瘧疾感染過程中Tregs對DCs免疫功能的抑制作用與機理

陳 光，劉 蕾，王芳芳，羅 蘭，蘇菊香，蔡連順，代 月

2.佳木斯大學附屬第一醫院，佳木斯 154000；Email：misschenguang75＠163.com

瘧疾是一種嚴重危害人類健康的全球感染性疾病。據2013年WHO報告，約34億人受到瘧疾威脅，每年約2.07億例瘧疾病例，造成大約62.7萬例瘧疾死亡[1]。瘧疾已成為世界廣泛關注的重要公共衛生問題之一，給全球尤其是發展中國家帶來了嚴重的健康危害和經濟負擔[2－3]。然而關于瘧疾發病的免疫學機制尚不清楚，探索瘧疾發生的免疫、細胞和分子機制仍具有重要的實際意義。

前炎性／抗炎性免疫應答之間的平衡是清除瘧原蟲而不引起宿主嚴重病理損傷的關鍵。不同類型免疫應答的啟動和強度又是決定感染結局的關鍵。免疫調節平衡作用關鍵的調節因素之一與調節性T細胞（Treg）／樹突細胞（dendritic cells，DC）之間的相互作用密切相關。相關文獻報道，Tregs細胞能夠調控DCs的細胞表型和細胞因子表達譜，改變DCs的生物學活性。Tregs細胞識別和結合DCs后可抑制DCs的活化、成熟和刺激T細胞增殖的能力[4]。然而關于瘧疾感染后Tregs與DCs間的相互關系無相關文獻報道。為此本實驗利用P.y17XL感染鼠瘧模型，對比分析抗原刺激下DCs及其Tregs表型和功能的變化特點，特別是采用Tregs消除鼠觀察DCs表型和功能的變化，確定Tregs對DCs的調控作用，這一研究無疑將為瘧疾等感染性疾病的有效控制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 瘧原蟲及實驗動物感染 6－8周齡、雌性BALB／c小鼠（中國醫學科學院實驗動物研究所提供，許可證編號：SCXK京2004－0001），經腹腔感染1×106P.y17XL（日本愛嬡大學分子寄生蟲學教研室惠贈）寄生的紅細胞。于感染后不同時間采小鼠尾靜脈血，制備薄血膜，Giemsa染色，計數紅細胞感染率。

1.2 Tregs消除小鼠模型的構建 BALB／c小鼠分別于感染前1d和感染后1d腹腔注射1mg CD25單 抗 （7D4，rat IgM；BioExpress .PC61，rat IgG1；eBioscience），腹腔注射PBS小鼠作為對照組。分別于感染0d、3d和5d常規制備脾細胞懸液，流式分析確認CD25的消除效率。

1.3 流式細胞儀檢測DCs亞群數量 無菌取出小鼠脾臟，常規制備脾細胞懸液。用含10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640調整脾細胞終濃度為1×106／mL。每份樣品用抗 CD11c－FITC、CD11b－PE和CD45R／220－PerCP 單 抗進行三色分析，檢 測DCs亞群數量變化，另設陰性對照管。在預先加入FcγIII／II封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1mL，再加入抗CD11c－FITC單抗、抗CD11b－PE單抗和抗CD45R／B220－PerCP單抗進行表面染色，離心去上清后，用0.5mL PBS重懸浮細胞，流式細胞儀進行檢測。

1.4 流式細胞儀檢測DCs表面分子表達 CD11c－FITC標記 DCs后，抗 CD80－PE、CD86－PE、MHCII－PE三種熒光抗體分別標記，FACS檢測DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHC－II分子的表達水平；同時用FITC rat IgG2b作為同型對照。利用流式細胞儀（FACSCalibur，美國B＆D公司），使用前向散射角（FSC）及側向散射角（SSC）確定淋巴細胞群，應用FACSCELLQUEST軟件，每個樣品分析10 000個細胞，以陰性對照為參考，將對照管所示的非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以二維點陣圖顯示，記錄DCs表面分子表達水平的百分率。

1.5 流式細胞儀檢測DCs分泌IL－10的水平 每份樣本用CD11c－FITC和IL－10－PE進行雙色分析，另設陰性對照管。流式細胞儀專用染色管預先加入FcγⅢ／Ⅱ封閉抗體，取新鮮制備的1×106／mL脾細胞懸液0.1mL，37。C條件下PMA和伊屋諾霉素刺激2h后加入Golgi Stop共同培養4h，3%FCS洗滌后加入FITC－anti－CD11c熒光抗體孵育30 min，3%FCS洗滌后加入固定透膜劑孵育，然后加入PE－anti－IL－10熒光抗體進行細胞內染色。同時用FITC rat IgG2b作為同型對照。

