基于iTraq技術的加拿大一枝黃花提取物作用下銅綠微囊藻細胞差異表達蛋白

黃瑩瑩，白 羽，王 艷，2*，孔海南（.上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240；2.上海交通大學公共衛生學院，上海 200025）

基于iTraq技術的加拿大一枝黃花提取物作用下銅綠微囊藻細胞差異表達蛋白

黃瑩瑩1，白 羽1，王 艷1，2*，孔海南1（1.上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240；2.上海交通大學公共衛生學院，上海 200025）

為研究加拿大一枝黃花提取物對藻類生長抑制作用的分子機理，應用iTraq技術結合LC-MS-MS，分析了銅綠微囊藻細胞蛋白質的差異表達.共鑒定出261種差異蛋白（變化倍數≥1.5），其中表達上調的220種，表達下調的41種.GO功能分類顯示，加拿大一枝黃花提取物通過影響細胞代謝過程、蛋白質催化和結合功能等方式抑制藻細胞生長.KEGG通路分析表明，通路大類中富集程度位于前3位的均是代謝通路，包括能量代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝，通路中富集程度最高的是糖酵解/糖異生通路.本研究發現了加拿大一枝黃花提取物對藻細胞生長抑制作用的分子靶點，為從分子層面闡明其抑藻作用提供參考，也為研究植物化感物質的抑藻機理提供了新方法.

iTraq標記；化感作用；差異表達蛋白組；抑藻機理

研究證實加拿大一枝黃花提取物能夠有效抑制藻類的生長［1-2］，但其作用機理尚不清楚.目前，對植物化感物質抑藻機理的研究多集中在細胞的生理生化過程，雖然分子水平的研究起步較晚，但研究者普遍認為植物化感物質能夠影響藻細胞基因和蛋白的合成和表達［3-5］.從現有報道看，與植物化感物質抑藻機理相關的分子水平研究多是從基因表達的角度來考慮［6-8］，然而，蛋白質是生理功能的執行者，其特有的活動規律幾乎無法從基因水平的研究來獲知.

蛋白組學和基因組學技術已經在臨床醫學、分子生物學和免疫學等領域的研究中得到普遍應用，為從生物整體的蛋白和基因的表達及功能的角度闡明生命現象提供了依據.然而，該類技術尚未在植物化感抑藻研究領域廣范展開.近年來，蛋白組學技術在原有基礎上改進和衍生出許多新的技術，其中同位素標記相對和絕對定量（iTraq）技術［9］是2004年美國AB SCIEX公司研發的一種最新的蛋白質組學定量技術，具有較好的定量效果、較高的重復性和工作通量，還提高了蛋白質組的覆蓋率和鑒定的可信度.鑒于以上優點，iTraq技術已經被越來越多的研究者采用，已成功應用于酵母菌株［10］、小鼠肝臟［11］、人體皮膚［12］、子宮內膜組織［13］、肺腺癌細胞膜蛋白［14］等多種樣品的蛋白質組的鑒定和定量研究，但目前尚無將iTraq技術應用于植物化感物質的抑藻機理的研究報道.

本文采用iTraq標記結合LC-MS-MS技術，對加拿大一枝黃花提取物作用下的銅綠微囊藻細胞全蛋白質組進行鑒定，并對差異蛋白進行生物信息學分析，為從分子層面闡明加拿大一枝黃花提取物的抑藻機理提供參考.

1 材料與方法

1.1 藻種的培養

銅綠微囊藻（FACHB 942）購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫.采用BG-11培養基在人工氣候室內培養，培養條件為：溫度（25±1）℃，光照強度3000～4000lx，光暗周期14L：10D，靜置培養.

