p53基因codon 72多態性與乳腺癌術后放化療療效相關性分析

鐵劍解云濤徐曄朱廣迎

·臨床研究與應用·

p53基因codon 72多態性與乳腺癌術后放化療療效相關性分析

鐵劍①解云濤②徐曄②朱廣迎①

目的：分析p53基因codon 72多態性與乳腺癌患者術后放化療的預后相關性。方法：選取北京大學腫瘤醫院乳腺癌患者術后接受放化療427例，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）方法分析其p53基因codon 72多態性，比較不同基因型患者間復發及生存的差異。結果：全部患者基因型分布為Pro/Pro型18.3%（78/427）、Pro/Arg型44.0%（188/427）、Arg/ Arg型37.7%（161/427）。3種基因型間無局部復發生存（LRFS）、無局部區域復發生存（LRRFS）、無遠處轉移生存（DDFS）及總生存（OS）均無顯著性差異（均P＞0.05）。427例患者中雌激素受體（ER）陽性為303例，其中Arg/Arg基因型患者OS明顯優于Pro/Pro基因型患者（χ2=6.330，P=0.042）。在多因素分析中p53基因codon 72多態性是ER陽性患者LRFS、LRRFS、DDFS及OS的獨立預后因素，Pro/Pro基因型的患者較Arg/Arg基因型的局部復發風險增加5.9倍（HR=5.9，95%CI 1.1～31.1，P=0.036），局部區域復發風險增加3.1倍（HR=3.1，95%CI 1.1～9.1，P=0.039），遠處轉移風險增加2.8倍（HR=2.8，95%CI 1.3～6.0，P=0.010），死亡風險增加4倍（HR=4.0，95%CI 1.3～12.0，P=0.013）。結論：在ER陽性的乳腺癌術后接受放化療患者中，Pro/Pro基因型的局部及局部區域復發風險、遠處轉移風險、死亡風險均高于Arg/Arg基因型。

乳腺癌 放射治療 化療 p53基因 codon 72多態性

現已發現p53基因多態性至少為10種，而位于第4外顯子的72密碼子（codon 72）多態性因與多種腫瘤的易感性相關而備受關注［1-3］。p53基因codon 72具有CGC或CCC兩種單核苷酸多態性，可以表達產生兩種不同的野生型p53蛋白，即含精氨酸殘基的p53蛋白（Arg p53）或含脯氨酸殘基的p53蛋白（Pro p53），從而產生Arg/Arg純合型、Pro/Pro純合型與Pro/ Arg雜合型3種不同的基因型。研究顯示，兩種p53蛋白具有不同的生化和凋亡能力，在野生型p53中，Arg p53較Pro p53有更強的誘導凋亡能力［4］。乳腺癌患者的研究發現，codon 72多態性造成患者對化療以及內分泌治療反應的不同［5-6］，甚至影響到患者的生存［7］。本研究通過回顧性分析乳腺癌術后接受放化療患者，探究p53基因codon 72多態性對乳腺癌患者術后接受放化療的療效及其生存的影響。

1 材料與方法

1.1臨床資料

選取北京大學腫瘤醫院2003年7月至2007年12月經病理證實為浸潤性乳腺癌的患者427例，患者術后、化療后接受了放療，并均在確診時進行了p53基因codon 72基因型的檢測。患者年齡23～81歲，中位年齡46歲，雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性患者為303例，孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽性患者為260例，人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）陽性患者為112例?；颊咝斜Ｈ槭中g為300例，改良根治術為127例。淋巴結轉移均經病理證實。依據UICC分期，Ⅰ期為26例（6.1%），Ⅱ期為324例（75.9%），Ⅲ期為77例（18.0%）。所有患者均接受了化療，激素受體陽性的患者接受了輔助內分泌治療。保乳術后的放療的患者在全乳照射后均行瘤床加量，部分接受了鎖骨上下區照射；改良根治術后的放療患者接受了胸壁及鎖骨上下區照射。中位隨訪時間83.2（3～116）個月。

