桂花酶解物中酚類物質及其抗氧化活性研究

李紅領，李春陽，曾曉雄，劉曉林（.南京農業大學食品科技學院，江蘇南京20095；2.江蘇省農業科學院農產品加工所，江蘇南京2004；.徐州林泉綠色食品飲料廠，江蘇徐州227）

桂花酶解物中酚類物質及其抗氧化活性研究

李紅領1，2，李春陽2，*，曾曉雄1，劉曉林3
（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇南京210095；2.江蘇省農業科學院農產品加工所，江蘇南京210014；3.徐州林泉綠色食品飲料廠，江蘇徐州221711）

運用LC-MS/MS對桂花酶解物中的酚類物質進行研究，發現桂花酶解物中含有36種酚類物質，包括單咖啡酰基奎寧酸、咖啡酸4-O-葡萄糖苷、5-O-對香豆酰基奎寧酸、4-O-對香豆酰基奎寧酸、木犀草素-7-O-6″-丙二酰基葡萄糖苷、麥角甾苷、異麥角甾苷等物質。抗氧化活性研究發現，桂花酶解物濃度大于0.8 mg/mL時，對ABTS+、DPPH·自由基清除率達90%以上，均顯著高于蘆丁（p＜0.05），略低于Trolox；桂花酶解物的還原力為3.0左右，顯著高于蘆丁的1.0左右（p＜0.05），稍高于Trolox；桂花酶解物的TEAC和ORAC值分別為648.66 μmol Trolox/g和813.53 μmol Trolox/g，均顯著高于蘆丁（p＜0.05）；桂花酶解物的ABTS+、DPPH·自由基清除能力和還原力與總酚含量均呈顯著的線性正相關。

桂花酶解物，LC-MS/MS，抗氧化活性，總酚

桂花（Osmanthus fragranslour）系木犀科木犀屬植物，原產于我國西南部，十大傳統花卉之一，是著名的觀賞及芳香植物，主要包括金桂、丹桂、銀桂等品種。我國的傳統食品如桂花糕、桂花酒和桂花茶等，一直深受人們的喜愛，所以一些學者對桂花的抗氧化活性功能進行了較為深入的研究，發現桂花具有體內外抗氧化活性功能的基礎是含有豐富的黃酮和多酚類物質。田成等［1］發現桂花果實多酚溶液還原力明顯高于VC溶液，對羥自由基、亞硝酸根離子的最大清除率分別為96.3%和65.4%，并對豬油有較好的抗氧化作用；靳熙茜等［2］發現桂花多酚類物質能顯著抑制亞油酸的氧化進程；施余杰等［3］發現，在體外，桂花中的齊墩果酸和熊果酸可顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性；岳淑梅等［4］從桂花中分離出的三萜類物質可以顯著降低小鼠血清中的TC、TG和LDL-C含量，具有顯著的降血脂作用；吳如娥等［5］發現桂花的乙醇萃取物可以明顯提高人體血漿中的GSH、GPX活性，降低SOD活性，并具有抗聽損，抗疲勞的保健功能。

本文對桂花酶解物清除ABTS+、DPPH·自由基能力、總抗氧化能力（TEAC）和氧化自由基清除能力（ORAC）、還原力等體外抗氧化能力進行了系統的研究，并對桂花酶解物中的酚類物質成分及酚類物質含量與體外抗氧化活性的關系進行了初步研究，以期為開發具有抗氧化活性桂花汁飲品提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

金桂采摘于江蘇溧陽市芳之林生態園區；果膠酶NCB-PE40（30000 IU/g、50℃、pH4.8）、纖維素酶AE80（20000 IU/g、55℃、pH4.8）、木聚糖酶NCBX50（58000 IU/g、50℃、pH5.5）湖南尤特爾公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇國藥集團化學試劑有限公司；HPD100大孔樹脂河北寶恩吸附材料有限公司；熒光素鈉、AAPH標準品阿拉丁試劑有限公司；沒食子酸、蘆丁、DPPH、Trolox、ABTSSigma公司；液相用甲醇為色譜級。

FDU-1200真空冷凍干燥機東京理化/EYELA；TriStar LB 941微孔板式多功能分析儀Berthold Technologies；752S紫外可見分光光度計上海棱光技術有限公司；高效液相色譜與質譜聯用儀Agilent 1100 HPLC/MS（SL） 美國Agilent公司。

