天藍苜蓿鋅脅迫下實時定量PCR內參基因篩選

張德輝，孫亞麗，趙 亮，丑敏霞（西北農林科技大學生命科學學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100）

天藍苜蓿鋅脅迫下實時定量PCR內參基因篩選

張德輝，孫亞麗，趙 亮，丑敏霞*（西北農林科技大學生命科學學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100）

選取8個管家基因（h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh）作為候選內參基因，以不同濃度Zn2+處理下接菌第30d的天藍苜蓿（Medicago Lupulina L.）接種根為實驗材料，篩選用于目的基因實時熒光定量PCR分析的最佳內參基因.研究表明：候選內參基因平均表達穩定性由高到低排序為：ef1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub；在不同Zn2+濃度脅迫下，最適內參基因組合各不相同：Zn2+=100mg/kg時，最佳內參基因組合為tub （1.97）和ef1 （2.06）； Zn2+=200mg/kg時，最佳內參基因組合為ef1 （1.41）和ubi （2.51）； Zn2+=300mg/kg時，最佳內參基因組合為ef1 （1.41）和h2a （2.78）； Zn2+=400mg/kg時，最佳內參基因組合為ef1 （2.45）和act （2.55）.該研究可為重金屬污染地天藍苜?？剐曰蚝凸采虻谋磉_分析提供理論依據.

天藍苜蓿；接種根；內參基因；實時熒光定量PCR；鋅

土壤是人類賴以生存的主要資源之一，隨著工業經濟的發展，土壤污染尤其是重金屬污染尤為突出［1-2］，而某些微生物、植物與微生物共生體對重金屬污染土壤的修復發揮著重要作用［3］.重金屬污染的土壤，氮素不足是限制植被恢復的關鍵因子之一，因此提高重金屬污染土壤中氮素水平成為生態修復的首要工作［4］.豆科植物---根瘤菌的共生體系因其卓越的固氮能力，常作為尾礦地環境修復的先鋒植物.

目前，許多國家都非常重視重金屬耐性豆科植物的選擇和根瘤菌的研究以及利用豆科植物根瘤菌共生體系進行重金屬污染地修復的實踐. Piha等［5］在Sn礦尾礦地進行植被重建的試驗研究顯示，豆科植物具有良好的成活率和較好的生長速度；他同時指出，耐性豆科植物可以與根瘤菌共生而克服廢棄地瘦瘠所帶來的障礙.Jha等［6］利用豆科灌木修復石灰石采石場廢棄地及Smyth等［7］利用豆科植物修復煤礦廢棄地，所有這些實踐都是非常成功的.豆科植物分子水平抗性基因、共生基因的篩選及其功能研究受到廣泛關注［8-9］.利用豆科植物---根瘤菌共生固氮作用在重金屬污染的尾礦廢棄地土壤植被修復和生態重建的研究也日趨成熟，這也為污染土壤重金屬控制和修復提供了較為完整的理論和實踐基礎.

近年來，對植物內參基因的篩選已有眾多報道［10-12］，但對豆科植物內參基因篩選只有花生、黑吉豆等［13-14］少數報道.大多數內參基因篩選局限在不同時期不同組織、生物脅迫以及非生物脅迫中干旱和鹽脅迫樣本，對于豆科植物在重金屬脅迫下內參基因的篩選鮮有報道.然而對于這方面的研究，將有助于對豆科植物抗性基因、共生基因的表達研究.

實時定量PCR（qRT-PCR）具有靈敏度高、定量準確、特異性等特點，已廣泛應用于基因的表達分析［15］.利用qRT-PCR分析目的基因表達時，一個好的內參基因可以消除RNA提取質量以及反轉錄效率等所帶來的背景誤差［16-17］，因此篩選特定背景下最適內參基因對目的基因表達分析至關重要.

