苝酐衍生物功能化空心納米金電致化學發光鉛離子傳感器的研究

李雪+陳安懿+卓穎+袁若

摘 要 基于目標物循環放大策略及苝酐衍生物功能化納米探針，構建了超靈敏的電致化學發光（ECL）傳感器用于Pb2+檢測。將發卡型DNA底物鏈通過分子自組裝固載于沉積納米金的玻碳電極表面，當目標物Pb2+及脫氧核酶（DNAzyme）存在時，底物鏈被剪切，在電極上留下單鏈DNA，同時釋放出的Pb2+和DNAzyme可進入下一個循環，繼續對未剪切的底物鏈進行剪切。剪切得到的單鏈DNA可與輔助探針H1的一端雜交，H1的另一端可與標記有苝酐衍生物功能化空心納米金的發夾探針H2雜交。隨著Pb2+濃度的增加，更多的信號探針被捕獲，使得電極上產生的ECL信號逐漸增強。在Pb2+不存在時，底物鏈不能被剪切，信號探針不能被捕獲，ECL信號低。本傳感器在1×10

2 ～1×106 mol/L的濃度范圍內對Pb2+有良好的線性響應，檢出限為1×1012 mol/L（S/N=3）。傳感器對常見的金屬離子表現出良好的選擇性。

關鍵詞 電致化學發光； Pb2+； S2O28/O2； 苝酐衍生物； 空心納米金

1 引 言

Pb2+是一種廣泛分布在環境及水體中的重金屬污染物，攝入過量Pb2+對人體尤其是兒童的神經系統、免疫系統造成損傷，導致智力發育延遲[1，2]。目前，在國家標準方法[3，4]的基礎上，已發展了許多新的Pb2+檢測方法，包括流動注射火焰爐原子吸收光譜法[5，6]、電感耦合等離子發射法[7，8]、熒光光譜法[9]、表面增強拉曼散射光譜法[10]等。然而，這些檢測方法通常需要精密的儀器、熟練的技術人員，不適于推廣使用。因此，發展低成本、簡單靈敏的Pb2+檢測方法具有重要實際意義。

電致化學發光（ECL）是一種背景信號低、靈敏度高、可控性強、選擇性好、動力學響應范圍寬、重現性好、檢出限低的分析檢測技術。近年來，ECL技術在環境分析領域受到廣泛關注。例如，Huang等[11]基于“T-Hg2+-T”的特異性結合和四氟硼酸二（2，2′-聯吡啶）（二吡啶并吩嗪）合釕 [Ru（bpy）2（dppz）]（BF4）2（bpy=bipyridine，dppz=dipyrido [3，2-a：2′，3′-c] phenazine）嵌入DNA骨架，構建了一個簡單靈敏的檢測Hg2+的ECL生物傳感器；Qiu等[12]基于點擊反應 “銅催化疊氮-炔丙基反應”，通過炔丙基功能化的釕摻雜的二氧化硅納米顆粒與修飾在金電極上的疊氮化合物的反應，設計了一個檢測Cu2+的高靈敏高選擇性的ECL傳感器。現有的ECL發光體系[13～15]主要有Ru（bpy）2+3及其衍生物、Luminol及其衍生物、量子點和S2O2

8/O2體系。其中，S2O2

8/O2發光體系是近年來發展起來新的發光體系，具有反應試劑價廉易得的優點，已被用于檢測凝血酶[16]、促甲狀腺激素（TSH）[17]等生物大分子。但是基于S2O2

8/O2的ECL體系檢測Pb2+的方法還未見報道。

研究發現苝酐衍生物功能化空心納米金能極大增強S2O2

8/O2體系的ECL信號[18]。本研究利用以Pb2+為輔酶因子的脫氧核酶實現目標物循環，將苝酐衍生物功能化空心納米金標記在發夾型探針H2上作為信號探針，構建了一種超靈敏的ECL傳感器用于Pb2+的檢測。首先在玻碳電極表面沉積納米金，固定含有Pb2+特異性識別位點的發夾型DNA底物鏈H0。在Pb2+存在時， H0被剪切，在電極上留下單鏈DNA片段，同時目標物被釋放， 對余下底物鏈進行循環剪切。剪切后留在電極上的單鏈DNA片段能夠打開發夾型輔助探針H1，進而結合信號探針H2-HGNPs-PTCA-L-Cys。Pb2+濃度越大，傳感器表面的捕獲信號探針越多，在S2O2

