補腎方與調肝方對月經模型小鼠子宮內膜增殖期、分泌期影響的比較研究*

河北中醫學院 (石家莊050091)

陳進成 丁 芳△ 王 亮△ 楊淑英△△ 李春香 張 煒

中醫學認為“腎藏精、主生殖，為先天之本”“肝藏血、主疏泄，女子以肝為先天”，肝腎兩個“先天”決定其在女性生理、生殖的調節上發揮著極其重要的作用。基于此，中醫婦科臨床補腎滋腎、疏肝養肝法成為主要的治療原則。［1］在卵巢分泌的甾體性激素作用下，子宮內膜經歷著增殖、分化、崩解和修復的周期性變化，［2］近年生理生殖領域應用小鼠建立的月經模型為月經的機制研究以及月經性疾病的病理研究提供了優良的平臺，［3－5］而研究的重點大都集中在子宮內膜的蛻膜化、崩解與早期修復環節。本研究則以生理性孕酮撤退的小鼠月經模型為平臺，觀察補腎方與調肝方對子宮內膜崩解前受性激素調控的增殖期和分泌期的影響，并對其影響因子子宮系數、血清中雌激素(E2)、孕激素(P)含量、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及血管內皮因子(VEGF)的表達對比研究，以期為臨床根據子宮內膜時相合理用藥提供數據支持。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠，體質量18～20 g，8～10 周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號:SCXK(京)2009－0004。

1.2 藥品與試劑 補腎方由熟地黃15 g，澤瀉10 g，炒山藥、沙苑子、枸杞子、巴戟天各15 g，肉桂4 g 等組成;調肝方由柴胡10 g，白芍、當歸、香附各15 g，玫瑰花12 g，炒白術、茯苓各15 g 等組成;購于石家莊樂仁堂。將上述中藥煎煮濃縮，制成含生藥量為1.0 g/mL 的藥液，4℃貯存備用。β－雌二醇 (E2，德國Alfa Aesar 公司，批號10152011)，孕酮 (P，美國Sigma 公司，批號P8783)。碘［125I］雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒，批號RG61405，碘［125I］孕酮(Prog)放射免疫分析藥盒，批號RG51406D，天津九鼎生物工程有限公司。ER－α 抗體，批號980593 w，PR 抗體，批號20140603，VEGF 抗體，批號131210 w，β－actin，批號:140103 w，北京博奧森生物科技有限公司。二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG)，批號106484，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 儀器BX53 型顯微鏡，OLYMPUS (日本);E4500 型微距攝像機，Nikon (日本)。

2 方法

2.1 動物分組與造模 C57BL/6J 雌性小鼠采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、補腎組、調肝組、調理肝腎組，每組10 只。除假手術組外，模型組與各給藥組小鼠基于Brasted 等［4－5］的小鼠模型并進行適當修改建立小鼠月經模型。小鼠在乙醚麻醉下行雙側卵巢切除術，恢復1 周清除內源性激素干擾。按程序進行激素處理:第1～3 天皮下注射100 ng/d E2;第5～6 天無處理;第7 天將孕酮管皮下埋植于小鼠背部皮膚松弛處，并同時皮下注射50 ng/d 的P 和5 ng/d 的E2;第8～9 天皮下注射5 ng/d E2。

2.2 動物給藥 灌胃方案:補腎組連續9 天灌胃補腎方;調肝組連續9 天灌胃調肝方;補腎調肝組于第1～4 天灌胃補腎方，5～9 天灌胃調肝方;各組給藥量均為30.83 g/kg;假手術組與模型組每日給予等量的生理鹽水。各組用藥量均按人與動物的體表面積進行換算。［6］

2.3 樣本采集 小鼠于程序處理的第4 天處死為T1 點，第9 天處死為T2 點。在取材點將小鼠摘眼球取血，以3 000 r/min，15 min 離心分離血清;取子宮，迅速與周圍脂肪組織分離，拍照;部分子宮組織立即固定于4%多聚甲醛;部分組織立即置液氮中急凍，后轉入－80℃保存，用于Real－time PCR 與Western blotting 蛋白印跡檢測。

2.4 檢測指標

2.4.1 子宮角外觀、子宮系數與形態學觀察:將子宮組織與外周脂肪組織分離，拍照觀察子宮角外觀形態，稱重。計算子宮系數(小鼠子宮角濕重與小鼠體質量的比)=子宮濕重/體質量×100%。4%多聚甲醛固定的組織經梯度脫水后常規石蠟包埋，4 μm 連續切片，用于H＆E 染色，鏡下觀察子宮內膜形態學變化。

