海口市市售新鮮蔬菜微生物污染分析

馬 晨，陳雪華，錢 程

（中國熱帶農業科學院分析測試中心海南省熱帶果蔬產品質量安全重點試驗室，海南海口 571101）

海口市市售新鮮蔬菜微生物污染分析

馬 晨，陳雪華，錢 程

（中國熱帶農業科學院分析測試中心海南省熱帶果蔬產品質量安全重點試驗室，海南海口 571101）

選取生菜、香菜、小蔥、黃瓜、番茄、豆芽（苗）等6類高污染風險蔬菜，考查其細菌總數、大腸菌群、可培養的細菌種類及4類食源性致病菌（沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌）等指標。結果表明，供試蔬菜細菌總數和大腸菌群數均較高，分別在102～104g-1和240～1 100 g-1，且符合以下規律，香菜＞生菜＞小蔥＞豆苗＞番茄＞黃瓜；香菜和生菜中可培養的細菌種類存在部分差異，相似菌屬包括葡萄球菌屬、微小桿菌屬、庫特菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬和檸檬酸桿菌屬等條件致病菌；香菜和生菜中分別分離到1株疑似沙門氏菌和大腸桿菌O157。故生食生菜和香菜可能存在安全風險；農田土、有機肥和灌溉水中可培養的細菌種類與香菜和生菜相似，且也檢測到大腸桿菌、李斯特菌和沙門氏菌。故受污染的環境樣品是蔬菜中食源性致病菌的潛在污染源。

新鮮蔬菜；微生物污染；食源性致病菌；mini-VIDAS；VITEK；海口

新鮮蔬菜可提供必需的維生素等營養，是餐桌上必不可少的食物。為了防止維生素等營養的流失，人們更加偏向于生吃新鮮蔬菜［1］。在我國，生食新鮮蔬菜的產量和消費量也日益增多。但由于缺少加熱過程，生食類蔬菜中微生物污染，特別是食源性致病菌污染對人類健康存在較大威脅［1］。長期以來，動物源性食物被認為是食源性致病菌的主要來源，但近年國外爆發多起新鮮蔬菜食源性致病菌中毒事件［2-4］。如2006年，美國沙門氏菌污染的菠菜造成205人感染，3人死亡；2008年美國的番茄-辣椒沙拉檢測出沙門氏菌感染；2011年德國爆發出血性大腸桿菌“毒黃瓜”中毒事件，導致14人死亡。因而由新鮮果蔬引起的食源性致病菌感染也在迅速增加［5］。除致病菌外，新鮮果蔬由于富含營養物質，更易滋生多種細菌，且許多細菌既是腸道的正常菌群，也是條件致病菌。在一定條件下（如抵抗力下降或腸道菌群失調時）能引起機體感染［6］。另有研究表明，被人類病原菌污染的果蔬不能通過常規清洗方法徹底消除［7］。所以關注新鮮蔬菜上微生物（細菌）的污染水平，特別是食源性致病菌的污染水平，對保障蔬菜質量安全具有重要意義。

海南省地處亞熱帶到熱帶過渡區，水熱充沛，為食源性致病菌的生存和繁殖提供了有利條件［8］。與溫帶不同，熱區的四季溫度均適合微生物的生長和繁殖，更有利于食源性致病菌滋生。另外，熱區復種指數高、病蟲害發生頻繁、田間管理不當，動物糞便和植物交叉污染嚴重，因而果蔬上食源性致病菌的污染風險可能較高［8］。最后，熱區是全國冬季瓜菜的主要供應源，微生物安全的問題一旦爆發可能迅速蔓延，波及范圍巨大，將給社會和國家帶來極大損失。因而，保障熱區果蔬的微生物質量安全意義更加重大。

本文以高污染風險的幾類蔬菜為試驗對象，運用傳統培養方法（國標法），并結合VIDAS全自動熒光免疫分析儀快速篩選法，著重考查果蔬上細菌總數、大腸菌群、可培養的細菌種類，以及沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等食源性致病菌指標，旨在總體了解新鮮蔬菜微生物污染水平，并為新鮮蔬菜的食用安全控制和微生物風險分析提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

從農貿市場和超市隨機抽取污染風險較高的生菜、香菜、小蔥、黃瓜、番茄、豆芽（苗）等蔬菜各20份，共計120份。

另從蔬菜地采集農田灌溉水、有機肥和農田土壤樣品各5份。

1.1.2 培養基和試劑

主要培養基和試劑參照GB/T 4789.28—2013《食品安全國家標準食品微生物檢驗培養基和試劑要求》，均購自北京陸橋技術有限公司。mini-VIDAS全自動熒光免疫分析儀中的沙門氏菌、大腸桿菌O157和李斯特菌試劑條和VITEK II com Pact 30全自動快速微生物鑒定系統的革蘭陰性菌鑒定卡（GN卡）均購自生物梅里埃公司。

1.2 檢測方法

所有蔬菜樣品去掉表面泥土，簡單清洗，檢測的樣品重量為50 g。細菌總數和大腸菌群檢測方法參照GB/T 4789.2/3—2010《食品安全國家標準食品微生物檢驗》系列標準。沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等4種

食源性致病菌檢測方法參照GB/T 4789.4/30/10—2010《食品安全國家標準食品微生物檢驗》系列標準，前增菌和選擇性增菌后，分別采用mini-VIDAS全自動熒光免疫分析儀和選擇性平板畫線分離法檢測樣品中致病菌，純化后的單菌落進行革蘭氏染色，并通過VITEK II全自動快速微生物鑒定系統分析鑒定或者提取純化菌落DNA，16S r DNA擴增后測序，并與GenBank數據庫比對以初步確定細菌種屬。蔬菜和環境樣品中可培養的細菌種類的研究采用TSA平板（胰蛋白胨大豆瓊脂）稀釋涂布，并結合16S rRNA測序和VITEK II com Pact 30全自動快速微生物鑒定系統分析的方法。