1.6 統計學處理 應用SPSS 11.5統計學分析軟件，雙側t檢驗分析比較各組間的統計學差異。P小于或等于0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1P.y17XL感染BALB／c小鼠Tregs消除效果觀察 與正常感染小鼠相比，7D4／PC61阻斷組小鼠Tregs數量均出現有意義的較少，在感染后3d和5d分別減少79%、79%和84%、45%（圖1）。另外，兩種消除方法相比，感染后第5d差異有顯著性（P＜0.05）。

2.2P.y17XL感染BALB／c小鼠Tregs消除后原蟲血癥水平及生存率 于感染后第3d，P.y17XL感染BALB／c小鼠外周血中出現瘧原蟲感染的紅細胞。感染后第4d，紅細胞感染率約為5%～10%。隨后，BALB／c小鼠原蟲血癥水平迅速升高，于感染后第6d紅細胞感染率高達50%，小鼠于感染后第6d及次日全部死亡；而Tregs消除小鼠原蟲血癥水平上升緩慢，感染后第4d紅細胞感染率僅為1%以下。感染后第7d／8d紅細胞感染率達峰值，小鼠全部死亡（圖2A，2B）。

圖1 P.y17XL感染BALB／c小鼠Tregs消除效果。結果以3只小鼠Tregsx±s表示。Fig.1 Effect of Tregs depletion in BALB／c mice by Flow cytometric.

圖2 Tregs消除小鼠不同時間原蟲血癥水平及生存率Fig.2 Parasitemia and survival rate of Tregs blocked mice in different time after infection.

2.3P.y17XL感染BALB／c小鼠 Tregs消除后DCs亞群的數量 與正常感染小鼠相比，7D4／PC61阻斷組小鼠在感染后3dDC1／DC2細胞數量均增加（P＜0.05），然而 DC1／DC2的數量于感染后5d均減少（P＜0.05）（圖3A，3B）。

2.4P.y17XL感染BALB／c小鼠 Tregs消除后DCs表面分子的表達水平 與正常感染小鼠相比，7D4／PC61阻斷組小鼠在感染后3dMHC－II分子、CD80和CD86的表達水平均有意義的增高，感染后5dCD86仍持續增高，而MHC－II分子和CD80的表達水平則減少（P＜0.05）（圖4A，4B，4C）。

2.5P.y17XL感染BALB／c小鼠Tregs消除后分泌IL－10的DCs數量 與正常感染小鼠相比，7D4／PC61阻斷組小鼠在感染后3d和5d分泌IL－10的DCs數量增加有統計學意義（P＜0.05）；另外，兩種Tregs阻斷方法相比，PC61阻斷后分泌IL－10的DCs數量高于7D4阻斷組（P＜0.01）（圖5）。

圖3 Tregs消除小鼠感染后不同時間脾臟DC1／DC2的數量Fig.3 Percentage of DC1and DC2in supernatants from Tregs blocked mice in different time after infection.

3 討 論

相關文獻報道，Tregs細胞在原蟲感染時具有兩方面的作用：一方面是通過控制過度的免疫反應保護宿主，避免機體受到嚴重的免疫病理損害；另一方面卻會增加寄生蟲的存活機率，阻礙機體有效清除病原體。Tregs可通過表面膜分子與其它細胞直接接觸或分泌抑制性細胞因子IL－10、TGF－β和IL－35等方式，抑制體內多種免疫細胞的活化和增殖[5－7]，削弱炎癥效應，維持免疫系統的穩定。

圖4 Tregs消除小鼠感染后不同時間脾臟DC MHC－II、CD80和CD86分子表達水平Fig.4 Levels of MHC－II，CD80and CD86expression in DC in supernatants from Tregs blocked mice in different time after infection.

DCs在誘導固有和適應性免疫應答方面發揮著舉足輕重的作用，同時作為活化初始T細胞的唯一抗原提呈細胞（APC），是決定Th細胞應答形式、強度和效應的關鍵[8]。瘧原蟲感染的紅細胞（pRBC）一方面可誘導DCs刺激初始T細胞分化為分泌IFN－γ的 CD4＋Th1細胞、分泌IL－4的 CD4＋Th2細胞或分泌IL－10的調節性T細胞；另一方面pRBC的數量達到最高時反而抑制DCs的成熟，導致其功能受損[9]，影響瘧疾發展方向。相關文獻報道，DCs能誘導調節性和效應性細胞產生相關細胞因子，Tregs的抑制作用又能阻斷DCs的成熟[10]。

圖5 Tregs消除小鼠感染后不同時間脾臟分泌IL－10的DCs數量Fig.5 Percentage of DC－secreting－IL－10in supernatants from Tregs blocked mice in different time after infection.

