小龍蝦殼中甲殼素的提取及殼聚糖的制備

摘要：以小龍蝦（Procambarus clarkii）殼為原料，分別采用HCl溶液和NaOH溶液處理脫除小龍蝦殼中的礦物質和蛋白質，提取甲殼素，用NaOH溶液處理甲殼素脫乙酰基制備殼聚糖。通過單因素試驗優化甲殼素提取過程中的HCl溶液濃度及浸泡時間、NaOH溶液濃度及處理時間，并采用正交設計考察NaOH溶液質量分數、處理溫度和時間對殼聚糖脫乙酰度的影響。結果表明，優化的甲殼素提取工藝條件為，在室溫下用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡24 h后傾去酸液，水洗至中性，然后在90～100 ℃用2.0 mol/L的NaOH溶液處理4 h，甲殼素提取率為16.52%。殼聚糖制備的最佳工藝條件為NaOH溶液質量分數50%、溫度90 ℃、保溫時間3 h。干燥后的殼聚糖水分含量為3.21%，灰分為0.89%～1.00%，脫乙酰度為75.3%，黏度為18.7 mPa·s。

關鍵詞：小龍蝦（Procambarus clarkii）殼；甲殼素；殼聚糖

中圖分類號：S985.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3120-04

甲殼素（Chitin），又名幾丁質，是一種氨基多糖，主要存在于節肢動物如蝦、蟹的外殼和真菌及一些藻類植物的細胞壁中，是僅次于纖維素的第二大可再生資源[1]。殼聚糖是甲殼素脫乙酰基的產物，是天然多糖中惟一的堿性多糖，具有許多特殊的物理化學性質和生理功能[2]，被認為是繼蛋白質、脂肪、糖類、維生素和無機鹽之后的第六大生命要素[3]。目前，甲殼素/殼聚糖及其衍生物在食品、材料科學、醫藥科學、微生物學、免疫學、農業等方面有重要的應用價值[4]，現已成為最熱門的研究領域之一。我國目前加工提取甲殼素和殼聚糖的主要原料是海蝦和海蟹殼等[5]，用淡水蝦殼制備甲殼素和殼聚糖的報道尚不多見。

小龍蝦學名為克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），也叫紅螯蝦，是一個淡水小龍蝦種，原產于美國東南部，現廣泛分布于長江中下游各省市。小龍蝦殼為蝦仁加工或食用后的廢棄物，長期以來未得到很好的利用，既浪費了資源，又污染了環境。因此，以小龍蝦殼為原料生產甲殼素類產品具有綜合利用資源和保護環境的雙重意義[6]。本研究以小龍蝦殼為原料，采用酸堿法提取甲殼素，然后將甲殼素脫乙酰基制備殼聚糖，考察不同提取制備條件對甲殼素提取率和殼聚糖質量的影響，確定最佳工藝條件，旨在為蝦殼的綜合利用提供參考。

1 試驗方法

1.1 甲殼素的提取

1.1.1 甲殼素的提取 將收集于荊州市南門某大排檔的新鮮小龍蝦殼洗凈，除去附著物，烘干并磨成粉，取小龍蝦殼粉，室溫下分別用不同濃度的HCl溶液浸泡，期間不斷攪拌，除去蝦殼中的礦物質，直至無氣泡產生。傾去酸液，水洗至中性；用不同濃度的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反應不同時間，水解除去蝦殼中的蛋白質。傾去NaOH溶液，水洗至中性，得甲殼素粗品。甲殼素粗品用5 g/L的KMnO4溶液浸泡1 h，過濾，水洗除去KMnO4后用10 g/L的草酸水溶液于60～70 ℃攪拌進行脫色反應，直至全部變成白色，水洗至中性，于60～70 ℃干燥24 h，得白色的甲殼素。

1.1.2 甲殼素提取條件的優化 設計單因素試驗，分別考察甲殼素提取過程中HCl溶液濃度和浸泡時間、NaOH溶液濃度和處理時間對甲殼素提取率及礦物質脫除效果的影響。①HCl溶液濃度。分別采用0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mol/L的HCl溶液浸泡小龍蝦殼粉，浸泡時間為24 h，傾去酸液，水洗至中性后用2 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反應3 h，測定灰分含量并計算甲殼素提取率。②HCl溶液浸泡時間。用①優化的濃度的HCl溶液浸泡小龍蝦殼粉，分別在室溫下浸泡5、10、15、20、25、30 h，傾去酸液，水洗至中性，干燥后稱重，計算礦物質脫除率。③NaOH溶液濃度。稱取一定量小龍蝦殼粉，用HCl溶液脫除礦物質后分別用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反應3 h，去蛋白質，脫色，干燥得甲殼素，計算其提取率。④NaOH溶液處理時間。稱取一定量小龍蝦殼粉，用HCl溶液脫除礦物質后用③優化的濃度的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中分別反應2、3、4、5、6 h，脫色，干燥得甲殼素，計算其提取率。