1.2實驗方法

1.2.1桂花酶解物的制備金桂采摘后放置在10℃條件下預冷2 h，再-21℃條件下速凍1 h，于4℃條件下貯藏備用。以5 g金桂為原料，料液比為1∶20，果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶以3∶1∶2比例復配而成的復合酶添加量為1.0‰，然后在酶解溫度45℃、pH3.5的條件下酶解120 min，0.45 μm微濾后得桂花酶解物。

1.2.2LC-MS/MS條件桂花酶解物經HPD100大孔樹脂吸附后，先用去離子水洗脫糖、蛋白等雜物后，再用50%乙醇洗脫，收集洗脫液［6］。洗脫液過0.22 μm濾膜后，由自動進樣器進樣10 μL，流速0.6 mL/min，柱溫35℃，采用Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），DAD檢測器，檢測波長為280 nm。流動相A：含1.0%醋酸的水；流動相B：含1.0%醋酸的甲醇。

洗脫條件：采用梯度洗脫。以流動相B的含量來表示為：0～5 min，5%～20%；5～15 min，20%～25%；15～20 min，25%～30%；20～25 min，30%～35%；25～30 min，35%～38%；30～35 min，38%～40%；35～40 min，40%～42%；40～45 min，42%～45%；45～50 min，45%～48%； 50～55 min，48%～50%；55～60 min，50%～55%；60～65 min，55%～60%；65～75 min，60%～75%；75～80 min，75%～80%；80～85 min，80%～83%；85～90 min，83%～85%；90～95 min，85%～20%；95～100 min，20%～5%；100～110 min，5%。

質譜條件：霧化器N230（psi）；干燥氮氣N210（psi）；毛細管溫度為350℃，ESI-：3.0 kV，測定范圍：m/z 100～1000［7］。

1.2.3抗氧化測定方法

1.2.3.1總抗氧化能力（TEAC） 總抗氧化能力的測定參照ABTS法［8］，IC50為對ABTS+自由基清除率達到50%時的樣品濃度。Trolox的IC50除以樣品的IC50作為樣品的總抗氧化力（TEAC）。

1.2.3.2DPPH·自由基清除率的測定DPPH的測定采用Molyneux等［9］的比色法，略有改進，所用的DPPH·溶液的濃度為用無水乙醇配制的0.1 mmol/L，避光4℃保存，現用現配。IC50為對DPPH自由基清除率達到50%時的樣品濃度。

1.2.3.3還原力還原力的測定采用黃仁術等［10］方法，IC50是還原力為0.5時的樣品濃度。

1.2.3.4氧化自由基清除能力（ORAC）的測定在96孔微孔板中加入200 μL稀釋200倍后的酶解桂花汁待測液，然后用12道移液器進行2倍系列稀釋；同時加入不同濃度的Trolox和蘆丁標準品。再在每孔中加入50 μL 0.4 μmol/L熒光素鈉混合，37℃反應15 min后，向每孔中加入50 μL 60 mmol/L的AAPH，選擇激發波長485 nm，吸收波長535 nm，立即在微孔板式多功能分析儀中測定熒光強度，連續測定100 min［11-12］。

實驗所得的各微孔反應的熒光強度數據采用積分法計算熒光衰退曲線下面積（Area under curve，AUC）。ORAC值由樣品梯度濃度抗氧化保護面積（AUC樣品-netAUC）曲線與Trolox標準品梯度濃度抗氧化保護面積（AUCTrolox-netAUC）曲線的斜率比得出，ORAC值以Trolox當量表達，即μmol Trolox/g。

1.2.4桂花含水量的測定稱取一定質量鮮桂花，在-21℃、真空度為100 Pa的條件凍干，至質量為恒重；桂花含水量（%）=（凍干前質量-凍干后質量）×100/凍干前質量

