石英晶體微天平和原子力顯微鏡識別糖類化合物的苯硼酸接枝聚合物多層薄膜

袁文靜+鐘+彤+閆晶+薛中原+齊偉+王樺

摘 要 硼酸受體識別體系近年來被廣泛用于糖的分子識別研究，硼酸在一定酸度條件下，可特異性結合含順式鄰位多羥基的物質（如二醇、糖等）。本實驗利用EDC/NHS化學交聯，3-氨基苯硼酸 （APBA） 與聚丙烯酸 （PAA） 反應，制得苯硼酸接枝的聚合物PAA-PBA，進而將此聚合物進行層層組裝，獲得苯硼酸功能化薄膜。利用石英晶體微天平（QCM）和原子力顯微鏡（AFM）分別從宏觀和微觀的角度監測分析了此薄膜表面對糖類化合物的識別性質。結果表明此類薄膜對一定濃度（>50 μg/mL）的糖類化合物均能表現出明顯識別，其中，對果糖識別最為明顯。此體系抗干擾性好，可重復使用，長期保存后仍能較好保持性能。微觀表面形貌觀察發現糖類化合物在薄膜表面識別均勻，識別后薄膜表面粗糙度發生明顯變化。本研究成果可望用于開發高選擇性、高靈敏度的糖識別體系。

關鍵詞 苯硼酸； 層層組裝技術； 糖識別； 石英晶體微天平； 原子力顯微鏡

1 引 言

糖作為生物體能源物質，在生命活動中起著不可替代的作用。識別生物體中各種糖已成為生命科學各領域的主要研究內容，建立高靈敏和高選擇性的糖分子識別方法在生命科學領域中有著重要意義。近年來，硼酸受體識別體系被廣泛用于糖的分子識別研究，硼酸在一定酸度條件下，可特異性結合含順式鄰位多羥基的物質（如二醇、糖等）。與酶法相比，硼酸受體識別體系無需酶介體且識別作用是可逆的，但多數在溶液中進行，其用作功能膜識別糖的研究尚較少開展[1～3]。

近年來，層層組裝多層膜在生物傳感器、藥物傳輸載體、光學器件、電催化等方面開展了許多工作，并引起廣泛關注。層層組裝技術是由帶相反電荷的聚電解質通過靜電作用層層組裝形成多層膜的技術[4～7]。由于具有組裝過程操作簡便，適用范圍廣泛，薄膜厚度易于控制，成分易于調節等優點，而引起了人們極大的興趣。

石英晶體微天平（QCM）具有高度的靈敏性，可監測到納米范圍內薄膜的厚度變化和納克范圍內痕量物質質量的變化，特別適合薄膜的質量、厚度的測量，生物/化學傳感器及痕量物質在表面的吸附過程研究，在分析科學研究中應用廣泛，特別在聚合物多層薄膜的結構與性能研究中的應用備受關注[8，9]。原子力顯微鏡（AFM）是重要的表面分析工具，適用于各種體系的表面分析及各環境的現場測定，其分辨率可達原子級水平[8，10]。QCM獲得的宏觀動態數據和AFM獲得的微觀靜態信息相結合，有利于在分子水平上理解硼酸受體與糖分子間的識別作用及機理。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜（美國尼高力公司）；UV-3600紫外光譜（日本島津公司）；ESCALab 250XiX光電子能譜（XPS，美國賽默飛公司）測試；Q-Sense E4 QCM（瑞典）；Nanoscope IIIa掃描探針顯微鏡（美國Digital Instruments公司）。

聚丙烯酸（PAA，Mn 130000）、3-氨基苯硼酸半硫酸鹽（APBA）、N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、50% （w/V）聚乙烯亞胺（PEI）、Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate （TRITC）、4-（2-羥乙基）哌嗪-1-乙磺酸 N-（2-羥乙基）哌嗪-N′-（2-乙磺酸）（HEPES）、抗壞血酸（AA）、尿素（UA）和多巴胺（DA）均購自美國Sigma-Aldrich公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、葡萄糖等購自天津市廣成化學試劑有限公司。實驗所用緩沖溶液為50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和50 mmol/L HEPES緩沖溶液，所有實驗用水均為Millipore超純水。

