新鮮冰凍血漿對腦損傷合并失血性休克大鼠的治療作用

范超勇 李東朋 郭德偉 田毅 姚寧 齊偉 楊波

(1.鄭州大學第一附屬醫院 神經外科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450051)

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)合并失血性休克(hemorrhagic shock，HS)病情較嚴重、死亡率高［1］，早期液體復蘇對于挽救患者生命尤為重要。目前常用的輸注大量晶體液復蘇易引起細胞外水腫、酸中毒［2］。有研究發現，普通膠體液會引起凝血機制障礙，對腦組織的保護作用不明顯［3－4］。Hwabejire 等［5］采用新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma，FFP)復蘇TBI合并HS 豬模型，發現FFP 通過改善腦灌注，減少谷氨酸鹽介導的神經毒性從而發揮腦保護作用。但FFP作為復蘇液體，對TBI 合并HS 的治療作用尚不明確。本研究通過采用FFP 給予TBI 合并HS 大鼠早期復蘇，觀察其對大鼠腦水腫、血腦屏障、神經功能、神經細胞生存狀況的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 133 只健康雌性SD 大鼠，體質量240～280 g，購自河南省實驗動物中心，合格證號:SCXK(豫)2010－0002。25 只采用Aghaloo 法制備新鮮冰凍血漿，余108 只隨機分為3 組:sham(假手術組)組(18 只)，vehicle(生理鹽水復蘇組)組與FFP(新鮮冰凍血漿復蘇組)組(各45 只)。10%水合氯醛與4%多聚甲醛(天津登科)，0.5%伊文氏藍染液(LEAGENE，DK0001)與尼氏染色液(碧云天，C0117)，大鼠腦立體定位儀，低溫離心機(Eppendorf AG22331Hamburg)、多通道生理信號記錄儀(成都泰盟BL－420E +)、美國哈希DR3900 分光光度計。

1.2 新鮮冰凍血漿的制備及檢測 SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(4 ml/kg)，無菌條件下每只大鼠心室內采血10.0 ml，加10%枸櫞酸鈉抗凝，低溫離心機中3 838 ×g 離心15 min 后分離血漿，－80 ℃冰箱迅速冰凍為FFP，用時37 ℃水浴箱搖床融化。

1.3 動物模型制作及分組干預 SD 大鼠麻醉后Feeney 改良法［6］制作顱腦損傷模型，用一重20 g 砝碼自40 cm 高處自由落下。術畢參照Wiggers 改良法［7］制作失血性休克大鼠模型。sham 組僅打開骨窗;vehicle、FFP 組制作創傷性腦損傷和失血性休克模型，休克期間維持MAP 于40 mm Hg 水平，持續60 min 后vehicle 組給予3 倍失血量的生理鹽水，FFP 組給予等于放血量的新鮮冰凍血漿，均30 min 輸注完畢，持續監測MAP、HR 至蘇醒。

1.4 大鼠神經運動功能評價 采用mNSS 對大鼠的神經功能行為進行評定。對各組大鼠在損傷前及復蘇后1、3、7 d 進行神經功能測定，分值越高，損傷越重。

1.5 腦水腫水平評估及血腦屏障通透性檢測 實驗各組術后1、3、7 d 麻醉處死，干濕重法測量腦組織含水量;各組術后2、6、12、24、72 h 麻醉處死，溴化乙錠(EB)染色法定性定量檢測血腦屏障完整性。分光光度計檢測樣品光密度值。四參數法制作標準曲線，計算各樣本EB 含量(μg/g)。

1.6 取材尼氏染色 傷后7 d 生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注取腦，脫水后石蠟包埋，冠狀位石蠟切片，片厚4 μm，甲苯胺藍染色法染色。于顯微鏡下觀察DG 區、CA1 區、CA3 區細胞變化并對染色細胞進行計數，采用Imaging－Pro－Plus (LEIKADMLB)軟件對切片進行定量分析。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行統計學分析。實驗數據采用均數±標準差(±s)表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 法，P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 新鮮冰凍血漿理化檢測情況 外觀黃色澄清液體，無色澤異常，無蛋白析出、重度乳糜，血漿蛋白含量≥50 g/L，Ⅷ因子≥0.7 IU/ml，無細菌污染。

2.2 腦水腫程度及血腦屏障通透性的檢測 1、3、7 d時vehicle 組與FFP 組較sham 組腦組織含水量明顯升高(P ＜0.05)，1、3、7 d 時FFP 組腦水腫程度均高于vehicle 組(P ＜0.05)(圖1)。EB 染色法測定腦組織EB 含量，2、6、12、24、72 h 時vehicle 組與FFP 組血腦屏障通透性較sham 組顯著增加(P ＜0.05);2 h 及6 h時vehicle 組與FFP 組EB 含量差異無統計學意義(P ＞0.05);12、24、72 h 時各組EB 含量差異有統計學意義(P ＜0.05)，且12、24、72 h 時FFP 組與vehicle 組EB 含量差異有統計學意義(P ＜0.05)(圖2)。