1.2 加拿大一枝黃花提取物的制備

在上海交通大學閔行校區采集加拿大一枝黃花當年新出苗植株，植株生長土壤為潴育水稻土中的溝干泥、黃泥頭，土壤有機質含量約為2％～3％，pH值呈中性或微堿性.加拿大一枝黃花提取物的制備采用以下方法［15］：植物葉片在80℃條件下烘干48h；取粉碎后的植物粗顆粒，用95％乙醇在室溫下避光提取；乙醇提取液過濾后，50℃下采用旋轉蒸發濃縮，得到乙醇浸膏；乙醇浸膏用蒸餾水溫浸，攪拌使之懸浮，用石油醚反復萃取去除其中非極性組分，剩余溶液即為含有水溶性抑藻活性成分的提取物，4℃冷藏備用，使用前經0.45μm微孔濾膜過濾.提取物的濃度以水溶性成分的濃度計算（g/L）.

1.3 試劑和儀器

細胞裂解液含40mmol/L Tris/HCl pH7.4、8mol/L Urea、0.2mmol/L Na3VO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L NaF、0.5mmol/L EGTA、4％CHAPS、20mmol/L DTT，使用前加入1mmol/L PMSF.還原液含6mol/L鹽酸胍和100mmol/L NH4HCO3.Solution A含98％超純水，2％乙腈，0.1％甲酸.iTRAQ?試劑盒由美國AB Sciex公司提供.

液相色譜為1100LC（美國安捷倫科技公司）.LC-MS-MS為Dionex ultimate3000Nano LC（美國ThermoFisher Dionex公司）和On-line Nano Electrospray，maxis impact Q-TOF（德國Bruker公司）.

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗設置 BG11培養基置于250mL錐形瓶中，接入對數生長期的銅綠微囊藻，添加0.2g/L的加拿大一枝黃花提取物，對照不添加提取物.

1.4.2 全蛋白的制備 通過離心分別收集加拿大一枝黃花提取物作用3d的藻細胞和對照細胞，加入5mL 4℃預冷細胞裂解液，在冰上進行超聲破碎.將細胞破碎液在4℃下，15000r/min離心45min，取上清液，加入25mL的乙醇/丙酮/乙酸（50/50/0.1，V/V/V），-20℃沉淀過夜.沉淀后的細胞液在4℃下，15000r/min離心1h，沉淀用丙酮重懸，50℃下離心濃縮.用還原液重溶沉淀，-20℃保存備用.蛋白質濃度采用Bradford法測定.1.4.3 酶解和標記 200μg蛋白用還原液定容至100μL，采用iTRAQ?試劑盒進行酶解和標記.酶解步驟如下：加入4μL Reducing Reagent，60℃水浴1h；加入2μL Cysteine-Blocking Reagent，室溫放置10min；將蛋白溶液加入10KD超濾管中，4℃下12000r/min離心20min，棄掉收集管底部溶液；加入100μL Dissolution Buffer，4℃下12000r/ min離心20min，棄掉收集管底部溶液；更換新的收集管，在超濾管中加入50μL（80μg/mL）胰蛋白酶液，37℃反應過夜.標記步驟如下：超濾管在4℃下12000r/min離心20min；在超濾管中加入50μL Dissolution Buffer，4℃下12000r/min離心20min，重復1次；合并收集管底部濾液，用Dissolution Buffer定容至100μL；iTraq試劑平衡至室溫，每管中加入150μL乙醇；取100μg酶解產物，加入全部iTraq試劑，室溫反應2～3h；加入100μL超純水終止反應；分別取加拿大一枝黃花提取物作用的藻細胞和對照細胞的標記后的酶解產物，等體積混合，50℃離心濃縮，-20℃保存備用.

1.4.4 多肽混合物高pH反相分級 將標記樣品用120μL流動相A復溶，12000r/min離心20min，通過液相色譜分離樣品.色譜柱為Durashell-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫為20℃；進樣量為100μL；流動相A為pH10的20mmol/L甲酸胺，流動相B為pH10的20mmol/L甲酸胺和80％的乙腈；流速為0.8mL/min；檢測波長為214nm.采用梯度洗脫：0～5min，5％流動相B；5～30min，5％～15％流動相B；30～45min，15％～38％流動相B；45～46min，38％～90％流動相B；46～54.5min，90％流動相B；54.5～55min，90％～5％流動相B；55～65min，5％流動相B.從8min開始收集洗脫物，每個樣品約1mL，60min結束收集，共收集42份洗脫物.洗脫物分別在50℃離心濃縮，得到樣品粉末，-20℃保存備用.

