HSP27與FAS/FASL在三陰性乳腺癌侵襲轉移中的作用*

張凱麗 冀宏 王影 馬維遠

·臨床研究與應用·

HSP27與FAS/FASL在三陰性乳腺癌侵襲轉移中的作用*

張凱麗 冀宏 王影 馬維遠

目的：研究熱休克蛋白27（HSP27）在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達與乳腺癌臨床、病理指標之間的關系，探討HSP27與細胞凋亡系統脂肪酸合成酶/脂肪酸合成酶配體（FAS/FASL）之間的相關性及其在TNBC侵襲轉移中的作用。方法：采用免疫組織化學S-P法檢測100例TNBC、100例非TNBC及50例癌旁組織中HSP27及FAS/FASL表達，對HSP27表達與TNBC臨床及病理指標的相關性以及HSP27與FAS/FASL之間表達的相關性進行分析。結果：HSP27在TNBC中表達顯著高于非TNBC及癌旁組織（P＜0.05），FAS/FASL在TNBC與非TNBC及癌旁組織中的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。HSP27與FAS的表達呈負相關（P＜0.05），HSP27與FASL的表達呈正相關（P＜0.05），FAS與FASL的表達呈負相關（P＜0.05）。HSP27在TNBC中表達與不同年齡、分期、腫瘤直徑無相關性（P＞0.05），與有淋巴結轉移、淋巴結轉移枚數、P53、Ki-67的表達相關（P＜0.05）。結論：HSP27過表達與FAS/FASL系統表達失調可能促進TNBC細胞增殖侵襲及轉移，導致不良預后。

三陰性乳腺癌 熱休克蛋白27 脂肪酸合成酶 脂肪酸合成酶配體

HSP27是熱休克蛋白家族的一員，作為分子伴侶具有穩定分子構象，具有維持細胞內環境穩定的作用。有關報道發現，其表達多少與某些腫瘤發生、侵襲轉移、預后均有關［1］。脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）為存在于細胞表面的一種跨膜蛋白，脂肪酸合成酶配體（fatty acid synthetase ligand，FASL）為FAS受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族的成員，兩者結合可以導致細胞凋亡［2］，是一條重要的細胞凋亡通路。FAS/FASL系統組成的凋亡通路可以誘導正常的細胞凋亡，但當某些因素導致凋亡通路受阻，兩者表

達不平衡，就無法進行正常的細胞凋亡、代謝，進而誘發某些病變［3］。三陰性乳腺癌（TNBC）是近年來的研究熱點，其治療手段相對局限，內分泌治療無效，靶向治療不適宜，預后相對較差［4］。本研究通過對TNBC與非TNBC中HSP27和FAS/FASL的表達進行比較，探討其在TNBC發生發展及侵襲轉移過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗對象隨機選取河北醫科大學第二醫院2009年1月至2012年12月間行乳腺癌改良根治術的女性患者的病理蠟塊共200例，術后病理證實為乳腺癌，且病理資料完整。其中TNBC為100例（實驗組），非TNBC為100例（對照組），另取癌旁組織50例。患者標本使用符合本院倫理委員會認可。

1.1.2實驗試劑鼠抗人HSP27單克隆抗體（稀釋度1:100）、FAS/FASL兔抗人多克隆抗體（稀釋度1:100）、蘇木素、枸櫞酸緩沖液、SP-9001、顯色劑DAB、二甲苯、酒精均購自河北博海生物工程開發有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法檢測HSP27、FAS、FASL在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達將乳腺癌組織及癌旁組織的切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜。脫蠟、入水，1%甲醇雙氧水、室溫10 min孵育。蒸餾水洗滌1次，0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min，滴加抗原修復液、室溫10 min孵育。0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min孵育。甩去多余液體，滴加第一抗體（1:100），4℃過夜，0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min，滴加生物素第二抗體（IgG），37℃20 min孵育，0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20 min孵育，0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min。DAB顯色，蘇木素復染細胞核，顯微鏡觀察、拍攝圖像并進行分析。