1.2DNA提取及p53基因codon 72的基因型檢測

采用酚氯仿從患者血液標本的淋巴細胞中萃取DNA，p53基因codon 72的基因型通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術確定。使用的正向引物為5'-TCCCCCTTGCCGTCCCAA-3'，反向引物為5'-CGTGCAAGTCACAGACTT-3'。PCR在總體積為20μL的反應混合物中完成，包括100 ng DNA，2 μL 10×PCR緩沖劑，0.8 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP），2.5 mmol/L氯化鎂（MgCl2），0.5 μmol/L的引物，1個單位的AmpliTaq DNA聚合酶。反應條件為94℃預變性2 min、94℃變性0.5 min、60℃退火0.75 min、72℃延伸0.5 min，35個循環后，延伸10 min。取PCR產物10 μL與美國New England Biolabs公司生產的BstU1限制性核酸內切酶60℃水浴2 h，產物使用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。Pro/Pro基因型顯示1條帶，Arg/Arg顯示2條帶，雜合子Arg/Pro顯示3條帶（圖1）。

圖1 PCR-RFLP法測定p53基因codon 72的基因型Figure 1Detection of the codon 72 genotype using PCR-RFLP

1.3統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析?；蛐团c患者臨床病理特點的相關性分析采用計數資料的Pearson's χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存分析方法評估患者生存，各基因型間生存差異采用Log Rank檢驗。影響生存的多因素分析采用Cox回歸模型，應用進入法對各因素進行檢驗。進行雙側統計檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1乳腺癌患者p53基因codon 72的基因型分布

427例患者中基因型分布為Pro/Pro型18.3%（78/ 427）、Pro/Arg型44.0%（188/427）、Arg/Arg型37.7%（161/427）。p53基因codon 72的基因型分布與患者年齡、臨床分期、淋巴結轉移、ER或PR以及HER-2狀態均無明顯相關性（表1）。

2.2p53基因codon 72的基因型與生存的關系

全部患者的5年無局部復發生存（local recurrence free survival，LRFS）為94.4%（95%CI 0.922～0.966），5年無局部區域復發生存（local regional recurrence free survival，LRRFS）為92.9%（95%CI 0.904～0.954），5年無遠處轉移生存（distant disease free survival，DDFS）為86.0%（95%CI 0.827～0.893），5年總生存（overall survival，OS）為92.6%（95%CI 0.901～0.951）。codon 72不同基因型患者LRFS、LRRFS、DDFS及OS間差異無統計學意義（P＞0.05，表2，圖2）。

根據患者ER及HER-2表達進行亞組分析后發現，HER-2陰性或陽性，以及ER陰性患者預后在p53基因codon 72不同基因型間無顯著性差異。但在ER陽性的303例患者中，Arg/Arg基因型患者OS明顯優于Pro/Pro基因型患者（P＜0.05，表3，圖3）。

表1427 例患者p53基因codon 72的基因型與臨床病理學特征的關系Table 1Correlation between p53 codon 72 genotypes and patients'clinicopathologic characteristics in 427 patients

表2427 例患者p53基因codon 72的基因型與生存的關系Table 2Correlation between p53 codon 72 genotypes and survival rate in 427 patients

圖2427 例患者不同p53基因codon 72基因型間生存比較Figure 2Comparison of the survival rates among 427patients with different p53 codon 72 genotypes

表3303 例ER陽性患者p53基因codon 72基因型與生存的關系Table 3Correlation between p53 codon 72 genotypes and ER-positive 303 patients'survival

圖3303 例ER陽性患者不同p53基因codon 72基因型間生存比較Figure 3Comparison of the survival rates among 303 ER-positive patients with different p53 codon 72 genotypes

在全部患者的多因素分析中，p53基因codon 72的基因型不是LRFS、LRRFS、DDFS以及OS的獨立預后因素。但在ER陽性的303例患者中，采用進入法校正年齡、HER-2狀態、臨床分期和基因型后發現，p53基因codon 72的基因型是LRFS、LRRFS、DDFS以及OS的獨立預后因素。Pro/Pro基因型患者局部復發風險、局部區域復發風險、遠處轉移風險及死亡風險均明顯高于Arg/Arg型患者（表4）。為排除p53基因codon 72多態性與ER狀態間存在相互影響，在全部患者多因素分析中加入了兩者的交互項，結果并未發現其與預后相關。