1.4.5 蛋白質分析 分離所得的樣品分別用30μL Solution A復溶.依據樣品收集的時間，將樣品合并為6份，通過LC-MS-MS進行蛋白質檢測.色譜條件：捕集柱（trap column）為C18柱（0.1mm×2cm，5μm），流速為10μL/min；分析柱（Analytical Column）為C18柱（0.075mm×0.15cm，3μm），流速為400nL/min；柱溫為50℃；流動相A為含0.1％甲酸的超純水，流動相B為0.1％甲酸的乙腈.采用梯度洗脫：0～2min，2％～8％流動相B；2～75min，8％～20％流動相B；75～93min，20％～35％流動相B；93～98min，35％～80％流動相B；98～118min，80％流動相B.質譜檢測條件：電離模式為正離子nanospray模式；質譜檢測方式為MS全掃描及MS/MS掃描，掃描范圍50～2500amu；母離子設為350～1500m/z.

蛋白鑒定采用Mascot 2.4軟件鑒定多肽分子，肽段質量誤差（Peptide mass tolerance）為20ppm，串聯質譜誤差（MS/MS tolerance）為0.05Da，允許最大的胰酶漏切位點數（Max missed cleavages）為2個，NCBInt數據庫選用Microcystis aeruginosa.fasta.Mascot結果采用Scaffold 4軟件過濾，蛋白陽性結果錯誤率（Protein FDR）≤2％，肽段陽性結果錯誤率（Peptide FDR）≤1％.得到表達差異量的結果，變化倍數（Fold Change Ratio）1.5倍以上，認為二者之間差異有統計學意義.

1.4.6 生物信息學分析 采用blast2go 2.7.0將變化倍數1.5倍以上的差異蛋白和參考菌株M.aeruginosa NIES-843的全蛋白質分別與NCBInt數據庫比對，對應蛋白分別在基因本體（Gene Ontology，GO）3個分支——生物過程（Biological Process），分子功能（Molecular Function）和細胞組件（Cellular Component）——進行功能上的分類統計.

從KEGG網站下載了M.aeruginosa NIES-843的蛋白序列和其它相關信息作為KEGG分析的參照數據集，將差異蛋白序列和參照數據集進行序列相似性比對，采用相似度≥30％且evalue≤1×10-10進行雙向最佳匹配（Bi-direction Best Hit，BBH）.通過參照集的ID號映射到KEGG Pathway maps，以參照數據集的全部蛋白質為參照在通路水平和通路大類的水平進行計算P值，與此同時計算Z-score.Z-score＞0且P＜0.05，即顯著富集.

通過BBH結果將匹配到的差異蛋白質定位到M.aeruginosa NIES-843基因組上，獲得編碼基因的相關信息.

2 結果與討論

2.1 蛋白鑒定和差異蛋白篩選

以未經加拿大一枝黃花提取物作用的藻細胞為對照，共鑒定出576種差異蛋白，而差異倍數達到1.5倍的差異蛋白共261種，占到所鑒定的蛋白總數的45.3％，其中表達上調的差異蛋白220種，表達下調的蛋白41種，上調蛋白數是下調蛋白數的5.4倍.表1顯示了上調和下調前10位的蛋白.

