divided into 4 groups to be cultured in the MelM-2 medium with 0,5,10 and 20 μmol/L curcumin respectively for 48 hours.Then,wound scratch assay was conducted to estimate the migratory activity of melanocytes,and real-time fluorescence-based quantitative PCR to quantify the mRNA expression of c-kit in melanocytes.Statistical analysis was carried out by factorial design analysis of variance（ANOVA）,one-way ANOVA and least significant difference（LSD）-ttest.ResultsThe proliferative activity of melanocytes was significantly decreased at 24 and 48 hours in the 30-μmol/L curcumin group compared with the negative control group（0.783±0.053 vs.1.000±0.018 at 24 hours,0.637±0.015 vs.0.993±0.064 at 48 hours,bothP＜0.05）,while no significant differences were observed between the other curcumin groups and the negative control group（allP＞0.05）.The 48-hour treatment with curcumin could significantly inhibit the migration of melanocytes in the 5-,10-and 20-μmol/L curcumin groups compared with the control group（allP＜0.05）. The mRNA expression level of c-kit was also significantly reduced at 48 hours in the 5-,10-and 20-μmol/L curcumin groups compared with the control group（1.799±0.372,1.539±0.224 and 1.026±0.038 vs.3.371±0.352,allP＜0.05）.ConclusionCurcumin at low concentrations（≤20 μmol/L）has no obvious cytotoxicity against melanocytes, but can inhibit the migration of and c-kit mRNA expression in melanocytes,while curcumin at 30 μmol/L can promote the apoptosis of melanocytes.

Melanocytes;Curcumin;Cell movement;Proto-oncogene proteins c-kit;Gene expression

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.010

廣東省科技計劃項目（粵科函規財字［2014］807號）

510220廣州，暨南大學第四附屬醫院、廣州市紅十字會醫院皮膚科

李其林，Email：qlli_cn@163.com

2015-01-26）

（本文編輯：吳曉初）