1.2 殼聚糖的制備

1.2.1 殼聚糖的制備 稱取一定量按優化的工藝提取得到的甲殼素，加入一定濃度的NaOH溶液，煮沸一段時間，使甲殼素在強堿作用下脫去乙酰基，反應一定時間后，水洗至中性，干燥得到淺黃色殼聚糖。

1.2.2 殼聚糖制備條件的優化 設計正交試驗，考察NaOH溶液質量分數、處理溫度和處理時間對殼聚糖脫乙酰度的影響。正交試驗因素與水平見表1。

1.3 指標測定

1.3.1 灰分的測定[7] 將瓷坩堝用20%的HCl溶液煮沸10 min，洗凈，放到馬弗爐中500～600 ℃下灼燒至恒重，準確稱取待測樣品1～2 g于坩堝中，在馬弗爐內300 ℃灼燒2 h。使其完全炭化，再升溫至600 ℃保持2 h，冷卻至200 ℃以下，取出置于干燥器中，冷卻0.5 h，稱重，置于馬弗爐中600 ℃灼燒1 h，如此反復，直至恒重。計算樣品中的灰分含量。

X=■×100%

式中，X為樣品的灰分含量，m1為坩堝與樣品的總質量；m2為坩堝與灰分的總質量；m3為灼燒至恒重時的坩堝質量。

1.3.2 礦物質脫除率的測定 分別稱取HCl溶液處理前后小龍蝦殼粉的干重，計算礦物質脫除率。

礦物質脫除率=（m0-m）/m0×100%

式中，m0為原料小龍蝦殼粉的質量，m為HCl溶液處理后小龍蝦殼粉的質量。

1.3.3 脫乙酰度的測定[8] 準確稱取0.3～0.5 g殼聚糖樣品，置于250 mL三角瓶中，加入30 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，在室溫下攪拌至完全溶解。加入5～6滴甲基橙苯胺藍指示劑，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液變成淺藍綠色。

A=■×100%

脫乙酰度B=■×100%

式中，A為樣品中的氨基含量；C1為HCl標準溶液的濃度；C2為NaOH標準溶液的濃度；V1為加入的HCl標準溶液的體積；V2為滴定耗用的NaOH標準溶液的體積；m為樣品質量；w為樣品中的含水量；0.016為與1 mL 1 mol/L的HCl溶液相當的氨基量。

1.3.4 黏度的測定[9] 量取100 mL質量分數1%的乙酸溶液，將1 g殼聚糖樣品溶于其中，配成1%的殼聚糖溶液，用NDJ79型黏度計直接測定其黏度。

2 結果與分析

2.1 甲殼素提取條件的優化結果

2.1.1 HCl溶液濃度對甲殼素提取的影響 分別用濃度為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mol/L的HCl溶液浸泡小龍蝦殼粉，所得甲殼素提取率及灰分含量見圖1。由圖1可知，隨著HCl溶液濃度的升高，甲殼素的提取率呈緩慢下降的變化趨勢，而灰分含量先迅速下降，HCl溶液濃度高于1.0 mol/L后灰分含量下降的趨勢變得平緩，基本保持不變。可見在一定范圍內HCl溶液濃度的升高有助于去除小龍蝦殼粉中的礦物質，但HCl溶液濃度高于1.0 mol/L后提高HCl溶液濃度對降低灰分含量的效果不明顯，且HCl溶液濃度過高會導致甲殼素的損失，因此后續試驗采用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡甲殼素。