2.4.2 血清激素E2、P 的測定:采用放射免疫法測定血清中E2、P 的含量，嚴格按照藥盒的說明書操作。

2.4.3 免疫組化法檢測子宮組織ER－α、PR、VEGF 蛋白的表達:石蠟切片進行常規脫蠟復水，用檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)加熱進行抗原修復，加一抗(1︰200)4℃過夜，二抗室溫孵育20 min，DAB 顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片。圖像分析依據陽性免疫反應的圖像灰度選擇合適的灰度分割閾值，實現雙閾值分割，得到半灰度目標圖像，以人機交互方式測定陽性免疫染色強度及面積，每個切片測5 個視野，由計算機計算出所測陽性反應物積分光密度(IOD)值，評價表達的強弱。

2.5 統計學方法 采用SPSS16.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，對所測結果進行正態性及方差齊性檢驗。組內比較采用t 檢驗，組間比較采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)，兩兩比較用LSD 檢驗，P＜0.05認為差異有顯著性。

3 結果

3.1 各組小鼠子宮系數比較 與假手術組比較，模型組子宮系數顯著性升高(P＜0.05);與模型組比較，各給藥組子宮系數顯著升高 (P＜0.05);與補腎組比較，調肝組與補腎調肝組在T2點子宮系數顯著升高(P＜0.05);與調肝組比較，補腎組與補腎調肝組在T1 點子宮系數顯著升高(P＜0.05)，如表1所示。

表1 各組小鼠子宮系數比較 (±s)

表1 各組小鼠子宮系數比較 (±s)

注:與假手術組比較，* P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與補腎組比較，▲P＜0.05;與調肝組比較，#P＜0.05

組別 樣本數 T1 點 T2點假手術組 10/10 0.271±0.066 0.269±0.071模型組 8/7 0.405±0.064* 0.301±0.019*補腎組 8/7 0.550±0.036＊△# 0.316±0.025＊△調肝組 8/9 0.480±0.021＊△ 0.379±0.028＊△▲補腎調肝組 9/8 0.548±0.041＊△# 0.426±0.033＊△▲

3.2 各組小鼠子宮組織形態學觀察 假手術組子宮角在整個過程中上皮完整，功能層細胞排列緊密，基底層間質細胞無明顯變化。模型組，在E2作用下的T1 點，肉眼下可見小鼠子宮角腫大，內有液體充盈，外周血管密集;H＆E 染色可見子宮內膜呈單層立方上皮，核質較高，細胞核呈橢圓狀，基質疏松。而在E2、P 聯合作用下的T2 點，子宮體呈現紅色，管腔未見腫大;H＆E 染色后內膜呈假復層改變，見分泌細胞，腔內現分泌物。與模型組比較，各給藥組小鼠子宮的變化呈現相似的趨勢，如圖1所示。

圖1 小鼠子宮外觀形態與H＆E 染色，黑色方框標明位置的高倍視野(×100 與×400)，S 為假手術組及其高倍視野(×400)

3.3 各組小鼠血清中E2、P 含量的比較 與假手術比較，模型組血清中的E2、P 的含量均顯著性增加(P＜0.05);與模型組比較，各給藥組血清中的E2、P 的含量增加，但差異沒有顯著性(P＞0.05)，如表2示。

3.4 各組小鼠子宮組織中ER－α、PR 與VEGF表達的比較 免疫組織化學法檢測顯示假手術組小鼠子宮角可見ER－α、PR 與VEGF 的較弱陽性表達。ER－α 的陽性信號位于間質細胞的細胞質中;PR 陽性信號在上皮周圍的細胞質中表達;VEGF的陽性信號于間質細胞的細胞質中表達。與假手術組比較，模型組小鼠的表達明顯上調 (P＜0.05);與模型組比較，各給藥組小鼠的表達顯著上調(P＜0.05);與補腎組比較，調肝組與補腎調肝組在T2 點的表達量顯著升高(P＜0.05);與調肝組比較，補腎組與補腎調肝組在T1 點的表達量顯著升高(P＜0.05)，如表3所示。

表2 各組小鼠血清E2、P 的含量與比較 (±s)

表2 各組小鼠血清E2、P 的含量與比較 (±s)

注:與假手術組比較，* P＜0.05

組別 樣本E2 (pg/mL)P (ng/mL)T1 點 T2點T1 點 T2點假手術組 10/10 8.253±0.812 9.639±0.719 0.622±0.316 0.706±0.434模型組 8/7 19.453±1.021* 41.320±0.743* 1.543±0.374* 78.981±2.662*補腎組 8/7 21.245±0.951* 42.114±0.913* 1.603±0.953* 79.826±1.493*調肝組 8/9 20.791±1.011* 41.833±2.002* 1.576±0.241* 80.233±1.092*調理肝腎組 9/8 21.102±0.803* 42.442±1.271* 1.595±0.213* 80.284±2.512*