2.2 GO功能分類和顯著性分析

基因本體（GO）是一個在生物信息學中廣泛使用的本體，基因產物在數據庫中被賦上GO的詞條，進而可以到數據庫中去查詢這些生物學的相關信息.通過GO功能分類對蛋白功能進行聚類分析，第二層GO功能分類結果見表2.鑒定到的差異蛋白中193種能對應到生物過程，其第二層功能分類中180種蛋白參與代謝過程，占93％，第三層分支中，最多蛋白參與的是有機物代謝過程和初級代謝過程，均有109種蛋白，其次是生物合成過程（80種）和細胞代謝過程（78種）.鑒定到的差異蛋白中191種能對應到分子功能，其第二層功能分類以催化和結合為主，分別有160和134種相關蛋白.催化功能的下層分支中，水解酶和轉移酶最多，分別為45和38種蛋白；結合功能的下層分支中，具有與雜環化合物和有機環狀化合物結合功能的蛋白最多，均有80種蛋白，其次是具有與小分子結合功能的蛋白（71種）.鑒定到的差異蛋白中81種能對應到細胞組件.第二層GO分支中，這81種蛋白均屬于細胞（cell），其中的39種蛋白還同時屬于大分子復合物.第三層GO功能細胞分支中，有75種蛋白屬于細胞部分（cell part）；第三層GO功能大分子復合物分支中，有30種蛋白屬于蛋白質復合物.這說明加拿大一枝黃花提取物作用下藻細胞的代謝過程顯著變化，蛋白的催化功能和結合功能受到明顯影響，而差異蛋白主要位于胞內.

表1 銅綠微囊藻差異蛋白中差異倍數前10位的蛋白Table 1 Top 10 fold change ratios in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

以M.aeruginosa NIES-843的全蛋白為參照，采用fisher’s exact test檢驗實驗細胞在GO功能上的差異，得到的P值通過Bonferroni correction進行矯正.表3顯示了富集度最高的5個功能分支.相比參考物種，代謝過程、小分子結合和細胞內組件在分別生物過程、分子功能和細胞組件功能分支中差異蛋白富集程度最高.在GO功能分類中，能對應到生物過程的差異蛋白中超過90％與代謝過程相關，下層分支中分解代謝過程、初級代謝過程、有機物代謝過程、生物合成過程和細胞代謝過程顯著富集，與這些過程相關的蛋白質代謝、碳水化合物代謝、細胞生物合成、有機質生物合成和細胞大分子生物合成等過程同樣顯著富集.同樣顯著富集還有抗氧化活性，其對應的差異蛋白占2.30％（6種），遠高于參照物種的0.19％，包括1種過氧化物酶、2種過氧化氫酶和3種谷胱甘肽還原酶，與前期研究中抗氧化系統對加拿大一枝黃花提取物的響應的結論一致［1］.

表2 銅綠微囊藻細胞差異蛋白的第二層GO功能分類Table 2 Level 2 of GO terms in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

表3 GO功能分類中生物過程、分子功能和細胞組件前5位富集度的功能分類Table 3 Top 5 enrichment GO terms in biological process，molecular function and cellular component

2.3 KEGG通路分析

KEGG是由京都大學生物信息學中心于1995年建立的生物信息學數據庫，其中的Pathway數據庫可以計算或預測出蛋白質在對各種細胞活動的交互作用，包括圖解的細胞生化過程和同系保守的子通路等信息.BBH結果顯示有183種（70.8％）蛋白對應到參照數據集，共對應到60條KEGG通路，這些通路分別對應15個通路大類，表4顯示了富集程度位于前5位的通路大類，其中位于前3位的均是執行代謝功能的通路大類，包括能量代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝.60條通路中的22條顯著富集，表5顯示了富集程度位于前10位的通路，其中糖酵解/糖異生通路富集度最高，其次是氨酰-tRNA酶生物合成合成通路、氮代謝通路和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路.結果進一步說明加拿大一枝黃花提取物對藻細胞代謝過程的影響最顯著的是能量代謝.差異蛋白對應到的15各通路大類中有10個屬于代謝過程（4個顯著富集），這與GO功能的結果類似.研究證實光合系統是植物化感抑藻物質影響藻細胞生長的重要靶點［16-18］，結果顯示在對應KEGG通路中有3個與細胞光合生理相關，包括光合作用、光合作用-天線蛋白和碳固定，分別涉及6、5和5種蛋白.