2.1.2 HCl溶液浸泡時間對甲殼素提取的影響 取一定量小龍蝦殼粉，用1.0 mol/L的HCl溶液在室溫下分別浸泡5、10、15、20、25、30 h，傾去酸液，水洗至中性，干燥后稱重，計算礦物質脫除率，結果見圖2。由圖2可知，HCl溶液浸泡時間由5 h延長到20 h，小龍蝦殼粉的礦物質脫除率升高速度較快，由20 h延長到25 h，礦物質脫除率升高速度有所減緩，浸泡時間超過25 h后礦物質脫除率基本保持不變，綜合客觀條件，HCl溶液浸泡時間選擇24 h。

2.1.3 NaOH溶液濃度對甲殼素提取率的影響 小龍蝦殼粉經HCl溶液浸泡脫除礦物質后用濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反應3 h去蛋白質，所得甲殼素提取率結果見圖3。由圖3可知，NaOH溶液濃度由0.5 mol/L升高到2.0 mol/L，甲殼素提取率降低，表明甲殼素中的蛋白質等雜質被分解；NaOH溶液濃度在2.0～2.5 mol/L時，甲殼素提取率趨于穩定；之后繼續升高NaOH溶液濃度，甲殼素提取率又有所下降，可能是過高濃度的NaOH溶液導致甲殼素被部分水解，綜合考慮，NaOH溶液濃度以2.0 mol/L較好。

2.1.4 NaOH溶液處理時間對甲殼素提取的影響 小龍蝦殼粉經HCl溶液脫除礦物質后，用2.0 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中分別反應2、3、4、5、6 h，所得甲殼素提取率結果見圖4。由圖4可知，NaOH溶液處理時間由2 h延長到3 h，甲殼素提取率下降幅度較大，而處理時間由3 h延長到5 h，甲殼素提取率下降的趨勢比較平緩，之后再延長處理時間，提取率下降速度又有所加快，可見延長NaOH處理時間有利于蛋白質的分解，但處理時間過長會導致部分甲殼素水解，從而降低提取率，所以處理時間應以4 h為最佳。

綜上，從小龍蝦殼粉中提取甲殼素的最佳工藝條件為室溫下用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡24 h，傾去酸液，水洗至中性后用2 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴處理時間4 h，甲殼素提取率為16.52%。

2.2 殼聚糖制備條件的優化結果

殼聚糖的脫乙酰度和黏度是評價其質量的重要指標，對產品的應用范圍有重要影響[10]。以按優化的工藝提取的甲殼素為原料，設計正交試驗考察NaOH溶液質量分數、處理溫度和處理時間對殼聚糖的脫乙酰度的影響，結果見表2。由極差分析可知各種反應條件對殼聚糖脫乙酰度的影響由大到小依次為處理溫度、NaOH溶液質量分數、處理時間。方差分析結果表明處理溫度和NaOH溶液質量分數對殼聚糖脫乙酰度的影響達顯著水平（P<0.05），而處理時間的影響不顯著。最佳反應條件組合為A2B3C3，即處理溫度90 ℃、NaOH溶液質量分數50%、處理時間4 h。提高處理溫度、NaOH溶液質量分數和延長處理時間都可以提高脫乙酰度，但是隨著脫乙酰化反應條件的強化，甲殼素主鏈的降解也越來越嚴重。綜合產品質量、節約能源和縮短處理時間等因素，選取處理時間為3 h比較合適。在處理溫度90 ℃、NaOH溶液質量分數50%、處理時間3 h的條件下制取殼聚糖，所得產品的脫乙酰度為75.3%，黏度為18.7 mPa·s。干燥后的殼聚糖水分含量為3.21%，灰分含量為0.89%～1.00%。

3 小結與討論

以小龍蝦殼為原料提取甲殼素并制備殼聚糖的最佳工藝條件為在室溫下用1.0 mol/L的HCl溶液浸泡24 h，傾去酸液后水洗至中性，用2 mol/L的NaOH溶液在90～100 ℃水浴中反應4 h，脫色后干燥得白色甲殼素，提取率為16.52%。將甲殼素用質量分數50%的NaOH溶液于90 ℃水浴中處理3 h，水洗后干燥得到淺黃色殼聚糖。干燥后的殼聚糖水分含量為3.21%，灰分含量為0.89%～1.00%，脫乙酰度為75.3%，黏度為18.7 mPa·s。

小龍蝦殼是制備甲殼素/殼聚糖的良好來源，可以有效解決目前國內加工甲殼素/殼聚糖中存在的加工原料來源有限、生產成本居高和產品質量偏低等問題，為小龍蝦殼資源的有效利用及甲殼素/殼聚糖的工業化生產提供了參考。

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