1.2.2免疫組織化學結果判定HSP27、FAS、FASL呈棕黃色顆粒表達于乳腺癌細胞質及細胞膜，P53、Ki-67呈棕褐色顆粒表達于細胞核。選擇5個視野進行免疫組織化學評分（IHS）。IHS=A×B，A為陽性細胞數分級，B為陽性細胞顯色強度分級。陽性表達細胞數＜1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%～100%為4分。陽性細胞表達的著色深度：基本不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩者得分相乘，0分記為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。HSP27、FAS、FASL（++～+++）為高表達，（-～+）為低表達［5］。

1.3統計學分析

采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。計數資料陽性表達率之間的比較采用χ2檢驗，HSP27、FAS、FASL之間的關系采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1HSP27、FAS/FASL在TNBC、非TNBC及癌旁組織中的表達

HSP27主要表達于乳腺癌組織的細胞膜、細胞質，呈棕黃色顆粒（圖1A、1B），在癌旁組織呈低表達（圖1C）。FAS、FASL主要表達于乳腺癌組織的細胞膜、細胞質，呈棕黃色顆粒（圖2A、2B，圖3A、3B），在癌旁組織中FAS呈高表達、FASL呈低表達（圖2C，圖3C）。

?A.TNBC；B.Non-TNBC；C.Paraneoplastic tissues圖1HSP27在乳腺癌及癌旁組織中的表達（S-P法×200）Figure 1Expression of HSP27 in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

?A.TNBC；B.Non-TNBC；C.Paraneoplastic tissues圖2FAS在乳腺癌及癌旁組織中表達（S-P法×200）Figure 2Expression of FAS in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

?A:TNBC；B:Non-TNBC；C:Paraneoplastic tissues圖3FASL在乳腺癌及癌旁組織中表達（S-P法×200）Figure 3Expression of FASL in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

HSP27在TNBC中的表達率顯著高于非TNBC及癌旁組織（P＜0.05），在TNBC與非TNBC及癌旁組織中的FAS與FASL表達差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 HSP27、FAS/FASL在TNBC、非TNBC及癌旁組織中表達的關系Table 1Expression of HSP27 and FAS/FASL in 100 TNBC tissue samples，100 non-TNBC tissue samples，and 50 paraneoplastic tissues

2.2HSP27、FAS、FASL在TNBC、非TNBC及癌旁組織中表達相關性的分析

HSP27、FAS、FASL在TNBC、非TNBC及癌旁組織中表達有相關性（圖4）。采用Spearman相關分析，結果顯示FAS與FASL的表達呈負相關（r=-0.183，P＜0.05），HSP27與FAS的表達呈負相關（r=-0.433，P＜ 0.05），HSP27與FASL的表達呈正相關（r=0.555，P＜0.05）。

圖4 HSP27及FAS、FASL之間表達相關性分析Figure 4Correlation analyses among HSP27，FAS，and FASL expression

2.3HSP27在三陰性乳腺癌中的表達與臨床病理指標間的關系

淋巴結轉移者的HSP27陽性表達率高于無淋巴結轉移者（P＜0.01），淋巴結轉移枚數越多，HSP27陽性表達率越高（P＜0.01）；P53、Ki-67陽性者的HSP27陽性表達率高于陰性者（P＜0.05）。HSP27陽性率在不同年齡、腫瘤大小、組織學分級中的表達率差異無統計學意義（表2）。

表2 HSP27在TNBC中的表達及與臨床病理指標間的關系Table 2Correlation of HSP27 expression in breast cancer with patients'clinicopathologic features and tumor markers

表2 HSP27在TNBC中的表達及與臨床病理指標間的關系（續表2）Table 2Correlation of HSP27 expression in breast cancer with patients'clinicopathologic features and tumor markers

