三種ELISA試劑盒檢測豬流行性乙型腦炎病毒血清IgG抗體比較

馬淑娟，熊益權(quán)，張瓊花，周軍華，李 杏，鄭雪燕，蔣麗娜，鐘雪珊，陳少威，陳 清

流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE，簡稱乙腦），是導(dǎo)致人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的自然疫源性疾病，其病原體為流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV，簡稱乙腦病毒）。乙腦的主要傳染源是豬。由于仔豬出生率高，對乙腦無免疫力，受帶毒蚊蟲叮咬后幾乎100%受感染，且受感染時間比人早2～4周[1]。監(jiān)測豬乙腦病毒感染情況和血清抗體水平，可對人乙腦流行情況做出預(yù)測，是制定預(yù)防和控制乙腦流行措施的重要依據(jù)。

豬乙腦病毒感染狀況監(jiān)測多采用血清學(xué)檢測方法[2]，微量中和試驗是國際公認(rèn)的乙腦病毒血清學(xué)檢測金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但該試驗操作復(fù)雜且耗時。ELISA方法具備快速、高效、低廉、特異性強、靈敏度高、簡便、無需無菌操作，可同時檢測多份血清樣品等優(yōu)點被廣泛采用[2]。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國外大多采用研究者自行建立的ELISA方法進(jìn)行豬血清乙腦病毒IgG抗體的檢測[4]，而國內(nèi)較多使用商品化試劑盒。

目前國內(nèi)市場上的商品化豬乙腦病毒血清IgG抗體ELISA檢測試劑盒品牌眾多，給應(yīng)用者選擇帶來一定的困難。我們通過文獻(xiàn)檢索，選擇應(yīng)用最多的3種ELISA試劑盒[5－13]，以微量中和試驗為金標(biāo)準(zhǔn)，對其效度和信度進(jìn)行評價，旨在為豬乙腦病毒感染的監(jiān)測推薦較為穩(wěn)定可靠的試劑盒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢血清 待檢血清為2013年1月和3月取自廣州某屠宰場的90份6－8月齡豬血樣品，經(jīng)3 000r／min離心15min，取血清混勻分裝，一式4份，－80。C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 ELISA檢測試劑盒 豬乙腦病毒血清IgG抗體ELISA檢測試劑盒分別購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司（以下簡稱為Keqian）（生產(chǎn)批號為130101，有效期為10個月）、深圳綠詩源生物技術(shù)有限公司（以下簡稱為Lvshiyuan）（生產(chǎn)批號為20121210、20130401，有效期為6個月）和東莞天辰生物科技有限公司（以下簡稱為Tianchen）（生產(chǎn)批號為D201301166、D20130302，有效期為12個月）。

1.1.3 乙腦毒株和陽性血清 乙腦病毒NaK株，由本實驗室保存；豬乙腦病毒IgG抗體陽性血清購自科前動物生物制品有限責(zé)任公司（生產(chǎn)批號為121005）。

1.2 血清學(xué)檢測

1.2.1 ELISA各試劑盒檢測均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。主要步驟有：樣本稀釋、加樣、溫育、洗板、加酶標(biāo)記物、溫育、洗板、顯色、終止和結(jié)果測定。90份待檢樣本血清每樣平行做兩孔，結(jié)果判定時取兩孔平均值，每次結(jié)果取3次平行測量的吸光度平均值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照各自說明書：①Keqian：S／P（樣品OD值／陽性對照 OD值）≥0.21為陽性，S／P＜0.21為陰性；②Lvshiyuan：S＞0.4為陽性，S在0.2～0.4之間為可疑陽性，S＜0.2為陰性；③Tianchen：S／P≥0.18為陽性，0.15≤S／P＜0.18為可疑陽性，S／P＜0.15為陰性。

1.2.2 中和試驗 按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS214－2008進(jìn)行，先用乙腦病毒NaK株感染敏感的BHK－21細(xì)胞測定病毒50%致細(xì)胞病變量（TCID50）以確定進(jìn)行中和試驗的病毒用量。然后使用50～100TCID50／50μL（允許范圍為32～320TCID50）的乙腦病毒進(jìn)行中和試驗，主要步驟有：滅活待檢血清，倍比稀釋血清并與試驗濃度病毒等體積混合，設(shè)立對照，37。C水浴1h，接種至96孔單層BHK－21細(xì)胞板，37。C、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1h后每孔補加50μL 5%維持液放置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。病毒接種48h后，逐日觀察細(xì)胞病變，取接種后5～7d結(jié)果計數(shù)中和指數(shù)并記錄結(jié)果，豬血清乙腦病毒IgG中和抗體滴度≥1∶10判定為豬乙腦病毒感染陽性[4，14]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用靈敏度和特異度對試劑盒的檢測效度進(jìn)行評價；采用Friedman秩和檢驗、Wilcoxon符號秩和檢驗分析3種試劑盒和中和試驗陽性率的差異；采用κ系數(shù)評價試劑盒檢測結(jié)果與中和試驗的吻合度；采用配對t檢驗對3種試劑盒內(nèi)部一致性進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 檢測結(jié)果 3種ELISA試劑盒及金標(biāo)準(zhǔn)中和試驗分別完成了90份待檢豬血清乙腦病毒IgG抗體的檢測，按照各自的判定標(biāo)準(zhǔn)得出結(jié)果，見表1。

表1 3種ELISA試劑盒及中和試驗檢測90份豬血清的結(jié)果Tab.1 Results of 90swine sera detected by three kinds of ELISA kits and serum neutralization test