為了確定P.y17XL感染BALB／c小鼠DCs功能受損是否與Tregs數量增加有一定關系，本實驗構建了Tregs體內消除的P.y17XL感染BALB／c小鼠模型，結果顯示：與正常感染組小鼠相比，Tregs消除組小鼠于感染后第3dDCs亞群，MHC－II、CD80和CD86的表達均增加，第5dDCs亞群數量、MHC－II和CD80表面分子的表達均明顯減少；然而分泌IL－10的DCs數量于感染后第5d明顯增高，是同天感染鼠的1／3.5倍。由此說明，Tregs部分參與了瘧原蟲感染早期DCs的成熟和活化，通過降低其表面分子的表達和IL－10的分泌抑制了DCs的免疫功能而使DCs功能受損。Tregs消除組小鼠感染后第5dDCs的成熟明顯被抑制，可能與pRBC數量急劇增加后抑制DCs成熟密切相關。

另外本實驗發現，兩種anti－CD25mAb體內阻斷Tregs效果有著明顯的差異。7D4能長期有效的阻斷CD25的表達，而PC61僅能短期內維持CD25的低表達。相關研究發現，7D4能迅速的降低CD25hi細胞的數量，而PC61／PC61＋7D4則效果不理想[11]。與本實驗結果相一致，如果使用PC61單克隆抗體構建Tregs消除鼠瘧模型，需要對模型鼠短期內多次注射，以保障實驗期間CD25的低表達。綜上所述，P.y17XL感染早期，BALB／c小鼠Tregs數量的升高與DCs功能受損具有相關性。Tregs能抑制DCs的免疫功能，這一現象可能與Tregs調控DCs的亞群、表型和細胞因子分泌模式等方面有關，但其確切的機制尚有待于進一步闡明。

[1]WHO Library Cataloguing－in－Publication Data World malaria report：2013.

[2]Murray CJ，Rosenfeld LC，Lim SS，et al.Global malaria mortality between 1980and 2010：a systematic analysis[J].Lancet，2012，379（9814）：413－431.DOI：10.1016／S0140－6736（12）60034－8.

[3]Vogel G.The forgotten malaria[J].Science，2013，342（6159）：684－687.DOI：10.1126／science.342.6159.684.

[4]Larmonier N，Marron M，Zeng Y，et al.Tumor－derived CD4＋CD25＋regulatory T cell suppression of dendritic cell function involves TGF－beta and IL－10[J].Cancer Immunol Immunother，2007，56（1）：48－59.DOI：10.1007／s00262－006－0160－8

[5]Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL－2receptor α－chains（CD25）Breakdown of a single mechanism of self－tolerance causes various autoimmune diseases.J Immunol.1995，155（3）：1151－1164.

[6]Fontenot JD，Gavin MA，Runensky AY.Foxp3programs the development and function of CD4＋CD25＋regulatory T cell.Nat Immunol.2003，4（4）：330－336..DOI：10.1038／ni904

[7]Zhang SG，Wang Jh，Stowh W，et al.TGF－beta requires CT－LA－4early after T cell activation to induce FoxP3and generate adaptive CD4＋CD25＋regulatory cells.J Immunol.2006，176（6）：3321－3329.DOI：10.4049／jimmunol.176.6.3321

[8]Stevenson MM，Urban BC.Antigen presentation and dendritic cell biology in malaria.Parasite Immunol.2006，28（1－2）：5－14.DOI：10.1111／j.1365－3024.2006.00772.x

[9]Orengo JM，Wong KA，Oca?a－Morgner C，et al.Plasmodium yoeliisoluble factor inhibits the phenotypic maturation of dendritic cells.Malar J.2008，15；7：254.DOI：10.1186／1475－2875－7－254.

[10]Wang AY，Crome SQ，Jenkins KM，et al.Adenoviral－transduced dendritic cells are susceptible to suppression by T regulatory cells and promote interleukin 17production.Cancer Immunol Immunother.2011；60（3）：381－388.DOI：10.1007／s00262－010－0948－4.

[11]Couper KN，Blount DG，de Souza JB，et al.Incomplete depletion and rapid regeneration of Foxp3＋regulatory T cells following anti－CD25treatment in malaria－infected mice.J Immunol，2007，1；178（7）：4136－4146.DOI：10.4049／jimmunol.178.7.4136