3 討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌的一個特殊類型，目前治療較局限，除化療以外，無相應的靶向治療藥物，預后較差，因此探討TNBC的特異性靶點，對TNBC進行特異性治療是目前的研究熱點［6］。熱休克蛋白家族在乳腺癌這個復雜的病理過程中起到的關鍵作用越來越受到重視。隨著對HSP27與腫瘤關系研究的不斷深入，發現HSP27是一個在細胞生長、細胞骨架的穩定、耐藥性的產生、細胞凋亡、癌細胞轉移等多方面起重要作用的蛋白［7］。HSP27在肺癌中的表達以及與骨肉瘤的預后關系已有報道［8］，在乳腺癌患者中HSP27也與術后短時間復發和轉移有密切關系，HSP27能夠增加乳腺癌的轉移侵襲能力［9］，但是HSP27與三陰性乳腺癌轉移侵襲的關系研究尚不多見。本研究的TNBC中HSP27表達明顯高于非TNBC，有淋巴結轉移者顯著高于無淋巴結轉移者（P＜0.01），淋巴結轉移數目越多HSP27陽性表達率越高（P＜0.01），HSP27陽性的表達率在P53、Ki-67陽性者中顯著高于陰性者（P＜0.05），說明HSP27過表達與三陰性乳腺癌的預后不良存在一定的相關性，而是否能成為其預后不良的獨立相關因素尚待進一步研究。

有研究報道，HSP27在多種腫瘤細胞中高表達，可以通過抑制Caspase蛋白的激活和活性來抑制細胞凋亡［10］，通過抑制癌細胞較為緩慢的衰老途徑及較為迅速的程序性死亡途徑，從而促進癌細胞發生轉移［11］。因此，本研究中HSP27在TNBC中過表達，可能抑制了三陰性乳腺癌細胞的凋亡和自噬，導致部分乳腺癌細胞只能以壞死方式死亡，其效率遠低于凋亡，從而促進了三陰性乳腺癌的轉移侵襲。另一方面，FAS屬于腫瘤壞死因子及神經生長因子受體家族成員，是細胞凋亡信號受體，在許多腫瘤細胞中發現其表達，FASL在腫瘤發生發展過程中的免疫逃避機制中起重要作用［12］。在TNBC中HSP27過表達與FAS低表達，FASL高表達具有相關性，HSP27可能影響了FAS/FASL受體介導的腫瘤細胞凋亡通路［13］，HSP27直接與死亡結構域蛋白（Daxx）互相作用，特異地影響Daxx通路，抑制Daxx結合到細胞膜，進而抑制其與FAS/FASL的相互作用，最終抑制Daxx誘導腫瘤細胞凋亡［14］。FAS/FASL系統不僅是引起凋亡的重要途徑，也是細胞免疫毒性殺傷靶細胞的途徑之一［15］。在三陰性乳腺癌中FAS表達下調，抵抗FAS介導的凋亡，逃避免疫監視和免疫殺傷，FASL表達上調又會引起表達FAS的T細胞凋亡，破壞自身的免疫系統，腫瘤細胞從而可以逃避T細胞而增殖。

總之，HSP27過表達以及FAS/FASL系統表達失調因素導致腫瘤細胞凋亡系統不能正常運行，可能對三陰性乳腺癌細胞增殖、侵襲及轉移起到了促進作用，導致不良預后。

1Arrigo AP，Simon S，Gibert B，el al.Hsp27（HspB1）and alphaB-crystallin（HspB5）as therapeutic targets［J］.FEBS Lett，2007，

581（19）:3665-3674.

2Tong Q，Liu K，Wang G.FasL expression in colorectal carcinoma and its significance in immune escape of cancer［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26（1）:79-81.

3Inoue Y，Asanuma T，Smith N，et al.Modulation of Fas-FasL related apoptosis by PBN in the early phases of choline deficient diet-mediated hepatocarcinogenesis in rats［J］.Free Radic Res，2007，41（9）:972-980.

4Herold CI，Anders CK.New targets for triple-negative breast cancer［J］.Oncology（Williston Park），2013，27（9）:846-854.

5Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.COX-2 is expressed in human pulmonary，colonic，andmammarytumors［J］.Cancer，2000，89（12）:2637-2645.

6Aysola K，Desal A，Welch C，et al.Triple negative breast cancer-An Overview［J］.Hereditary Genet，2013，2013（Suppl 2）:001.

7Kim LS，Kim JH.Heat shock protein as molecular targets for breast cancer therapeutics［J］.J Breast Cancer，2011，14（3）:167-174.