表4 ER陽性患者生存的多因素分析Table 4Multivariate analysis of ER-positive patients

3 討論

本課題組前期研究發現，Arg/Pro及Arg/Arg基因型乳腺癌患者對化療更加敏感［5］。在此基礎上，本研究對427例乳腺癌術后接受化療患者進行了p53基因codon 72多態性與術后放療療效的研究，而研究結果并未發現p53基因codon72不同基因型與放化療后的局部復發以及局部區域復發間有明顯的相關性。

p53基因codon72多態性對癌癥患者生存的影響目前還存在爭議。以往的研究顯示，具有Pro/Pro基因型的乳腺癌患者生存較其他基因型患者差［7］。在頭頸部腫瘤及神經母細胞瘤患者中也發現了同樣的結果［4，8］。但另外的研究中卻發現，具有Arg等位基因的乳腺癌患者對治療的反應及預后較差［9］，而Pro/Pro基因型的鼻咽癌患者表現出較好的無進展生存［10］。本研究中，全部患者p53基因codon 72的3種不同基因型間并未顯示出生存的明顯差異，這與近期的另外幾項乳腺癌研究結果相似［11-12］。這種研究結果的

差異，可能源于p53狀態的不同。在野生型p53中，Arg等位基因有更強的誘導凋亡能力，具有Arg等位基因患者的OS和無進展生存（progress free survival，PFS）優于含Pro等位基因的患者［4］。而在突變型p53中，結果恰恰相反，Pro等位基因較Arg等位基因有更強的誘導凋亡能力，具有Pro等位基因患者的OS及PFS優于含Arg等位基因的患者［13］。

Desmedt等［14］的研究顯示，乳腺癌p53突變率約為30%，而ER陽性患者的p53突變率僅26%［15］。較低的p53突變率可能是本研究ER陽性的患者Arg/ Arg基因型預后明顯優于Pro/Pro基因型的原因。

總之，本研究發現在乳腺癌患者接受放化療的ER陽性患者中，Arg/Arg基因型的預后明顯優于Pro/ Pro基因型，但這一結論還需要更大樣本及更加完善的研究加以證實。

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（2014-10-13收稿）

（2015-01-23修回）

Association between p53 codon 72 polymorphism and curative effect of postoperative chemo-radiotherapy for breast cancer

Jian TIE1,Yuntao XIE2,Ye XU2,Guangying ZHU1

Guangying ZHU;E-mail:zgypu@aliyun.com

Objective:To investigate the association between p53 codon 72 polymorphism and the prognosis of breast cancer patients receiving chemotherapy and radiotherapy after surgery.Methods:A total of 427 breast cancer patients treated with chemo-radiotherapy after surgery at Beijing Cancer Hospital were selected for this study.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism was adopted to analyze the p53 codon 72 polymorphism.Survival analysis was conducted to compare the disparities of recurrence and survival among the patients with different p53 codon 72 polymorphic variants.Results:The distribution of three genotypes of p53 codon 72 in our cohort is as follows:Pro/Pro 18.3%(78/427),Pro/Arg 44.0%(188/427),and Arg/Arg 37.7%(161/427). No significant difference was observed among the local recurrence-free survival(LRFS),loco-regional recurrence-free survival(LRRFS),distant disease-free survival(DDFS),and overall survival(OS)among the three genotypes(all P>0.05).Among the 303 estrogen receptor(ER)-positive patients,OS was significantly better in patients with Arg/Arg genotype than those with Pro/Pro genotype(χ2= 6.33,P=0.042).The multivariate analysis showed that the p53 codon 72 polymorphism is an independent factor of prognosis for LRFS, LRRFS,DDFS,and OS of ER-positive patients.For the ER positive patients with Pro/Pro genotype,the local recurrence,local-regional recurrence,distant metastasis,and mortality risks were 5.9(HR=5.9,95%CI 1.1-31.1,P=0.036),3.1(HR=3.1,95%CI 1.1-9.1,P= 0.039),2.8(HR=2.8,95%CI 1.3-6.0,P=0.010),and 4.0(HR=4.0,95%CI 1.3-12.0,P=0.013)times higher than those with Arg/Arg genotype,respectively.Conclusion:For ER-positive breast cancer patients who underwent surgery and chemo-radiotherapy,the local recurrence,loco-regional recurrence,distant metastasis,and mortality risk with Pro/Pro genotype are significantly higher compared to those withArg/Arg genotype.

breast cancer,radiotherapy,chemotherapy,p53,codon 72 polymorphism

10.3969/j.issn.1000-8179.20141690

①北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所放療科，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室（北京市100142）；②乳腺中心

朱廣迎zgypu@aliyun.com

1Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research(Ministry of Education),Department of Radiation Oncology,Pe

king University School of Oncology,Beijing Cancer Hospital&Institute;2Department of Breast Center,Beijing 100142,China

鐵劍專業方向為乳腺癌的放射治療。

E-mail：tie@yeah.net