8底液中的ECL信號越強。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MPI-E型電致化學發光分析系統（西安瑞邁分析儀器有限責任公司）；CHI660C電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；S4800 掃描電子顯微鏡（日本日立有限公司）。電致化學發光采用三電極系統：玻碳電極（GCE， Φ=4.0 mm）及其修飾電極作工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl（飽和KCl）參比電極。

苝四甲酸二酐（3，4，9，10-perylenete-tracarboxylic dianhydride，PTCDA，純度98%， 遼寧聯港染料化工有限公司）；L-半胱氨酸L-Cys，純度99%），6-巰基己醇（MCH，純度97%， 購于北京百靈威科技有限公司）；氯金酸（HAuCl4· 2O，純度99.9%）為沈陽有色金屬研究院試劑；N-（3-二甲基氨丙基）-N-2-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，純度99%），N-羥基琥珀酰亞胺（，NHS，純度98%）購于上海共價化學科技有限公司；Pb（NO3）2（純度99%），三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度99.5%），檸檬酸鈉（純度99%），NaBH4（純度97%），六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O，純度99%），Na2S2O8（純度98%），NaOH（純度98%， 購于成都科龍化工。實驗用水均為 Milli-Q 超 純水（電阻率 18.2 MΩ cm）。核酸序列由上海生工生物工程有限公司合成，如表1 所示。

2.2 實驗方法

2.2.1 空心納米金（HGNPs）的制備 參考文獻[19]方法制備空心納米金。在N2氛圍中，持續攪拌，以1 min的時間間隔依次將200 μL檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L）、200 μL 新制的NaBH4溶液（1 mol/L）、50 μL CoCl2·6H2O溶液（0.5 mol/L），加入到50 mL去離子水中。45 min后，以2 min的時間間隔加3次1% HAuCl4溶液（每次50 μL），反應15 min，移去開N2氛圍直到溶液顏色由黑褐色變為深藍色離心并用去離子水洗滌沉淀3次，最終所得沉淀加1 mL去離子水分散，4℃保存備用。endprint

2.2.2 苝四甲酸和L-半胱氨酸復合物（PTCA-L-Cys）的制備 稱取苝四甲酸二酐（PTCDA） 0.09 g，加6 mL NaOH 溶液（1 mol/L）溶解，用HCl調至pH 4～6，加入新制的1mL EDC-NHS溶液（0.04 mol/L EDC， 0.01 mol/L NHS），4℃下活化100 min。再加入L-Cys 0.1 g， 持續攪拌36 h，溶液離心，用去離子水洗滌3次，所得沉淀用5 mL 去離子水分散，4℃保存備用。

2.2.3 信號探針（H2-HGNPs-PTCA-L-Cys）的制備 取2 mL HGNPs溶液，攪拌下加入PTCA-L-Cys溶液 10 μL，10 min后加入10 μL核苷酸序列 H2，在4℃下攪拌過夜，收集溶液，4℃保存備用。

2.2.4 ECL傳感器制備過程 首先將玻碳電極（GCE）用Al2O3粉拋光，清洗后晾干。浸入1% HAuCl4溶液， 0.2 V恒電位沉積30 s，得到納米金修飾電極（depAu/GCE）。滴加10 μL 發夾型底物鏈H0 （1×10

6 mol/L） 孵育過夜，通過H0的3′端氨基與納米金形成的AuN鍵[20]作用固定H0鏈，得到H0修飾電極（H0/depAu/GCE）；隨后電極表面用1×10

3 mol/L MCH封閉0.5 h，得到MCH修飾電極（MCH 0/depAu/GCE）。

3 結果與討論

3.1 傳感器的工作原理

在組裝的傳感器表面滴加上樣品溶液（含1×10

6 mol/L 脫氧核酶（DNAzyme）和不同濃度的Pb（NO3）2標準溶液的pH 8.0的Tris-HCl（0.1 mol/L））孵育1 h。當Pb2+存在時，以Pb2+為輔酶因子的脫氧核酶（DNAzyme）可以對嵌入腺嘌呤核苷的發夾型底物鏈H0在Pb2+特異性識別位點進行剪切[10]，從而在電極表面留下能打開輔助探針H1的單鏈DNA片段，并釋放出目標物Pb2+和脫氧核酶（DNAzyme），使之進入下一個剪切循環。經過N次循環剪切后，用超純水清洗電極表面，再與輔助探針H1孵育1 h，最后與信號探針H2孵育1 h，然后在S2O2