8Nan Y，Yang S，Tian Y，et al.Analysis of the expression protein profiles of lung squamous carcinoma cell using shot-gun proteomics strategy［J］.Med Oncol，2009，26（2）:215-221.

9Grzegrzolka J，Kurnol K，Piotrow P，et al.Hsp-27 expression in invasive ductal breast carcinoma［J］.Folia Histochem Cytobiol，2012，50（4）:527-533.

10 Sarkar R，Mukherjee S，Biswas J，et al.Sulphoraphane，a naturally occurring isothiocyanate induces apoptosis in breast cancer cells by targeting heat shock proteins［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，427（1）:80-85.

11 Nelson DA，White E.Exploiting different ways to die［J］.Genes Dev，2004，18（11）:1223-1226.

12 B?benek M，Dus D，Kozlak J.Prognostic value of the Fas/Fas ligand system in breast cancer［J］.Contemp Oncol（Pozn），2013，17（2）: 120-122.

13”FH P（”）B［PV N”"”4FJH O FV SJD3”FUBM?5 BSH FU JO HI FBUT I PD L Q SP-teins in cancer［J］.Cancer Lett，2013，332（2）:275-285.

14 Calderwood SK.Heat shock proteins in breast cancer progression-a suitable case for treastment［J］？Int J Hyperthermia，2010，26（7）:681-685.

15 Liu WH，Chang LS.Fas/FasL-dependent and-independent activation of caspase-8 in doxorubicin-treated human breast cancer MCF-7 cells:ADAM10 down-regulation activates Fas/FasL signaling pathway［J］.Int J Biochem Cell Biol，2011，43（12）:1708-1719.

（2014-10-22收稿）

（2015-01-23修回）

Research on the role of HSP27 and Fas/Fasl in the invasion and metastasis of triple negative breast cancer

Kaili ZHANG,Hong JI,Ying WANG,Weiyuan MA

Kaili ZHANG;E-mail:13833172900@163.com

Objective:To study the relationship between the expression of heat shock protein 27(HSP27)in triple negative breast cancer(TNBC)and the clinico-pathological indexes of breast cancer,investigate the correlation between HSP27 and the fatty acid synthetase(FAS)/fatty acid synthetase ligand(FASL)of the cell apoptosis system in the Fas/Fasl system,and study the role of HSP27 in the invasion and metastasis of TNBC.Methods:The immunohistochemical S-P method was used to detect the expression of HSP27 and(FAS)/(FASL)in 100 TNBS tissue sampres,100 non-TNBS tissue sampres,and 50 paraneoplastic tissues.This method was also used to analyze the correlations between the expression of HSP27 and the clinical and pathological indexes of TNBC,as well as between the HSP27 expression and FAS/FASL expression.Results:HSP27 expression was significantly higher in TNBC than in the non-TNBC and paraneoplastic tissues(P<0.05).Statistically significant differences were observed in the FAS/FASL expression in the TNBC,non-TNBC,and paraneoplastic tissues(P<0.05).HSP27 expression had a negative correlation with FAS expression(P<0.05). HSP27 expression was positively correlated with FASL expression(P<0.05).FAS expression had a negative correlation with FASL expression(P<0.05).HSP27 expression in TNBC was not correlated with age,staging,and tumor size(P>0.05),whereas HSP27 expression was correlated with lymph node metastasis,number of nodal metastases,and P53 and Ki67 expression(P<0.05).Conclusion:The overexpression of HSP27 and the expression dysregulation of the FAS/FASL system may play a role in promoting TNBC transfer and invasion,cell proliferation,and poor prognosis.

triple negative breast cancer,HSP27,fatty acid synthetase,fatty acid synthetase ligand

10.3969/j.issn.1000-8179.20141741

河北醫科大學第二醫院腺體外科（石家莊市050000）

*本文課題受河北省醫學科學研究重點課題計劃（編號：20120077）資助

張凱麗13833172900@163.com

Department of Gland Surgery,The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

This work was supported by the Key Research Project of Medical Science in Hebei Province(No.20120077)

張凱麗專業方向為甲狀腺、乳腺腫瘤臨床及基礎研究，腫瘤信號轉導通路機制研究。

E-mail：13833172900@163.com