1.2.5總酚含量測定方法總酚含量的測定參考Yao等［13］的方法，結果以每克桂花（干重）含有的總酚（以沒食子酸計）含量計，即mg/g。

1.2.6數據處理根據量效關系方程Y=Bottom+（TOP-Bottom）/（1+10^（（LogEC50-X）×HillSlope）），其中TOP和Bottom分別代表測量值的最大與最小值；EC50為半抑制濃度；HillSlope描述的是曲線傾斜度。利用GraphPad prism5.0軟件對實驗數據進行非線性擬合，得到擬合曲線和IC50值［14-15］。每組實驗均重復三次，顯著性檢驗（p＜0.05）利用軟件SAS 8.2來完成。

2　結果與分析

2.1桂花酶解物中的酚類物質

桂花酶解物經過大孔樹脂純化后，再經反相高效液色譜柱分離，得到36個峰（見圖1），每個峰對應的一級和二級質譜數據見表1。

圖1　桂花酶解物的反相高效液相色譜圖Fig.1　HPLC chromatogram of hydrolysates from Osmanthus fragranslour

表1　桂花酶解物中酚類物質在負離子模式下的一級和二級質譜數據Table 1　MS data for phenols of hydrolysates from Osmanthus fragranslour

峰1的分子離子峰［M-H］-為m/z 352.8，二級質譜碎片Y0*m/z 191.2，其他特征離子如m/z 179.1，m/z 173.1和m/z 135.2，均與已報道的單咖啡酰基奎寧酸的離子碎片相符［16］，故推測峰1為單咖啡酰基奎寧酸。峰2的分子離子峰［M-H］-為m/z 533.0，二級質譜碎Y0*為m/z 287.1，與已報道的木犀草素-7-O-6″-丙二酰基葡萄糖苷的離子碎片相符［17］，故推斷峰2可能為木犀草素-7-O-6″-丙二酰基葡萄糖苷。峰20的分子離子峰［M-H］-為m/z 623.4，二級質譜碎片Y0*為m/z 461.2，與已報道的麥角甾苷和異麥角甾苷相符，推測峰20可能為麥角甾苷或異麥角甾苷［16］。

通過一級和二級質譜數據可以看出，分子離子峰［M-H］-和Y0*均相同的有8組，分別為色譜峰4與5，7、8與13，9與10，16與17，18與19，21與22，23、29與34和30與31，而且每組內的物質均含有相同的其他特征離子碎片，表現出了相似的質譜裂解方式，推測這8組內的物質可能為同分異構體，如峰7、8與13的分子離子峰［M-H］-均為m/z 341.0，二級質譜碎片Y0*也均為m/z 187.7，推測三者中有咖啡酸4-O-葡萄糖苷或為咖啡酸4-O-葡萄糖苷的同分異構體［16］。分子離子峰［M-H］-相同，Y0*不同的有3組，分別是峰11與12，14與15和25與26，在質譜裂解過程中，Y0*的不同體現出了同分異構體的不同質譜裂解方式。如峰14與15，其分子離子峰［M-H］-均為m/z 337.0，然后峰14失去一個對香豆酰基得到Y0*m/z 190.8，峰15同時失去一個對香豆酰基和一個H2O分子，得到Y0*m/z 172.8，其他特征碎片也分別與已報道的5-O-對香豆酰基奎寧酸和4-O-對香豆酰基奎寧酸的離子碎片相符［18］，推測峰14和15分別為5-O-對香豆酰基奎寧酸和4-O-對香豆酰基奎寧酸。綜上所述，桂花酶解汁物中共含有11組同分異構體的酚類物質。

圖2　不同濃度Trolox、桂花酶解物和蘆丁對ABTS+自由基的清除率Fig.2　Scavenging activity of different concerntrations of Trolox，hydrolysates from Osmanthus fragranslour and Rutin on ABTS+free radical