表3 免疫組化測得各組小鼠子宮組織ER－α、PR 與VEGF 表達強弱的比較 (±s)

表3 免疫組化測得各組小鼠子宮組織ER－α、PR 與VEGF 表達強弱的比較 (±s)

注:與假手術組比較，* P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與補腎組比較，▲P＜0.05;與調肝組比較，#P＜0.05

組別 樣本 ER－α T1 點 T2點PR T1 點 T2點VEGF T1 點 T2點假手術組 10/10 2.3±1.1 2.8±1.4 3.1±1.2 2.9±1.0 5.2±2.4 6.8±3.0模型組 8/7 15.4±2.2* 13.3±3.7* 25.5±2.7* 38.8±2.6* 43.1±3.4* 57.5±4.1*補腎組 8/7 21.6±1.9＊△# 19.1±3.2＊△ 36.1±2.5＊△# 46.8±4.9＊△ 56.4±3.1＊△# 70.3±4.7＊△調肝組 8/9 18.9±2.3＊△ 34.8±2.7＊△▲ 31.5±2.4＊△ 50.2±3.0＊△▲ 50.1±4.2＊△ 79.5±3.9＊△▲調理肝腎組 9/8 21.7±1.8＊△# 39.0±2.1＊△▲ 36.3±2.2＊△# 55.9±3.1＊△▲ 56.3±3.8＊△# 87.8±6.1＊△▲

4 討論

女子月經周期子宮內膜有著從增殖、分泌到崩解修復的特征性變化，并參考國內外有關研究［3－5］建立的小鼠月經模型，觀察子宮內膜的形態和功能變化以及影響的因素，可以進一步闡明月經的生理、病理機制，由此研究增殖期和分泌期的子宮內膜變化以及影響因素尤為重要。研究發現，此小鼠月經模型在組織學上顯示出與人類子宮內膜的周期性變化類似的特征，即在單純雌激素作用時與人類增殖期內膜上皮細胞相似;雌、孕激素聯合作用時，則與人類中晚分泌期子宮內膜的特征相似。［7］

補腎方以金匱腎氣丸加減化裁而成，方中熟地黃、枸杞子滋補肝腎之陰，山藥補脾澀精，以助滋補腎中之陰，巴戟天、沙苑子、肉桂溫補腎中之陽，生少火以助腎氣，加澤瀉可補中寓瀉，補而不滯，縱觀全方則溫補腎陽而不燥、滋補腎陰而不膩，陰陽雙補。調肝方則以逍遙散加減化裁，此方在婦科疾病應用頗多，［8］方中當歸、白芍滋養肝血，柴胡、香附、玫瑰花疏肝理氣，輔以茯苓、白術培補脾土，滋氣血生化之源，兼能養肝調肝。如此配伍則補肝體、助肝用，氣血兼顧。現代研究補腎藥、調肝藥有類似激素樣調節作用。［9－11］

本研究一方面通過切除小鼠卵巢來阻斷內源性激素的干擾，另一方面則在定量激素替代的基礎上給予中藥復方干預，并采用子宮濕重與體質量的比值作為檢測中藥激素活性的方法，［10］加之血清中激素含量的測定，子宮內膜組織中相應激素受體表達的測定進行綜合驗證。結果提示:各給藥組與模型組比較均增加了血清中的雌、孕激素含量，但差異無顯著性。這也說明了中藥的激素樣作用是比較緩和的，且激素的生物學效應發揮主要是與其受體的親和性有關，與文獻研究相一致。［10］在T1 點，即雌激素調控的增殖期，補腎組與調理肝腎組小鼠子宮組織中ER－α、PR、VEGF 的表達均顯著上調;在T2 點，即雌、孕激素聯合調控的分泌期，調肝組與調理肝腎組小鼠ER－α、PR、VEGF 的表達均顯著上調。

綜上，激素受體的表達水平決定了相應激素的生物學效應，雌、孕激素與其受體的親和性以及血管發生關鍵因素［12］的變化影響到了子宮內膜的形態和功能，故根據子宮內膜增殖期、分泌期采用不同方藥進行調節彰顯了中醫辨病與辨證相結合，以及因時制宜的特色。本研究也提示，在雌激素調控的增殖期，補腎滋腎較宜;在雌、孕激素共同調控的分泌期，則宜疏肝養肝。調理肝腎按月經周期用藥更適合調整子宮內膜的狀態和功能，這也是我們將來進一步研究的重點。

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