圖1 各組1、3、7 d 時腦組織含水量的變化

圖2 各組2、6、12、24、72 h 時腦組織EB 含量變化

2.3 mNSS 神經功能評分結果 mNSS 評分越高說明大鼠的神經功能障礙越嚴重，越低說明損傷越輕。FFP 組與vehicle 組在1 d 時mNSS 神經功能評分顯著增高，3 d 后下降。3、7 d 時FFP 組評分均低于vehicle組(P ＜0.05)(圖3)。

2.4 DG 區、CA1 區、CA3 區神經元細胞生存情況sham 組Nissl 染色可見DG 區、CA1 區、CA3 區較多排列緊密錐體細胞，細胞形態結構完整、染色質均勻分布，胞漿內含大量的尼氏小體。與sham 組相比，vehicle 組及FFP 組各區神經元大量脫失、排列疏松，輪廓模糊、界限不清，差異有統計學意義(P ＜0.05);vehicle 組與FFP 組相比，神經元數目更少，排列更加疏松，差異有統計學意義(P ＜0.05)(表1)。

圖3 各實驗組在1、3、7 d 時mNSS 神經功能評分情況

表1 FFP 對腦損傷大鼠皮質及海馬區域神經元存活的影響(±s)

表1 FFP 對腦損傷大鼠皮質及海馬區域神經元存活的影響(±s)

注:與sham 組比較，aP ＜0.05;與vehicle 組比較，bP ＜0.05。

組別 DG 區 CA1 區 CA3區sham 組2 585±142 1 931±134 1 786±86 vehicle 組 1 362±111a 1 090±210a 951±63a FFP 組 1 933±158ab 1 522±179ab 1 255±97 ab

3 討論

腦損傷合并失血性休克將加劇創傷患者的總體死亡率和致殘率［8］。有效的液體復蘇可以恢復并保持全身和腦循環，支持組織灌注和氧輸送，并減少誘發低血壓和腦缺氧長期神經損傷［9］。目前，臨床上常用的復蘇液體主要有晶體液和膠體液，晶體液包括生理鹽水、乳酸林格氏液及高滲鹽液等;膠體液主要分為人工膠體(白蛋白)和天然膠體(右旋糖酐、明膠、羥乙基淀粉)。最近的研究指出，在重大創傷休克患者的救治過程中，晶體液應盡量減少應用，因為大量的晶體復蘇與炎癥反應和組織水腫、腫脹相關，主張選用血液制品，如濃縮紅細胞(PRBC)和FFP 的控制復蘇［10－11］。給予HS 患者大量生理鹽水輸注雖能夠暫時性維持血壓，但快速擴容造成自身血管內細胞及血漿成分稀釋，晶體液快速滲透到組織間隙，損傷血管內皮細胞并引起組織間隙水腫，導致二次損傷［8］，對生理鹽水與白蛋白休克復蘇進行比較，表明采用生理鹽水復蘇的死亡率更高［12］。一些研究表明，膠體復蘇可以維持和增加血漿膠體滲透壓，減少血管內流體外滲進入腦間質，減輕腦腫脹，改善腦功能［13－14］。但有研究采用白蛋白進行復蘇，患者死亡率增加，可能原因是膠體液穿透破壞的血腦屏障，到達損傷區域，降解產物的形成促進組織水腫，加重腦損傷［5］。

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)在不可逆性原發性損傷之后，海馬神經元進行性死亡是顱腦外傷后的重要病理特征。研究證實TBI 后海馬CA1、CA3 和齒狀回等部位神經細胞丟失，突觸傳遞功能的改變是造成認知記憶障礙的原因。有學者發現，采用FFP 液體復蘇可以增加血漿及腦組織血小板活性，改善腦血流灌注，減少谷氨酸介導的興奮毒性繼發性腦損傷，降低線粒體功能障礙，從而發揮神經保護作用［14］。因此，改善腦外傷后腦組織灌注、減輕腦水腫、改善血腦屏障通透性可以保護神經細胞，促進神經功能的恢復。

本實驗結果證明，腦損傷合并失血性休克發生后應用新鮮冰凍血漿復蘇較普通晶體液可有效減輕大鼠腦組織的水腫，改善血腦屏障的通透性。應用FFP 復蘇組大鼠的神經功能改善情況優于生理鹽水復蘇組，并且DG 區、CA1 區、CA3 區神經元數量、形態結構較生理鹽水復蘇組有明顯改善。

綜上所述，對腦損傷合并失血性休克大鼠，新鮮冰凍血漿有減輕腦水腫、降低血腦屏障通透性、改善神經功能作用，為臨床救治此類重大創傷患者提供了一個新的思路，具體機制有待進一步探討。

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