mTOR、eIF4E在原發性肝細胞癌組織中的表達及意義

雷華文 馬秀現 宋黎明 孫玉嶺

(1.鄭州大學第一附屬醫院肝膽胰外科 河南鄭州 450052;2.鄭州大學附屬鄭州中心醫院 肝膽胰外科 河南鄭州 450007)

原發性肝細胞癌的發病和死亡均具有明顯的地域分布特征，河南省作為人口大省，原發性肝細胞癌的發病率一直位于我國前列。目前，臨床上對于肝癌的常用治療方法主要是手術切除、介入手術治療及放化療，但治療效果均欠佳。細胞內大量蛋白質的合成為腫瘤細胞分裂增殖所必不可少的條件［1］。近年發現，在腫瘤細胞分裂、增殖的過程中，哺乳動物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin，mTOR)及異常激活的真核細胞翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)的調控作用均至關重要。因此，探索原發性肝細胞癌mTOR、eIF4E 的表達以及其侵襲和轉移的相關機制，對于找到有助于原發性肝癌早期診斷的生物學指標以及探尋新的治療途徑有著非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2012年6月至2013年7月在鄭州大學第一附屬醫院接受手術治療的45例肝細胞癌患者，術前均行CT 或MRI 檢查，均為第1 次手術治療，術前均未接受任何形式的放療和化療，病理學檢查均證實為原發性肝細胞癌。其中男31例，年齡29～68 歲，平均(48.36±2.13)歲;女14例，年齡32～73歲，平均(51.41±3.17)歲。手術完成后，所有標本均先給予0.9%氯化鈉溶液沖洗以去除血污，然后修剪除去壞死組織，再用10%福爾馬林保存固定，最后在1 周內完成石蠟包埋，連續切片。Edmondson 病理分級:高分化11例，中分化17例，低分化17例。TNM 分期:Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期13例。

1.2 檢測方法 將標本分為3 組。肝細胞癌(HCC)組:HCC 腫瘤組織標本45例;癌旁肝組織組:距離腫瘤邊緣1～2 cm 的肝臟組織30例;遠癌肝組織組:距離腫瘤邊緣組織＞5 cm 肝組織30例。全部標本組織固定、常規脫蠟、脫水、透明、封片、石蠟包埋。免疫組化采用SP 法，mTOR 兔多克隆抗體和eIF4E 兔多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，免疫組化SP 試劑盒購自北京中杉生物工程公司，DAB 顯色試劑盒購自北京中杉生物工程公司。操作均按說明進行，每組采用已知的mTOR 與eIF4E 的陽性片(乳腺癌)作為陽性對照，分別以PBS、同源正常IgG 兔的血清替代一抗作為陰性對照。

1.3 結果分析 高倍鏡下，細胞內mTOR 和elF4E 均大量定位于細胞質，elF4E 少量定位于細胞核，陽性信號為細胞胞漿染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色。高倍鏡下觀察mTOR 和eIF4E 免疫組化結果。實驗結果圖像采用Biosens Digital Imaging System v1.6 圖像分析系統進行定量分析。mTOR 和eIF4E 免疫組化結果的染色標記強度用平均灰度值(average aensity)表示，染色標記越強，平均灰度值越大，比較各實驗組陽性表達區域平均灰度值的差異，同時分析在同一組織內mTOR和eIF4E 表達的相關性。

1.4 統計學分析 所有實驗數據均采用SPSS 17.0 軟件進行分析，灰度值用(±s)表示，癌組織、癌旁組織、遠癌組織3 組灰度值比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用Bonferroni 統計學方法，兩組變量間的統計學相關性分析采用Pearson 線性相關分析，檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1 mTOR、eIF4E 染色情況 在肝細胞癌組織、癌旁組織及遠癌肝組織組中，mTOR 的陽性信號呈棕黃色或黃色，且主要定位于細胞質內，見圖1、2、3。eIF4E 陽性信號呈棕黃色或黃色，大部分eIF4E 蛋白以彌漫性分布或散在顆粒狀分布存在于胞漿中，只有少部分分布于胞核中，見圖4、5、6。

圖1 mTOR 在肝癌肝組織中的表達(SP×400)

圖2 mTOR 在肝癌肝組織中的表達(SP×400)

圖3 mTOR 在癌旁肝組織中的表達(SP×400)

圖4 eIF4E 在遠癌肝組織中的表達(SP×400)

圖5 eIF4E 在癌旁肝組織中的表達(SP×400)

圖6 eIF4E 在癌旁肝組織中的表達(SP×400)

2.2 mTOR、eIF4E 表達情況 癌、癌旁、遠癌組織中mTOR、eIF4E 的表達強度差異有統計學意義(FmTOR=261.985、FeIF4E=155.601，P 均＜0.001)。進一步兩兩比較，癌與癌旁組、癌與遠癌組、癌旁與遠癌組差異均有統計學意義(P 均＜0.001)，見表1、2、3。

2.3 mTOR 和eIF4E 表達的相關性 定量分析得到的3 組數據分別行兩因子相關性分析，其中癌組織rs=0.315，P=0.006;癌旁組織rs=0.445，P =0.003;遠癌組織rs=0.392，P =0.014。在癌組織、癌旁組織及遠癌組織中兩種因子的相關分析，P 均＜0.05，rs均為正數，在3 組組織中mTOR 和eIF4E 表達均存在相關性，且呈正相關。

表1 mTOR、eIF4E 在癌、癌旁、遠癌組織中的灰度值比較(±s，%)

表1 mTOR、eIF4E 在癌、癌旁、遠癌組織中的灰度值比較(±s，%)