2.2桂花酶解物的抗氧化能力

2.2.1清除ABTS+自由基能力由圖2可知，在低濃度區域（濃度＜0.125 mg/mL），對ABTS+自由基清除率大小的順序為：桂花酶解物＞Trolox＞蘆丁，但是清除率都較低，最大不超過30%；在中等濃度區域（0.125 mg/mL＜濃度＜0.5 mg/mL），三者對ABTS+自由基的清除率都急劇增加，由曲線斜率可以看出，清除率增加的速率大小順序為：蘆丁＞Trolox＞桂花酶解物，濃度為0.5 mg/mL時，清除率較高，最低不小于50%；在高濃度區域（濃度＞0.5 mg/mL），Trolox和蘆丁對ABTS+自由基的清除率都趨于達到平衡，而桂花酶解物則呈現直線升高的趨勢，最終達到與Trolox相當的水平，二者對ABTS+自由基的清除率都達到90%以上，并顯著高于蘆丁（p＜0.05）。根據量效方程，對Trolox、桂花酶解物和蘆丁的ABTS+自由基清除率數據進行非線性擬合，得到擬合曲線的決定系數（R2）分別為0.9972、0.9652、0.9947，擬合結果顯著，IC50值分別為0.2341、0.3609、0.4231 mg/mL。根據1.2.3.1中所述方法計算總抗氧化能力（TEAC），桂花酶解物顯著高于蘆丁（p＜0.05），分別為（648.66±20.36）、（553.30± 14.48）μmol Trolox/g。

圖3　不同濃度Trolox、桂花酶解物和蘆丁對DPPH·自由基的清除率Fig.3　Scavenging activity of different concerntrations of Trolox，hydrolysates from Osmanthus fragranslour and Rutin on DPPH·free radical

2.2.2清除DPPH·自由基能力由圖3可知，在濃度小于0.125 mg/mL時，Trolox和蘆丁對DPPH·自由基的清除率急劇升高，在濃度大于0.125 mg/mL時，清除率趨于平衡；而桂花酶解物則隨著濃度的不斷升高，對DPPH·自由基的清除率一直保持線性增加趨勢，在濃度為0.8 mg/mL時，超過蘆丁，在濃度為1.0 mg/mL時，達到與Trolox同樣的水平，清除率達到96%，顯著高于蘆丁（p＜0.05），此時蘆丁清除率只有78%。根據量效方程，對Trolox、桂花酶解物和蘆丁的DPPH·自由基清除率數據進行非線性擬合，得擬合曲線的決定系數（R2）分別為0.9827、0.9974、0.9695，擬合結果顯著，IC50值分別為0.0058、0.2701、0.0162 mg/mL。

圖4　不同濃度Trolox、桂花酶解物和蘆丁的還原力Fig.4　Reducing powers of different concerntrations of Trolox，hydrolysates from Osmanthus fragranslour and Rutin

2.2.3還原力由圖4可知，隨著濃度的不斷升高，三者的還原力大小也在急劇升高。在各個相同濃度梯度的條件下，桂花酶解物的還原力稍高于Trolox，顯著高于蘆丁（p＜0.05）。在終濃度1.0 mg/mL時，桂花酶解物和Trolox的還原力接近于3.0，而蘆丁的只有1.0左右。根據量效方程，對Trolox、桂花酶解物和蘆丁的還原力數據進行非線性擬合，得擬合曲線的決定系數（R2）分別為0.9994、0.9974、0.9999，擬合結果顯著，IC50值分別為0.1119、0.0857、0.2287 mg/mL。

2.2.4氧化自由基清除能力（ORAC） 圖5為5種梯度濃度Trolox與陽性對照（-AAPH）與陰性對照（+AAPH）的熒光衰變曲線，圖6、圖7分別為桂花酶解物和蘆丁的4種梯度濃度的熒光衰變曲線。從圖5～圖7可以看出，隨濃度的增加，樣品抗氧化保護面積（AUC樣品-netAUC）增加。根據1.2.3.4所述方法，計算Trolox、桂花酶解物和蘆丁的抗氧化保護面積曲線斜率，計算得到桂花酶解物的ORAC值為（813.53±27.59）μmol Trolox/g，顯著高于蘆丁為（699.29±41.23）μmol Trolox/g（p＜0.05）。

圖5　Trolox的熒光衰減曲線Fig.5　The fluorescence absorption curve of Trolox

圖6　蘆丁的熒光衰減曲線Fig.6　The fluorescence absorption curve of Rutin

圖7　桂花酶解物的熒光衰減曲線Fig.7　The fluorescence absorption curve of hydrolysates from Osmanthus fragranslour

2.3抗氧化活性與桂花酶解物中總酚含量的相關性

測得桂花含水量為85.32%±0.32%，酶解物中的總酚含量為（18.02±0.24）mg/g，ABTS+、DPPH·自由基清除率和還原力與總酚含量的線性關系見表2。