本研究選取選取8個管家基因作為候選內參基因：組蛋白基因（Histone H2A，h2a）、肌動蛋白基因（Actin，act）、18S核糖體RNA基因（18S ribosomal RNA，18s）、β-微管蛋白基因（Tubulin beta chain，tub）、泛素蛋白基因（Ubiquitin，ubi）、延伸因子-1α基因（Elongation factor 1-alpha，ef1）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh）、親環蛋白基因（cyclophilin，cyp）.管家基因編碼蛋白不僅是細胞器骨架基本組分（actin、tub）、真核生物染色體基本結構蛋白（h2a）和廣泛存在于原核和真核生物中的胞漿蛋白（cyp），還參與生物體的基本代謝過程（gapdh、ef1、ubi），因此，理論上管家基因在生物體內都是穩定表達的.此外，18S核糖體RNA調控合成獨立于信使RNA，因此核糖體RNA的轉錄表達較為穩定，常被用作內參基因來校正目的基因的表達.

本實驗對不同Zn2+濃度處理下天藍苜蓿接種根實驗數據分析篩選最適內參基因組合，為重金屬污染土壤修復過程中抗性基因、共生基因的表達分析提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料

供試天藍苜蓿（Medicago Lupulina L.）種子和苜蓿中華根瘤菌CCNWSX0020（Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020）（該菌具有良好的鋅抗性）均由本實驗室提供.

1.2 方法

1.2.1 天藍苜蓿種植及樣品采集 天藍苜蓿種子脫皮，無菌水沖洗6～8次，95%（V/V）酒精浸泡1min，30%（V/V））NaClO處理2min，最后用無菌水沖洗6～8次用于播種.播種前，每個花盆裝入200g基質（蛭石與珍珠巖按體積比為2：1形式充分混勻），121℃滅菌1h；實驗組加入不同濃度的硫酸鋅（Zn2+濃度：100， 200， 300， 400mg/kg）模擬鋅污染.光照培養：將花盆置于智能植物培養箱，培養箱參數為：16h光照/8h黑暗，溫度為（24±2）℃，濕度為40%，光照強度為4級.當幼苗長出第一片真葉，接種根瘤菌CCNWSX0020，期間無氮營養液［18］和無菌水交替澆水，取接菌后30d天藍苜蓿共生根于液氮迅速冷凍后置于-80℃保存用于RNA提?。拷M樣品重復3次）.

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 利用RNAiso Plus試劑盒（TaRaKa公司）提取RNA，提取流程按照說明書進行.對所提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測（OD260/280= 1.8～2.0， OD260/230＞2.0）.利用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaRaKa公司）將提取的RNA（0.5μg）按照說明書合成cDNA置于-20℃保存備用.

1.2.3 引物設計及其特異性檢測 本研究選取8個功能不同的管家基因：h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、gapdh、cyp作為候選內參基因.利用Primer5.0軟件參考蒺藜苜蓿相關基因cDNA序列設計引物.引物特異性檢測：不同濃度Zn處理樣品cDNA等量混合，普通PCR擴增候選內參基因瓊脂糖凝膠電泳檢測并送上海英濰捷基公司測序.qRT-PCR分析溶解曲線.

1.2.4 熒光定量PCR分析及擴增效率檢測 反轉錄產物cDNA稀釋10倍，使用SYBR?Primix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa公司）用于qRT-PCR反應.各內參基因的熒光定量反應在CFX 96TMRealTime System（Bio-Rad）熒光定量儀上進行.反應體系為20μL，其中SYBR?Primix Ex TaqTM（2×）10μL，ddH2O 5.4μL，cDNA模板3μL，上、下游引物（10mmol/L）各0.8μL.反應程序為：95℃預變性2min；95℃變性5s；60℃退火30s；72℃延伸30s；39個循環.

引物擴增效率檢測：所有樣品cDNA等量混合用于PCR擴增，擴增產物稀釋104后，依次稀釋5， 52， 53， 54， 55倍用于qRT-PCR擴增，制作標準曲線并計算引物擴增效率.