表4 銅綠微囊藻細胞差異蛋白前5位顯著富集的通路大類Table 4 Top 5 enrichment KEGG pathway classes in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

表5 銅綠微囊藻細胞差異蛋白前10位顯著富集的通路Table 5 Top 10 enrichment KEGG pathways in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

2.4 基因組定位

將BBH得到的183種差異蛋白質分別定位到M.aeruginosa NIES-843基因組上，得到各蛋白對應編碼基因的相關信息.表6為上調和下調前5位的蛋白對應的編碼基因.

2.5 差異蛋白的生物信息學分析

根據生物信息學分析結果，加拿大一枝黃花提取物對藻細胞的作用是多方面的，其能夠同時影響多種物質代謝合成及干擾不同的生理生化反應的進行，通過這些信息還能夠進一步解析差異蛋白的功能.

表達上調的蛋白中，1-（5-phosphoribosyl）-5-（（5-phosphoribosylamino）methylideneamino）imidazole-4-carboxamide isomerase的差異最大，實驗組為對照組的32.3倍.根據生物信息學分析，該酶由hisA基因編碼，參與生物合成，具有催化功能，在KEGG通路中參與組氨酸代謝.上調差異倍數第二的是6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase），差異倍數為22.2.該酶是糖酵解途徑的限速酶，負責催化ATP上的磷酰基轉移給6-磷酸果糖，生成1，6-二磷酸果糖和ADP，但會受到高濃度ATP的抑制［19］.根據生物信息學分析，該酶編碼基因可定位于M.aeruginosa NIES-843基因組上WP_002770220.1位置，與細胞內多種物質（包括核酸堿基、雜環化合物、含氮化合物、芳香族化合物等）的代謝過程相關，具有催化和結合功能，在KEGG通路中參與糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝、甲烷代謝.上調差異倍數第三的是熱休克蛋白（Heat shock protein），差異倍數為22.1.熱休克蛋白是生物體或細胞在不良環境因素作用下產生的具有高度保守性的應激蛋白，不僅能為熱損傷所誘導，而且能為許多其它應激刺激所誘導，包括生理、病理、環境乃至機械刺激等方面，如缺氧、葡萄糖缺乏、重金屬、代謝抑制因子、氧自由基、病毒感染、寄生蟲感染［20］.研究證實加拿大一枝黃花提取物作用下銅綠微囊藻會產生過量的活性氧，進而形成氧脅迫［1］，這可能是導致熱休克蛋白上調的原因.根據生物信息學分析，該蛋白由dnaK基因編碼，與細胞內蛋白質和大分子的代謝過程相關，參與應激反應，具有與二磷酸核苷和核苷酸結合的功能，在KEGG通路中參與RNA降解.

表6 銅綠微囊藻差異蛋白中差異倍數前5位的蛋白對應的編碼基因Table 6 Gene of top 5 fold change ratios in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