表2　ABTS+、DPPH·自由基清除率、還原力與總酚含量的線性關系Table 2　Correlation between scavenging activity of ABTS+，DPPH·free radical and Reducing powers and Total polyphenolics

由表2中回歸方程決定系數R2和p值可知，回歸模型顯著。ABTS+、DPPH·自由基清除率和還原力都與桂花酶解物中的總酚含量呈顯著的線性正相關，表明桂花酶解物的抗氧化活性與其所含的酚類物質有關。

3　結論

通過LC-MS/MS研究發現，桂花酶解物中含有36種酚類物質，包括單咖啡酰基奎寧酸、咖啡酸4-O-葡萄糖苷、5-O-對香豆酰基奎寧酸、4-O-對香豆酰基奎寧酸、木犀草素-7-O-6″-丙二酰基葡萄糖苷、麥角甾苷、異麥角甾苷等物質。桂花酶解物對ABTS+、DPPH·自由基的清除能力、還原力、ORAC值、TEAC值顯著高于蘆丁（p＜0.05），具有一定的抗氧化活性，適于開發具有抗氧化活性的桂花飲品。桂花酶解物的ABTS+、DPPH·自由基清除率和還原力與總酚含量均呈顯著的線性正相關，表明多酚類物質在酶解桂花汁抗氧化活性中具有重要作用。

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圖3　食用油樣品色譜圖Fig.3　Separation chromatogram of edible oil sample

3　結論

采用高效液相色譜-熒光檢測法，運用凝膠色譜技術，建立了食用油中10種熒光增白劑遷移量的檢測方法。各組分檢出限均可小于0.1 mg/kg；系列濃度曲線相關系數均＞0.997；回收率范圍在62.6%～99.3%之間，相對標準偏差范圍在2.9%～11.0%之間。本方法檢測限低、線性關系良好、精密度和準確度高，可滿足國內外相關法規中熒光增白劑遷移量的檢測要求。

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Study on the phenolics of hydrolysates from Osmanthus fragranslour and its antioxidant activity

LI Hong-ling1，2，LI Chun-yang2，*，ZENG Xiao-xiong1，LIU Xiao-lin3
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，China；2.Institute of Farm Product Processing，Jiangsu Academy of Agriculture Science，Nanjing 210014，China；3.Beverage Factory of Organic Foods in Linquan，Xuzhou 221711，China）

The present study investigated the phenolics of hydrolysates of Osmanthus fragranslour by LC-MS/ MS.The research results demonstrated that hydrolysates of Osmanthus fragranslour contained 36 varities of phenolics，including Caffeyolquinic acid，Caffeic acid 4-glucoside 4-O-p-coumaroylquinic acid，5-O-pcoumaroylquinic acid，Luteolin-7-O-6″-malonylglucoside，Acteoside，Isoacteoside etc.This study also evaluated the antioxidant activity of hydrolysates of Osmanthus fragranslour，Trolox and Rutin.It showed that scavenging activity of ABTS+and DPPH·free radical and reducing power of hydrolysates from Osmanthus fragranslour reached 90%and were slightly lower than Trolox，but significantly higher than Rutin（p＜0.05），when the concentration was greater than 0.8 mg/mL.The values of TEAC and ORAC of hydrolysates from Osmanthus fragranslour were 648.66 μmol Trolox/g and 813.53 μmol Trolox/g and significantly higher than Rutin（p＜0.05）.It was observed that the scavenging activity of ABTS+and DPPH·free radical and reducing power of hydrolysates from Osmanthus fragranslour had a significantly positive correlation with the contents of polyphenolics.

hydrolysates from Osmanthus fragranslour；LC-MS/MS；antioxidant activity；total polyphenolics

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0085-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.009

2015－04－20

李紅領（1990-），男，碩士研究生，研究方向：功能性食品，E-mail：2013108070@njau.edu.cn。

李春陽（1966-），男，研究員，研究方向：營養與活性物質，農產品精深加工，E-mail：lichunyang968@126.com。

江蘇省農業科技自主創新資金（CX（14）2120）；江蘇省蘇北科技專項資金（富民強縣）項目（BN2014088）；2014年中央財政農業技術推廣資金項目（TG（14）113）。