組別 n mTOR eIF4E癌組45 159.64±22.51 147.03±25.13癌旁組 30 66.41±4.62 91.32±9.58遠癌組 30 22.35±5.87 21.75±6.03 F 261.985 155.601 P ＜0.001 ＜0.001

表2 mTOR 在各組中表達的Bonferroni 檢驗結果

表3 eIF4 在各組中表達的Bonferroni 檢驗結果

3 討論

在細胞分裂、生長及增殖過程中，mTOR 的調控作用至關重要。mTOR 是細胞開啟蛋白質翻譯過程的閘門，并且提供必需物質保證細胞由G0 /G1 期正常進入S 期，所以其是細胞內分解代謝和合成代謝過程中的控制臺。其活性作用主要受PI3K/AKT 和AMPK 兩條途徑調節，mTOR 激酶的活性受到FATC 與FAT 結構在分子內部協同作用的調節，而這則是必須由FATC 與FAT 相結合作為基礎的［2］，而在細胞多種不同信號的共同刺激下，細胞內對mTOR 的調節主要是通過PI3K/AKT 及AMPK 通路途徑發揮作用的。一般情況下，體內分泌的生長因子可以通過激活PI3K 途徑來實現對mTOR 的激活。AKT 通過兩種方式激活mTOR:一種是直接磷酸化激活mTOR;另一種是通過磷酸化TSC1/TSC2 二聚體，并抑制其活性，來實現對mTOR 途徑的調節［3－4］。當AMP 的數量增多，而ATP的數量下降時，AMPK 通路活性被激活，被激活后的AMPK 可以通過磷酸化途徑激活TSC1/TSC2 二聚體，進而抑制mTOR 活性的表達。

eIF4E 之所以能夠參與mRNA 翻譯的啟動，完全是因為其可以特異性地結合mRNA5’端帽結構［5］，其對ATP 具有依賴性。mTOR 活化后可磷酸化的兩個下游分子，翻譯抑制分子eIF4E 結合蛋白(4EBPS)和核糖體蛋白p70S6K，4EBPS 磷酸化后失活，因而降低eIF4E 的結合能力，使eIF4E 與之分離，啟動蛋白質的翻譯。而與此相關的文獻報道表明，mTOR 和eIF4E 在浸潤性導管癌中表達增加可能與乳腺癌的發生和轉移相關聯［6］。mTOR 的抑制劑最近被發現對各種非霍奇金淋巴瘤(NHLS)具有確切的治療效果，如雷帕霉素和依維莫司，已被用作癌癥的治療而取得一定的成功，在此過程中進一步證實抑制eIF4E 的活性是抑制mTOR 的關鍵效應物［7－8］。國內亦有研究表明，mTOR 信號通路在腎癌的發生發展過程中同樣具有重要作用［9］。隨著研究的進展，分子靶向治療有望取得更大進展。

本實驗結果顯示，mTOR 和eIF4E 在原發性肝癌組織中高表達，說明細胞蛋白質合成抑制減弱，且二者升高呈現正相關，在肝癌發展的過程中可能具有一定的協同作用。mTOR 的異常激活致使下游底物4EBPS蛋白磷酸化失活，釋放與其結合的eIF4E，加快細胞蛋白質合成，從而促進細胞的生長和惡性轉化［10］。mTOR 和eIF4E 在原發性肝癌的發生發展過程中具有重要作用，如今對于mTOR 與eIF4E 的信號傳導過程已有較深的認識，如何阻斷傳導過程可能成為將來肝細胞癌藥物治療的新方向。

［1］ Sehgal S N.Sirolimus:its discovery，biological properties，and mechanism of action［J］.Transplant Proc，2003，35(3 Suppl):7S－14S.

［2］ 黃嘉佳，林桐榆.mTOR 通路及其抑制劑抗腫瘤的研究進展［J］.癌癥，2007，(12):1397－1403.

［3］ Marzec M，Kasprzycka M，Liu X，et al.Oncogenic tyrosine kinase NPM/ALK induces activation of the rapamycin－sensitive mTOR signaling pathway［J］.Oncogene，2007，26(38):5606－5614.

［4］ Pelletier C L，Maqqi L B Jr，Brady S N，et al.TSC1 sets the rate of ribosome export and protein synthesis through nucleophosmin translation［J］.Cancer Res，2007，67(4):1609－1617.

［5］ 劉麗萍，于卉影，馬東初.eIF4E 的研究進展［J］.細胞與分子免疫學雜志，2005，(S1):118－121.

［6］ Hu A，Sun M，Yan D，et al.Clinical significance of mTOR and eIF4E expression in invasive ductal carcinoma［J］.Tumori，2014，100(5):541－546.

［7］ Kuo S H，Hsu C H，Chen L T，et al.Lack of compensatory pAKT activation and eIF4E phosphorylation of lymphoma cells towards mTOR inhibitor，RAD001［J］.Eur J Cancer，2011，47(8):1244－1257.

［8］ Satheesha S，Cookson V J，Coleman L J，et al.Response to mTOR inhibition:activity of eIF4E predicts sensitivity in cell lines and acquired changes in eIF4E regulation in breast cancer［J］.Mol Cancer，2011，10:19.

［9］ 邢建武，于碩鵬.抑制劑PI－103 對786－O 細胞株PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響［J］.河南醫學研究，2013，22(5):649－651.

［10］ Schalm S S，Fingar D C，Sabatini D M，et al.TOS motif－mediated raptor binding regulates 4E－ BP1 multisite phosphor and function［J］.Curr Biol，2003，13(10):797.