8溶液中進行ECL檢測，ECL信號大小與Pb2+濃度成正比。傳感器工作過程如圖1所示。

3.2 HGNPs和HGNPs-PTCA-L-Cys復合物的SEM表征

圖2A為 HGNPs的SEM圖像，可以看到HGNPs的邊緣比中心要亮很多，是表面光滑的空心球體；圖2B為HGNPs-PTCA-L-Cys復合物的SEM圖像，可以清楚的看到球體表面被一些小顆粒覆蓋，不再是光滑的球面，表明空心納米金的表面被PTCA-L-Cys功能化。

3.3 電極表面電活性面積表征

當玻碳電極表面修飾上物質時，其電活性面積會發生變化。電活性面積的計算的依據是Randles-Sevcik方程[21]：

ip=2.69×105n3/2D1/2v1/2Ac（1）

式中ip為峰電流（A），n為電子轉移數，D為擴散系數（在25℃ 時為6.7±0.2×106 cm2/s），v為電位掃描速率（V/s），A為電極表面積（cm2），c為被測物質的濃度（mol/L）。如圖3所示，采用循環伏安法（CV）對裸電極（圖3A）與沉積納米金（圖3B）后的電極在pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中（含有5×103 mol/L的[Fe（CN）6]3/4和0.1 mol/L KCl），以0.035 V/s的梯度從0.02～0.3 V/s在

0.2～0.6 V的電位范圍內進行實驗。得到的還原峰電流值（ip）與掃速的平方根（v1/2）在0.02～0.3 V/s的梯度掃速有良好的線性響應，裸電極和沉積納米金的電極的線性方程分別為： ip=0.0005055υ1/2+0.000049和ip=0.0007044v1/2+0.000025。根據Randles-Sevcik方程計算，得到電活性面積分別為14.5 mm2和20.2 mm2，由此表明， 納米金成功的修飾在了電極上。

3.4 修飾電極的CV表征

ECL傳感器的構建過程采用循環伏安法（CV）表征。如圖4所示，裸電極上顯示了一對準可逆的氧化還原峰（曲線a）。在裸電極上沉積金（depAu）后，由于納米金能夠增加電極的有效表面積，峰電流增大（曲線b）；接著將發卡型底物鏈H0孵育在電極上，電極表面的負電荷增多，阻礙探針與電極間的電子轉移，峰電流值下降（曲線c）；滴加MCH封閉非特異性結合位點，進一步了阻礙電子傳遞，電流繼續下降（曲線d）。與含有脫氧核酶（DNAzyme）和不同濃度Pb2+的樣品溶液孵育后，發生剪切反應，使得發卡型底物鏈H0變為較短的DNA單鏈片段，電極表面的負電荷減少，對[Fe（CN）6]3/4

的排斥作用減弱，探針與電極間的電子轉移阻礙減小，電流略有增加（曲線e）； 與H1育后，它的一端與電極上殘留的單鏈DNA片段發生雜交，生成雙鏈DNA，電極表面物質量增加，且負電荷增多，進一步阻礙探針與電極間的電子轉移，峰電流降低（曲線f）加入納米信號探針H2-HGNPs-PTCA-L-Cys孵育后，H1的另一端與有標記物的H2雜交生成DNA雙鏈，更進一步阻礙電子傳遞，峰電流也隨之降低（曲線g）。