1.2.5 Cycle threshold（Ct）值比較 對各候選內參基因在所有樣品中Ct值比較分析，通過SigmaPlot 10.0軟件作圖，得出各候選內參基因在樣品中Ct值分布范圍，反映各候選內參基因在綜合脅迫下平均表達水平.比較同一候選內參基因在不同Zn2+濃度處理樣品中Ct值變化，反映各候選內參基因在不同樣品中的相對表達量.

1.2.6 候選內參基因穩定性分析 通過在線評估內參基因穩定性工具（http：//www.leonxie. com/referencegene.php）分析候選內參基因的穩定性［19］.該在線工具集合了the comparativeΔCt method［20］， BestKeeper［21］， NormFinder［22］和geNorm［23］4個穩定性評估軟件；此外，該在線工具對以上4個軟件計算結果進行綜合分析，得到各候選內參基因綜合排名.

1.2.7 評價候選內參基因最適數目 候選內參基因最適數目通過geNorm軟件計算基因的配對變異值Vn/n+1確定內參基因的最適數目.利用geNorm軟件計算n個基因作為內參基因得出的標準化因子與n+1個基因作為內參基因得出的標準化因子的配對變異值Vn/n+1.一般認為當Vn/n+1＜0.15時，表明研究目的基因表達過程中使用n個內參基因可以得到準確結果，沒有必要引入第n+1個內參基因.

2 結果與分析

2.1 引物特異性及擴增效率檢測

凝膠電泳檢測普通PCR擴增產物，結果顯示：只有特異性擴增條帶，無其它雜帶，且片段大小與目的條帶一致（測序結果與目的基因序列一致）. qRT-PCR溶解曲線顯示：只有單一主峰，沒有其它雜峰出現，說明所設計引物特異性良好.引物擴增效率均在85%～100%.所設計引物符合實驗要求（表1）.

表1 候選內參基因引物Table 1 Primers used to amplify candidate reference genes

2.2 候選內參基因在樣品中的平均表達水平

圖1 候選內參基因平均表達水平Fig.1 Average expression levels of candidate reference genes

利用比較Ct值的方法評估各候選內參基因在所有樣品綜合脅迫下平均表達水平（圖1）.由圖1可知，綜合脅迫下：18s的Ct值最小，平均表達水平最高，cyp的Ct值最大，平均表達水平最低；其它各候選內參基因平均表達水平相差不大，Ct值集中在22～28.

2.3 候選內參基因在不同樣品中相對表達量

由圖2可知，同一候選內參基因在不同Zn2+濃度處理下其表達水平各異，但隨著Zn2+濃度的升高，Ct值總體呈現上升趨勢，候選內參基因表達呈下降趨勢.

圖2 候選內參基因不同樣品中相對表達量Fig.2 Relative expression of candidate reference genes in different samples

2.4 所有樣品中候選內參基因穩定性分析

表2 所有樣品中候選內參基因的表達穩定性Table 2 Expression stability of candidate reference genes in all samples

利用在線評估工具分析所有樣品中候選內參基因的穩定性（表2）.由表2可知：18s和tub是最不穩定內參基因； the comparative ΔCt method，BestKeeper， NormFinder分析表明ef1是最穩定的內參基因， h2a、ubi、act是穩定性較好的內參基因. geNorm分析表明act、ubi是最穩定的內參基因， ef1、h2a是穩定性較好的內參基因.通過對上述四個軟件結果的綜合分析進行綜合排名（穩定性由高到低）：ef1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub.

2.5 候選內參基因在不同Zn2+濃度脅迫下穩定性分析

在線評估不同Zn2+濃度脅迫下候選內參基因穩定性，得到候選內參基因穩定性綜合排名（表3）. Zn2+＜100mg/kg時， tub為最穩定內參基因，ef1是較好內參基因； Zn2+＞200mg/kg時， ef1為最佳內參基因， 18s、tub為最不穩定內參基因.