差異蛋白中差異倍數最小的為0.4，即表達下調最顯著，包括3種蛋白：50S核糖體亞基蛋白L23（50S ribosomal subunit protein L23）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）以及陰離子轉運ATP酶（Anion-transporting ATPase，Similar to tr|P72799）.50S核糖體亞基是原核細胞內70S核糖體中的較大亞基，由5S rRNA、23S rRNA和約35種核糖體蛋白質構成，在原核翻譯中負責在tRNA轉運來的氨基酸分子之間形成肽鍵，50S核糖體亞基還是某些抗生素的結合位點，這些抗生素可通過阻斷肽鏈的延伸來抑制蛋白的質生物合成，最終殺滅細菌［21-22］.根據生物信息學分析，50S核糖體亞基蛋白L23由rplW基因編碼，與細胞內物質代謝、合成過程和基因表達翻譯相關，具有與RNA結合的功能，在KEGG通路中參與核糖體翻譯.谷氨酰胺合成酶是一種參與將無機氮同化為有機氮的酶，可以催化銨離子與谷氨酸反應合成谷氨酰胺，同時消耗ATP［23］.該酶由glnN基因編碼，與細胞內生物合成和碳水化合物代謝相關，具有催化功能，在KEGG通路中參與丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、氮代謝和雙組分系統.離子轉運ATP酶是廣泛存在于生物膜上的一種酶蛋白，參與離子的主動轉運.陰離子轉運ATP酶編碼基因可定位于M.aeruginosa NIES-843基因組上WP_002776170.1位置，與細胞內多種物質（包括核酸堿基、雜環化合物、含氮化合物、芳香族化合物等）的代謝過程相關，具有與二磷酸核苷和核苷酸結合的功能以及轉移含磷基團的活性，但在KEGG通路沒有找到對應通路.

3 結論

3.1 通過對加拿大一枝黃花提取物作用下的銅綠微囊藻細胞蛋白質組進行分離和鑒定，比較對照細胞和實驗細胞，共鑒定出576種差異蛋白，其中差異倍數達到1.5倍的差異蛋白共261種，包括220種表達上調的差異蛋白和41種表達下調的差異蛋白.

3.2 通過GO功能分類對蛋白功能分別進行3個分支的聚類分析.鑒定到的差異蛋白中193種能對應到生物過程，其中180種蛋白參與代謝過程，占93％；鑒定到的差異蛋白中191種能對應到分子功能，其中以催化和結合功能為主，分別有160和134種相關蛋白；鑒定到的差異蛋白中81種能對應到細胞組件，第二層分支中這81種均屬于細胞，其中的39種蛋白還同時屬于大分子復合物.

3.3 差異蛋白中有183種能對應到參照數據集，對應15個通路大類，能匹配到60條KEGG通路中，其中22條顯著富集，位于前3位的均是執行代謝功能的通路.

3.4 加拿大一枝黃花提取物于銅綠微囊藻細胞時，能夠同時影響多種物質代謝合成途徑及干擾不同的生理生化反應，其中受到影響最大的是細胞的代謝功能，尤其是能量代謝和氨基酸代謝過程.

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Differentially expressed proteins in Microcystic aeruginosa with Solidago canadensis L.extracts using iTraq labeling technique.

HUANG Ying-ying1，BAI Yu1，WANG Yan1，2*，KONG Hai-nan1（1.School of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China；2.School of Public Health，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200025，China）.China Environmental Science，2015，35（6）：1822～1830

To investigate antialgal mechanism of Solidago canadensis L.extracts，iTraq labeling technique coupled with LC-MS-MS was used to analyze differentially expressed proteins in Microcystic aeruginosa.261 differentially expressed proteins（fold change ratio≥1.5）were identified，in which 220 proteins were upregulated and 41proteins were down-regulated.GO function analysis showed that the extracts of S.canadensis inhibited the algal growth by affecting metabolism process，protein catalytic activity and binding function.KEGG pathway analysis showed that top 3 enrichment pathway classes were all related to metabolism，including energy，carbohydrate and amino acid metabolism，and glycolysis/gluconeogenesis was the top enrichment pathway.This study elucidated the molecular targets of the extracts of S.canadensis，thereby giving insight into the antialgal effects at the molecular level and providing a new way to study the antialgal mechanism of plant allelopathic compounds.

iTraq labeling；allelopathy；differentially expressed protein；antialgal mechanism

X172

A

1000-6923（2015）06-1822-09

黃瑩瑩（1984-），女，廣西柳州人，上海交通大學博士研究生，主要從事湖庫生態及藻類控制技術研究.發表論文2篇.

2014-10-30

國家自然科學基金（21077074）

* 責任作者，研究員，wangyan66@sjtu.edu.cn