3.5 修飾電極的ECL表征

采用ECL對傳感器的組裝過程做了表征（圖5）。電致化學發光參數設置為：光電倍增管高壓800 V，掃描速率0.2 V/s，掃描電位

1.5～0 V，放大級數為3級。如圖5A所示，裸玻碳電極在表現出明顯的ECL信號（曲線a）；在電極表面沉積納米金后，電極的有效比表面積增加，ECL響應信號增強（曲線b）；修飾上H0后，由于負電性DNA阻礙電子傳遞，ECL響應信號降低（曲線c）；接著用MCH封閉非特異性結合位點，進一步阻礙了電子的傳遞，使得ECL響應信號繼續降低（曲線d）。將上述電極與DNAzyme和Pb2+孵育后，發卡型底物鏈被剪切，在電極上留下單鏈DNA片段，，ECL信號強度略有增加（曲線e）；加入H1與，與電極上殘留的單鏈DNA片段發生雜交，生成雙鏈DNA進一步阻礙電子傳遞，ECL響應信號降低（曲線f）。加入信號探針H2-HGNPs-PTCA-L-Cys為最佳，由于苝四甲酸復合物功能化的空心納米金能增強過硫酸根體系的ECL信號，ECL信號極大增加（曲線g）。圖5B對比了在H2上標記空心納米金和PTCA-L-Cys功能化空心納米金產生的ECL信號。當信號探針H2上標記了HGNPs時，ECL信號明顯增強；而標記PTCA-L-Cys- HGNPs后，ECL信號顯著增強，從而提高了Pb2+檢測的靈敏度。endprint

圖5 不同修飾電極的ECL表征。0.1 mol/L PBS （pH 7.4，含0.1 mol/L K2S2O8）底物溶液，電位范圍為1.5～0 V時。A為電極的修飾過程表征： a. GCE，b.depAu/GCE，c. H0/depAu/GCE，d. MCH 0/depAu/GCE，e. DNAzyme+Pb2+/MCH 0/depAu/GCE，f. H1/DNAzyme+ Pb2+/MCH 0/depAu/GCE，g. H2-HGNPs 1/DNAzyme+Pb2+/MCH 0/depAu/GCE， h. H2-HGNPs-PTCA- L-Cys 1/DNAzyme+ Pb2+/MCH 0/depAu/GCE； B為不同信號標記物的ECL信號對比。

Fig.5 ECL characterization of different electrodes in 0.1 mol/L K2S2O8 . （A） modification process of electrode. a. GCE， b. depAu/GCE， c. H0/depAu/GCE， d. MCH 0/depAu/GCE， e. DNAzyme+Pb2+/MCH 0/depAu/GCE， f. H1/DNAzyme +Pb2+/MCH 0/depAu/GCE， g. H2-HGNPs-PTCA-L-Cys 1/DNAzyme+ Pb2+/MCH 0/depAu/GCE；（B） comparison of ECL signals with different singal label. Potential scan range is from

1.5 V to 0 V.

3.6 ECL傳感器的響應性能

配制不同濃度的Pb2+標準溶液，在其它條件不變的情況下進行ECL檢測。實驗結果如圖6所示，以ECL強度變化值ΔI對Pb2+濃度的對數值lgc作圖，可見Pb2+濃度在1012～106 mol/L范圍內與ECL響應信號呈現良好的線性關系，線性方程為ΔI=451.5lgc/（mol/L）+ 6861（r=0.9908），檢出限為10

12 mol/L（S/N=3）。將本方法和其它的Pb2+檢測方法進行了對比（表2），可以看出，本實驗中設計的Pb2+ ECL傳感器具有較寬的檢測范圍，可用于檢測微量Pb2+。

電感耦合等離子體發射光譜法

Inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP OES2.4×107～2.4×106

熒光光譜法 Fluorescent spectrometry， FL3.3×1010～8.0×109表面增強拉曼散射法 Surface-Enhanced Raman Scattering， SERS109～105致化學發光 Electrochemiluminescence， ECL1012～106This work

3.7 ECL傳感器的穩定性

對不同濃度的Pb2+標準溶液進行ECL檢測，如圖7所示，從a到g的曲線依次代表濃度從1×10

12～1×106 mol/L的Pb2+標準溶液，每個濃度下選取連續3圈掃描得到的ECL信號強度基本沒有變化，說明我們制備的ECL傳感器具有較好的穩定性。

圖6 傳感器在不同鉛離子濃度下的ECL信號（從下向上： 10

12 mol/L，1011 mol/L，1010 mol/L，109 mol/L，108 mol/L，107 mol/L，106 mol/L），插圖為線性關系曲線。

Fig.6 ECL signal of sensors in different concentrations of lead ions （from bottom to up： 1012 mol/L， 1011 mol/L， 1010 mol/L，109 mol/L，108 mol/L， 107 mol/L， 6 mol/L）. Inset shows the linear calibration curve.