2.2 苯硼酸接枝聚合物PAA-PBA的合成

PAA-PBA利用EDC/NHS交聯法使PAA的羧基與APBA的氨基反應，形成酰胺鍵[11，12]：3 mmol PAA溶于HEPES緩沖溶液中，調節至pH 8.5，加入25 mL 0.06 mol/L APBA溶液， 4 mL 0.03 mol/L NHS和等量EDC，攪拌12 h。用清水透析1周后，凍干，即得PAA-PBA。

2.3 PEI/PAA-PBA多層膜的組裝

在石英晶體電極（13.7 mm石英晶體和5.1 mm金電極）表面組裝時，先將金電極表面徹底清潔。首先，加入500 μL 10% SDS溶液，用棉棒擦拭，用超純水洗去剩余溶液，并用氮氣吹干表面。然后用3 μL Piranha溶液（濃H2SO4-30% H₂O₂，7∶3，V/V）覆蓋整個金電極表面，10 min后，用超純水清洗。在清潔的金表面開始組裝第一層，取500 μL PEI溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入檢測池，直到儀器信號穩定，20 min后，用超純水清洗3次，加入第二層組裝，500 μL PAA-PBA溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入檢測池，直到信號穩定，依此循環，直到所需層數。QCM實時記錄組裝過程頻率變化。

在石英片、硅片表面組裝PEI/PAA-PBA多層膜進行同樣的操作，分別用紫外可見光譜和原子力顯微鏡表征。

3 結果與討論

3.1 苯硼酸接枝聚丙烯酸PAA-PBA的合成與表征

苯硼酸接枝的聚丙烯酸是借助EDC和NHS的化學交聯合成獲得的，合成原理如圖1所示。首先，產物PAA-PBA利用傅里葉變換紅外光譜儀進行了光譜測試，紅外譜圖（圖2）中2950 cm

對應PAA中亞甲基的伸縮振動，1565和1678 cm1為酰胺鍵的伸縮振動峰，由于苯環的特征峰也在附近，因而交聯體的峰更強一些，這在PAA-PBA中均檢測到。1361 cmendprint

為硼酸基團中BO鍵的伸縮振動吸收峰；1438 cm為苯環變形振動特征位置，這表明PAA和APBA已發生了交聯反應，形成了PAA-PBA。

另外，通過XPS測試獲得產物PAA-PBA的元素分析結果（圖3）表明，產物中存在B，N等元素，含量較低，信號較弱，但仍可計算出，APBA在PAA上的接枝率約為38%。因此，PAA-PBA中仍然有大量的自由羧基存在，這為后期的靜電組裝提供了便利。