對不同Zn2+濃度處理下內參基因穩定性分析表明：在低濃度（＜100mg/kg）處理下，tub （1.97）為最佳內參基因而中高濃度（＞200mg/kg）脅迫下，tub穩定性隨Zn2+濃度的升高變化較大（表3）.據相關報道表明Tubulin蛋白與鈣離子密切相關［24］，在天藍苜蓿與根瘤菌共生結瘤過程中，伴隨鈣流、鈣峰的形成［25-26］，隨著Zn濃度的升高，結瘤數目越來越少，當Zn濃度達到400mg/kg時，結瘤數幾乎為0，這與tub隨Zn濃度升高越來越不穩定一致.因此當Zn濃度不足以對天藍苜蓿共生互作造成明顯影響時可以使用tub作為內參基因，但在中高濃度下研究基因表達時應避免使用tub作為內參基因.同時進一步說明篩選最佳內參基因的必要性.

表3 候選內參基因在不同鋅濃度脅迫樣品中穩定性Table 3 Stability of candidate reference genes in different zinc stress concentration

2.6 最適內參基因數目判定

越來越多的實驗表明，使用2個或2個以上內參基因校正目的基因表達可以保證結果準確性［27］.利用geNorm軟件判定本研究最適內參基因數目，對所有樣品或某一Zn2+濃度處理樣品分析，V2/3均小于0.15（圖3）.分析表明研究天藍苜蓿接種根Zn脅迫下基因表達分析時，選取兩個內參基因足以得到準確結果.

目前，對內參基因篩選大多使用geNorm單一軟件或兩個軟件結合［28-30］，這就不可避免帶來分析誤差.本研究使用在線評估內參基因穩定性工具，該工具不僅包含了ΔCt method、BestKeeper、NormFinder、geNorm分析軟件而且綜合4個軟件分析結果給出綜合排名，避免了單一軟件分析帶來的誤差.

圖3 geNorm軟件評估最適內參基因數目Fig.3 Evaluation of optimal number of reference genes for normalization by geNorm

3 結語

本研究通過the comparative ΔCt method、BestKeeper、NormFinder、geNorm分析軟件以及依據上述4個軟件得出的結果綜合分析，對8個候選內參基因進行穩定性排名.結果表明天藍苜蓿接種根在低濃度Zn2+處理下tub是最穩定內參基因，中高濃度脅迫下ef1是最佳內參基因，最后根據不同Zn2+濃度處理選擇最適的內參基因組合.這為研究重金屬Zn污染土壤基因的表達研究提供參考.

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Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in Medicago Lupulina under zinc stress.

ZHANG De-hui， SUN Ya-li， ZHAO-Liang， CHOU-Min-xia*（College of Life Sciences， State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas， Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling 712100， China）. China Environmental Science， 2015，35（3）：833～838

Expression stability of candidate reference genes （h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh） was tested for qRT-PCR during growth conditions under the different zinc stress. The roots of Medicago lupulina inoculated with rhizobia were harvested in 30days as plant materials. Our results showed that the average expression stability of the eight candidate reference genes from high to low was ef1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub overall. Specifically， tub （1.97）and ef1 （2.06） were better reference genes under the low Zn2+concentration （100mg/kg）； The genes ef1 （1.41） and ubi（2.51） were the best genes under Zn2+concentration （200mg/kg）； Under Zn2+concentration （300mg/kg）， ef1 （1.41） and h2a （2.78） were the most comparatively suitable genes； while ef1 （2.45） and act （2.55） were considered as the most reliable reference genes under the high Zn2+concentration （400mg/kg）. In conclusion， All results provide the theoretical foundation for gene expression study in Medicago lupulina under the different Zn2+concentration.

Medicago Lupulina；the inoculated roots；reference gene；quantitative real-time PCR；Zn

X53

A

1000-6923（2015）03-0833-06

張德輝（1989-），男，山東武城縣人，西北農林科技大學碩士研究生，主要從事微生物資源與利用的研究.

2014-06-20

國家自然科學基金資助項目（31172252）

* 責任作者， 副教授， minxia95@126.com