3.8 ECL傳感器的選擇性

如圖8所示，在各干擾離子濃度均為104 mol/L時，106 mol/L Pb2+的ECL響應信號遠高出其它金屬離子，表明所構建的傳感器具有良好的選擇性。

4 結 論

本研究通過Pb2+引發脫氧核酶剪切底物核酸鏈，實現目標物循環，并基于苝酐衍生物功能化空心納米金信號探針，建立了一種Pb2+ ECL傳感器。該傳感器具有價廉、靈敏度高、選擇性高的特點，其檢測線性范圍為1×1012～1×106 mol/L，而且一些常見的金屬離子對此Pb2+傳感器不會造成干擾，可望用于實際樣品中微量Pb2+的檢測。

References

1 GAO Xiao-Xia， JIA Yu-Hua， YANG Jin-Feng， LI Ji-Shan， YANG Rong-Hua. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（5）： 670-674

高曉霞， 賈玉華， 楊金鳳， 李繼山， 楊榮華. 分析化學， 2013， 41（5）： 670-674

2 He Q W， Mille E W， Wong A P， Chang C J. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128： 9316-9317

3 GB 5009.12—2010. Determination of Lead in Foods. National Food Safety Standard. National Standards of the People′s Republic of Chinaendprint

食品中鉛的測定. 食品安全國家標準. 中華人民共和國國家標準. GB 5009.12-2010

4 GB 5749-2006. Standards of Drinking Water Quality. National Standards of the People′s Republic of China

生活飲用水衛生標準. 中華人民共和國國家標準. GB 5749-2006

5 HE Xiao-Min， WANG Min， WANG Xiao-Dong， XUE Ai-Fang， LI Sheng-Qing， CHEN Hao. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2007， 27（11）： 2353-2356

賀小敏， 王 敏， 王小東， 薛愛芳， 李勝清， 陳 浩. 光譜學與光譜分析， 2007， 27（11）： 2353-2356

6 Tarley C R T， Andrade F N， de Oliveira F M， Corazza M Z， de Azevedo L F M， Segatelli M G. Anal.Chim. Acta， 2011， 703： 145-151

7 dos Santos J， dos Santos A B， Herrmann A B， Kulik S， Baika L M， Tormen L， Curtius A J. Brazilian Archives of Biology and Technology， 2013， 56： 127-134

8 ZHAO Ai-hong WANG Jian-hua SONG Zhi-gang FAN Guang-hua LIU Chun-Xiao. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2006， 26（11）： 2137-2139

趙愛紅 王建華 宋志剛 樊廣華 劉春曉. 光譜學與光譜分析， 2006， 26（11）： 2137-2139

9 Tang M L， Wen G Q， Luo Y H， Kang C Y， Liang A H， Jiang Z L. Luminescence. 2015， 30： 296-302

10 Fu C C， Xu W Q， Wang H L， Ding H， Liang L J， Cong M， Xu S P. Anal. Chem.， 2014， 86（23）： 11494-11497

11 Huang R F， Liu H X， Gai Q Q， Liu G J， Wei Z. Biosens. Bioelectron.， 2015， 71： 194-199

12 Qiu S Y， Gao S， Zhu X， Lin Z Y， Qin B， Chen G N. Analyst， 2011， 136： 1580-1585

13 Liu Z Y， Qi W J， Xu G B. Chem. Soc. Rev.， 2015， 44： 3117-3142

14 Cao Y L， Yuan R， Chai Y Q， Mao L， Niu H， Liu H J， Zhuo Y. Biosens. Bioelectron.， 2012， 31： 305-309

15 Yao W， Wang L， Wang H Y， Zhang X L. Electrochim. Acta， 2008， 54： 733-737

16 Ma M N， Zhang X， Zhuo Y， Chai Y Q， Yuan R. Nanoscale， 2015， 7： 2085-2092

17 LiuY T， Zhang Q Q， Wang H J， Yuan Y L， Chai Y Q， Yuan R. Biosens. Bioelectron.， 2015， 71： 164-170

18 Zhuo Y， Zhao M， Qiu W J， Gui G F， Chai Y Q， Yuan R， J.Electroanal. Chem.， 2013， 709： 106-110

19 Gui G F， Zhuo Y， Chai Y Q， Liao N， Zhao M， Han J， Zhu Q， Yuan R， Xiang Y. Biosens. Bioelectron.， 2013， 47： 524-529

20 Swearingen C B， Wemette D P， Cropek D M， Lu Y， Sweedler J V， Bohn P W. Anal. Chem.， 2005， 77（2）： 442-448

21 Li Q， Zheng J Y， Yan Y L， Zhao Y S， Yao J N. Adv. Mater.， 2012， 24： 4745-4749endprint