圖1 3-氨基苯硼酸接枝聚丙烯酸反應示意圖

Fig.1 Synthetic scheme of poly（acrylic acid）-phenylboronic acid （PAA-PBA）

3.2 PEI/PAA-PBA多層薄膜的表征

帶正電的聚乙烯亞胺作為第一層組裝在處理過的石英晶體電極上，含較多羧基的PAA-PBA在

圖2 3-氨基苯硼酸和接枝產物PAA-PBA的紅外光譜圖

Fig.2 FTIR spectra of 3-aminophenylboronic acid hemisulfate （APBA） and PAA-PBA

pH 9.0時帶明顯負電荷，作為第二層進行組裝，依此循環，直至所需層數。組裝的多層膜分別用紫外-可見光譜、QCM和AFM進行了觀測。

圖3 接枝產物PAA-PBA的XPS圖

Fig.3 XPS spectra of PAA-PBA

為了更清楚監測其組裝過程，用TRITC對PEI進行了熒光標記，由圖4可見，550 nm峰強隨著組裝層數的增加而明顯增強，表明組裝的成功進行。QCM也可監測到層層組裝的發生，由共振頻率的減少反映出電極表面質量的增加，隨著組裝層數增加，共振頻率降低越來越顯著，證明了薄膜的成功組裝（圖5）。AFM也可以觀察到組裝不同層數的表面形貌變化，如圖6所示，分別表示組裝2個雙層、4個雙層、6個雙層的PEI/PAA-PBA薄膜。原子力顯微鏡下呈現典型的層層組裝多層膜的表面形貌，表面由連續的結節組成，隨著組裝層數增加，結節逐漸變大。

圖4 （PEI/PAA-PBA）n 多層膜組裝紫外光譜圖（A）及其石英晶體微天平監測共振頻率變化圖（B）

Fig.4 UV-vis spectra （A） and frequency shift （B） observed during assembly of （PEI/PAA-PBA）n multilayer

PEI： Poly（ethyleneimine）.

圖5 原子力顯微鏡觀測不同層數（PEI/PAA-PBA）n 多層膜的表面形貌圖（5 μm×5 μm）： （A） （PEI/PAA-PBA）2； （B） （PEI/PAA-PBA）4； （C） （PEI/PAA-PBA）6

Fig.5 AFM height images of （A） （PEI/PAA-PBA）2 multilayer， （B） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer and （C） （PEI/PAA-PBA）6 multilayer

3.3 PEI/PAA-PBA多層薄膜對葡萄糖的識別

薄膜對葡萄糖的識別通過QCM技術實時監測，記錄不同層數的薄膜對相同濃度的葡萄糖溶液（100 μg/mL）的識別時間曲線（圖6）。圖7顯示了典型的共振頻率變化，在空白電極表面，在監測時間范圍內沒有看到頻率變化。在1個雙層薄膜表面，觀察到頻率的變化，但是頻率減少較弱，說明識別在薄膜上的糖分子少，表明兩者間的識別作用弱。隨著組裝層數增加，薄膜表面PBA基團越來越多，對糖的識別作用逐漸增強，頻率減少程度增大，直到達到5個雙層后，識別不再有明顯增加，說明在薄膜表面的識別已達到飽和。

為準確探討薄膜與糖的識別作用，選4個雙層的薄膜為模型體系，監測了不同濃度葡萄糖溶液在此膜表面的識別性質。圖7表明，當葡萄糖濃度較低時，如50 μg/mL，共振頻率變化很小，表明二者識別作用弱，而當葡萄糖濃度達到100 μg/mL時，共振頻率有了顯著的變化，這時識別作用增強，進一步地增加葡萄糖濃度到300 μg/mL后，識別作用又有了明顯增強，但當葡萄糖溶液濃度增加至500 μg/mL時，識別作用不再有明顯的增強，表明此時識別作用已達平衡。

圖6 不同層數PEI/PAA-PBA多層膜對100 μg/mL的葡萄糖溶液的QCM頻率變化曲線

Fig.6 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）n multilayer to glucose at concentration of 100 μg/mL

圖7 （PEI/PAA-PBA）4膜對不同濃度葡萄糖溶液的QCM頻率變化曲線

Fig.7 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose with different concentrations

圖8 （PEI/PAA-PBA）4膜對葡萄糖識別前后的原子力顯微鏡觀察圖（10 μm×10 μm）： （A）識別前形貌圖； （B）識別前相圖；（C）識別平衡后形貌圖； （D）識別平衡后相圖

Fig.8 （A） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before recognition to glucose， （B） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before the recognition to glucose， （C） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucose and （D） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucoseendprint

利用AFM技術對葡萄糖在薄膜表面的被識別行為進行了表面分析。圖8顯示了識別前和識別平衡后的薄膜表面，表面粗糙度Ra在2.494～3.502 nm之間明顯變化，同時，PEI/PAA-PBA膜表面識別結合葡萄糖比較均勻。