2.2 3種試劑盒的效度評價 以中和試驗為金標(biāo)準(zhǔn)，對3種試劑盒進(jìn)行靈敏度和特異度的評價，結(jié)果見表2、3。

2.3 3種試劑盒與中和試驗符合情況比較 3種試劑盒與中和試驗檢測結(jié)果符合情況比較見表3、4。

2.3 試劑盒內(nèi)部一致性分析 Keqian，Lvshiyuan，Tianchen 3種ELISA試劑盒對90份血清樣本均進(jìn)行了兩平行復(fù)孔的檢測，統(tǒng)計量見表5，結(jié)果顯示復(fù)孔間OD值相近，均數(shù)差在0.008以內(nèi)。同一試劑盒復(fù)孔間進(jìn)行配對t檢驗，顯示3種試劑盒兩平行復(fù)孔檢測的總體平均差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩平行孔之間均有較高的相關(guān)性，Keqian，Lvshiyuan，Tianchen的相關(guān)系數(shù)分別為0.977，0.962和0.998（見表5），說明3種試劑盒均具有較高的穩(wěn)定性。

表2 3種ELISA試劑盒與中和試驗檢測豬血清乙腦病毒抗體結(jié)果比較Tab.2 Comparison of three kinds of ELISA kits and serum neutralization test for detection of swine serum antibodies against JEV

表3 3種ELISA試劑盒的檢測效度評價Tab.3 Validity of three kinds of ELISA kits for detection of swine serum antibodies against JEV

表4 3種試劑盒與中和試驗檢測結(jié)果多重比較結(jié)果及κ系數(shù)Tab.4 Comparison of kappa coefficient between three kinds of ELISA kits and serum neutralization test for detection of swine serum antibodies against JEV

表5 3種試劑盒檢測同一樣本兩平行復(fù)孔OD值的配對t檢驗Tab.5 Paired t－test of the OD values of two parallel wells of the same sample detected by three kinds of ELISA kits

3 討 論

選用的3種ELISA試劑盒陽性檢出率均高于中和試驗，中和試驗的陽性檢出率為34.4%（31／90），Keqian陽性檢出率相對最高為50.0%（45／90），Lvshiyuan 陽 性 檢 出 率 為 47.8% （43／90），Tianchen陽性檢出率為38.9%（35／90）。這說明ELISA方法靈敏度較高，而且該法操作簡單，適用于常規(guī)豬乙腦感染情況的監(jiān)測。但是，目前國內(nèi)商品化豬乙腦病毒血清IgG抗體檢測試劑盒的檢測結(jié)果差異較大，有必要進(jìn)行系統(tǒng)的診斷試驗評價。與金標(biāo)準(zhǔn)中和試驗比較，3種試劑盒檢測結(jié)果與中和試驗均有一定差異，Tianchen的結(jié)果與中和試驗比較吻合度較高（κ＝0.63），Keqian和 Lvshiyuan的差異較大，Keqian和Lvshiyuan與中和試驗結(jié)果吻合度為0.57和0.04；后者的這一情況可能同該試劑盒的可疑陽性判定范圍大有關(guān)，建議適當(dāng)壓縮可疑陽性的范圍，減少重復(fù)檢測。

試劑盒內(nèi)部一致性分析顯示3種試劑盒均有很好的穩(wěn)定性。其中Keqian的靈敏度最高（90.32%），陰性似然比最低（0.14），說明其檢測結(jié)果陰性時為真陰性的概率最大，可用于排除試驗。Tianchen的靈敏度較高，為83.87%，且其特異度也較高，為79.66%，陽性似然比最高（4.12），說明其檢測結(jié)果陽性時為真陽性的概率最大，陰性似然比為0.20，說明檢查結(jié)果陰性時為真陰性的概率也較大，當(dāng)檢測同時需要較高的靈敏度和特異度時，可考慮首選該試劑盒。Lvshiyuan的靈敏度和特異度均較低，分別為41.94%和16.95%，檢測效度相對較差，陽性似然比（0.50）明顯低于其他兩個試劑盒，表明該試劑盒應(yīng)進(jìn)一步加以改進(jìn)。

本研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)市場上這3種試劑盒雖同為檢測豬血清乙腦病毒IgG抗體的ELISA試劑盒，但檢測結(jié)果差異顯著，可能是因為國產(chǎn)的商品化試劑盒采用包被粗制全病毒抗原的間接ELISA法，實驗的本底較高[15]，質(zhì)量差異大，導(dǎo)致檢測的敏感性不一。鑒于我國家豬飼養(yǎng)數(shù)量大，更新速率快，乙腦病毒的感染率高[5－8，13]。商品化 ELISA 試劑盒快速、高效、低廉、無需無菌操作、有較高靈敏度和特異度等優(yōu)點，是乙腦作為《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定養(yǎng)豬場監(jiān)測疫病的理想血清學(xué)監(jiān)測方法。商品化ELISA試劑盒檢測效度將直接影響常規(guī)監(jiān)測結(jié)果的報道，關(guān)系到國內(nèi)豬乙型腦炎病毒感染現(xiàn)狀的評估及豬乙型腦炎疫苗保護(hù)效果的評價。筆者認(rèn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范商品化豬乙腦病毒IgG抗體ELISA檢測試劑盒的上市標(biāo)準(zhǔn)，并定期監(jiān)測試劑盒的檢測效能，一定程度上保證檢測結(jié)果的真實可靠。

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