基于ELF—97的新型H₂O₂熒光探針的合成與性能研究

蔡子君+匡永清+潘丹　劉偉　蔣健暉

摘 要 以5-氯水楊醛，4-溴甲基苯硼酸，2-氨基-5-氯苯甲酰胺為原料合成了一種基于ELF-97的新型H₂O₂熒光探針P1，并用1H NMR，13C NMR和HRMS對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。此探針在0.02 mol/L PBS-DMSO （9∶1， V/V， pH=7.4） 的溶液中，在360 nm激發(fā)光激發(fā)下，最大發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm， 熒光微弱；加入H₂O₂后，相同的激發(fā)波長(zhǎng)下，425 nm發(fā)射峰消失，同時(shí)在515 nm處出現(xiàn)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。515 nm處熒光強(qiáng)度與H₂O₂的濃度呈動(dòng)態(tài)學(xué)相關(guān)性，線性響應(yīng)范圍為5～45 μmol/L，檢出限為0.1 μmol/L，牛奶中檢測(cè)H₂O₂的回收率在94.0%～106.0%之間。探針P1對(duì)H₂O₂的快速檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞 熒光探針； ELF-97； 過氧化氫

1 引 言

過氧化氫（H₂O₂）是生物體內(nèi)最主要的活性氧物種之一，可參與體內(nèi)的氧化損傷[1，2]、免疫應(yīng)答[3～6]、血管重塑[7，8]以及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展等病理生理過程[9]。此外，一些食品生產(chǎn)企業(yè)將H₂O₂作為廉價(jià)的氧化劑、漂白劑，超量或非法使用，導(dǎo)致食品中H₂O₂殘留超標(biāo)，有時(shí)甚至?xí)鹗澄镏卸綶10]。因此，實(shí)時(shí)、靈敏、高選擇性地檢測(cè)H₂O₂的含量，對(duì)于疾病診斷、病理研究以及食品安全監(jiān)測(cè)等具有十分重要的意義。文獻(xiàn)報(bào)道的H₂O₂檢測(cè)方法有高效液相色譜法[11]、化學(xué)發(fā)光法[12]、電化學(xué)法[13，14]及熒光法[15～19]等，其中熒光法具有靈敏度高、操作方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因而應(yīng)用最為廣泛。現(xiàn)有H₂O₂熒光探針大多是以芳基硼酸（酯）作為H₂O₂識(shí)別基團(tuán)，當(dāng)芳基硼酸（酯）被H₂O₂氧化

后可直接或間接活化熒光團(tuán)[20]。2-（2′-羥基-5′-氯）苯基-6-氯-4-（ ）-喹唑啉酮（ELF-97，圖1）是一種新型熒光染料，具有水溶性低、固相發(fā)光效率高、斯托克斯位移大等特性。用識(shí)別基團(tuán)對(duì)其2′位酚羥基進(jìn)行修飾，制備有機(jī)探針，可有效消除其長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光； 當(dāng)探針與待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)后，修飾基團(tuán)離去，長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光增強(qiáng)，藉此可達(dá)到檢測(cè)目的。利用此特性已經(jīng)成功構(gòu)建了檢測(cè)單胺氧化酶[21]、β-內(nèi)酰胺酶[22]、堿性磷酸酶[23]及β-葡萄糖醛酸苷酶[24]的熒光探針。本研究采用4-溴甲基苯硼酸對(duì)ELF-97的羥基進(jìn)行共價(jià)修飾，

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F7000熒光分光光度計(jì)（日本HITACHI公司）； LTQ Orbitrap Velos Pro型質(zhì)譜儀（瑞士Thermo-Fisher Scientific公司）； INOVA-400（美國(guó)Varian公司）； HSGF254薄層層析硅膠板（煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）。

5-氯水楊醛和2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（Acros試劑）； 4-溴甲基苯硼酸（ABCR試劑）； 2-氨基-5-氯苯甲酰胺（TCI試劑）； 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 探針P1的合成

2.2.1 化合物2的合成 5-氯水楊醛（200 mg， 1.28 mmol）溶于5 mL丙酮中，加入K2CO3（270 mg， 1.92 mmol），室溫下攪拌15 min后，加入4-溴甲基苯硼酸（275 mg， 1.28 mmol）和KI （106 mg， 0.64 mmol），回流6 h。反應(yīng)完畢，過濾除去K2CO3，濾液減壓濃縮，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離（V石油醚∶V乙酸乙酯=5∶1），得化合物2白色固體156 mg。產(chǎn)率42.0%。 1H NMR （400 MHz，d6-DMSO） δ （ppm）： 10.36（s， 1H）， 8.09（s， 2H）， 7.83（d， J=8.0 Hz， 2H）， 7.70 （dd， J1=8.8 Hz， J2= 2.8 Hz， 1H）， 7.65 （d， J=2.0 Hz， 1H）， 7.47 （d， J=8.0 Hz， 2H）， 7.36 （d， J=8.8 Hz， 1H），5.32 （s， 2H）； 13C NMR （100 MHz， d6-DMSO） δ （ppm）： 188.67， 159.70， 138.32， 136.04， 134.83， 127.49， 126.97， 126.14， 125.68， 117.00， 79.68， 70.82，HRMS （ESI） m/z： 289.0444（理論值）， 289.0419（測(cè)量值） [M-H]

2.2.2 探針P1的合成

探針P1的合成路線如圖2所示。化合物2 （90 mg， 0.31 mmol）， 2-氨基-5-氯苯甲酰胺（53 mg， 0.31 mmol）， TsOH·H2O（6 mg， 0.03 mmol）溶于10 mL無水乙醇中，加熱回流1 h。將反應(yīng)液冷卻至0 ℃，加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（70 mg， 0.31 mmol），在冰浴條件下攪拌1 h，有白色固體生成。反應(yīng)完畢，抽濾收集白色固體，用少量冷卻乙醇淋洗3次，得探針P1白色固體60 mg。產(chǎn)率43.9%。1H NMR （400 MHz，d6-DMSO） δ （ppm）： 12.52 （s， 1H）， 8.10～8.04（m， ）， 7.88（dd， J1=9.2 Hz， J2=2.8 Hz， 1H）， 7.77～7.72（m， ）， 7.61（dd， J1=8.8 Hz， J2=2.8 Hz， 1H）， 7.41（d， J= 8.0 Hz， 2H）， 7.31（d， J= 9.2 Hz， 1H）， 5.22（s， 2H），13C NMR （100 MHz， d6-DMSO） δ （ppm）： 160.65， 155.66， 152.00， 148.04， 138.58， 135.13， 134.66， 132.19， 131.61， 130.33， 130.21， 126.63， 125.33， 125.04， 124.94， 122.80， 115.64， 70.74，HRMS （ESI）m/z： calcd 441.0575，found 441.0603 [M+H]+。endprint