3.4 PEI/PAA-PBA多層薄膜對其他糖類化合物的識別

圖9顯示了此薄膜對其它糖類化合物的識別性質，相比相同濃度的葡萄糖、甘露糖及半乳糖，薄膜對果糖識別更明顯，而對其它3種糖識別性能相似，這是因為果糖是唯一含2個順式二元醇的分子，會與硼酸基產生更強的識別作用[12]。

圖9 （PEI/PAA-PBA）4膜對相同濃度100 μg/mL的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖的QCM頻率變化曲線

Fig.9 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose， fructose， mannose and galactose with same concentration of 100 μg/mL

3.5 PEI/PAA-PBA多層薄膜的干擾實驗、重復利用和穩定性

為了進一步考察此類薄膜材料用于實際樣品檢測的可能性，分別考察了生命體內常見干擾物質AA、UA、DA等，研究其抗干擾能力。由圖10可見，加入干擾物質未影響此薄膜對糖類化合物的識別，并且此薄膜對AA、UA、DA等干擾物質都完全沒有識別作用。這表明此類薄膜的抗干擾性好，能用于實際樣品的檢測。

圖10 （PEI/PAA-PBA）4膜對300 μg/mL葡萄糖（A）在100 μg/mL AA和100 μg/mL UA的干擾下；（B）在100 μg/mL DA的干擾下的QCM頻率變化曲線

Fig.10 Time courses of frequency shift observed during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose concentration of 300 μg/mL （A） in the absence and the presence of ascorbic acid （AA）， uric acid （UA）； （B） in the absence and presence of dopamine （DA）

如前所述，硼酸基與順式二元醇的識別是可逆的，這種識別高度依賴體系酸度，圖11A表明，此薄膜在pH 8.0體系中，原已識別的葡萄糖會脫落，兩者不再存在相互作用；而在pH 10.0時，體系沒有明顯變化，說明此條件下識別作用能夠穩定存在；pH≤8.0時，已經識別的葡萄糖會從薄膜表面脫落，此薄膜可重復使用。將重復使用1次、2次的薄膜分別與新鮮制備的薄膜對比，發現三者對相同濃度葡萄糖的識別基本沒有差別，這些結果進一步證明了PEI/PAA-PBA薄膜對糖的識別是可逆的，并可重復使用，這也正是此類薄膜擬作為傳感識別體系的優勢所在。

圖11 （A）識別了葡萄糖的（PEI/PAA-PBA）4膜在pH 8.0和pH 10.0時的QCM頻率變化曲線 ；（B）重復利用的（PEI/PAA-PBA）4膜識別300 μg/mL葡萄糖的QCM頻率變化曲線

Fig.11 Time courses of frequency shift observed （A） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer recognized with glucose at pH 8.0 and pH 10.0， respectively； （B） during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer newly fabricated， that recycled once and twice to glucose at the concentration of 300 μg/mL， respectively

考察了此薄膜的長期穩定性，將薄膜修飾的晶體電極置于4℃條件下保存，每周測試其對相同濃度葡萄糖的識別響應，在4周內，QCM響應曲線基本沒有發生變化，表明此薄膜長期保存后仍能較好地保持對糖的識別性能。這是與酶法體系相比的另一優勢，蛋白類氧化酶雖然催化活性高，但易受環境干擾而失活。

4 結 論

合成了苯硼酸接枝的高分子化合物PAA-PBA，通過靜電層層組裝獲得了PBA功能化表面，并分別用QCM和AFM技術表征了此表面對葡萄糖等糖類化合物的識別性能。結果表明，此類薄膜能夠明顯識別葡萄糖、果糖、甘露糖及半乳糖等糖類化合物，其中對果糖識別最為明顯，并且，此體系抗干擾性和穩定性好，可重復使用，同時，此方法體系可擴展至其他苯硼酸接枝聚合物，適用性廣，可望應用于食品、醫藥等相關領域傳感識別體系的開發。

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