2 結果與分析

2.1 蔬菜微生物學指標檢測

按照食品檢驗程序，分別對樣品進行細菌總數和大腸菌群檢測（表1）。

表1 新鮮蔬菜樣品的微生物學檢測結果

從表1看出，不同種蔬菜細菌總數存在差異，數值范圍在102～104g-1，且香菜＞生菜＞小蔥＞豆苗＞番茄＞黃瓜。這一結果可能與蔬菜生長環境和蔬菜表面結構存在一定關系［9］。香菜、生菜、小蔥和豆苗生長過程直接與土壤接觸，土壤和有機肥中的微生物易進入蔬菜體內，特別是蔬菜根部的微生物數量明顯高于莖部和葉子［10］。番茄和黃瓜種植中不直接接觸土壤，且番茄表皮光滑，不利于微生物感染。

大腸菌群是評價食品衛生質量的重要標準之一，反映食品糞便污染情況。試驗發現，各類蔬菜大腸菌群的測定值均較高，規律與細菌總數相似。故參試蔬菜受大腸菌群污染較重，尤其是生菜、香菜和小蔥。采用m ini-VIDAS全自動熒光免疫分析儀快速篩選法和選擇性平板畫線分離法檢測蔬菜樣品中致病菌的存在試驗表明，2種方法有較好的一致性。從香菜中分離到1株疑似沙門氏菌，從生菜中分離到1株大腸桿菌O157疑似菌株，其他樣品中均未檢出致病菌。

2.2 生菜和香菜中可培養細菌種類

從表1看出，香菜和生菜中細菌總數較多。以這2種蔬菜為代表，研究其中可培養細菌種類。圖1和2分別揭示了生菜和香菜中相關細菌的系統進化關系。

由圖1可知，生菜中分離到的細菌，革蘭氏陽性菌有木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）和乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum），革蘭氏陰性菌有吉氏庫特菌（Kurthia gibsonii）、楊氏檸檬酸桿菌（Citrobacter youngae）、不動桿菌屬（Acinetobacter beijerinckii和Acinetobacter harbinensis）、變形桿菌屬（Proteus penneri和Proteus vulgaris）、普羅威登斯菌屬（Providencia thailandensis）、腸桿菌屬（Enterobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas punctata和Aeromonas australiensis）和希瓦氏菌屬（Shewanella litorisediminis）。其中，變形桿菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬是常見的腸桿菌科的條件致病菌。氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬也是環境中常見的條件致病菌，可引起魚類、牛奶、蔬菜等食品污染和腐敗［11-12］。利用mini-VIDAS全自動熒光免疫分析儀-大腸桿菌O157試劑條，檢測出1份生菜樣品呈陽性，相對熒光值為0.72。疑似菌落分離純化后，由VITEK II全自動快速微生物鑒定系統分析，結果為大腸桿菌（表2），置信度98%。該菌株的致病性需經腸毒素試驗進一步確定。故生食生菜可能存在安全風險，需經較嚴格的消毒處理。

圖1 生菜中可培養細菌16S rRNA系統發育關系

圖2 香菜中可培養細菌16S rRNA系統發育關系

表2 生菜中疑似大腸桿菌VITEK II鑒定結果

由圖2可知，香菜中可培養的細菌主要有革蘭氏陽性菌葡萄球菌屬（木糖葡萄球菌Staphylococcus xylosus和松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri）和微小桿菌屬（Exiguobacterium indicum），革蘭氏陰性菌假單胞菌屬（Pseudomonas bauzanensis、Pseudomonas guariconensis和Pseudomonas cremoricolorata）、腸桿菌屬（Enterobacter cancerogenus）、氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）、普羅威登斯菌屬（Providencia thailandensis）、抗壞血酸克呂沃爾菌（Kluyvera ascorbata）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）、楊氏檸檬酸桿菌（Citrobacter youngae）和吉氏庫特菌（Kurthia gibsonii）。其中，腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬和氣單胞菌屬是常見的條件致病菌；沙門氏菌是嚴重的食源性致病菌，是食品衛生必檢項目之一。故生食香菜存在一定的安全風險，需經嚴格消毒處理。將疑似沙門氏菌菌株分離純化后，由VITEK II全自動快速微生物鑒定系統分析，結果為沙門氏菌屬（表3），置信度99%。血清學等分型試驗待進一步確認。

表3 香菜中疑似沙門氏菌VITEK II鑒定結果（GN測試卡）

本試驗僅利用傳統培養方法研究2類蔬菜中可培養的部分細菌種類，所得結果僅占蔬菜中細菌種類的極少部分。Leff等［13］利用16S rRNA基因焦磷酸測序技術，分析一般栽培和有機栽培條件下不同果蔬的表面微生物種類。結果發現，不同果蔬的表面微生物組成存在明顯差異，但有些蔬菜種類（如芽菜、生菜、番茄等）表面微生物種類極相似，主要是腸桿菌科的細菌。本試驗結果與該文獻報道的結果相似。生菜和香菜中可培養的細菌種類部分相似，以腸桿菌科為主，但也存在部分不同細菌種屬。2種蔬菜中都檢出葡萄球菌屬、微小桿菌屬、庫特菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬和檸檬酸桿菌屬。與香菜相比，生菜中特有的種屬為不動桿菌屬、變形桿菌屬和希瓦氏菌屬。與生菜相比，香菜中特有的種屬為假單胞菌屬、克呂沃爾菌屬和沙門氏菌屬。另外從圖中可發現，純培養物鑒定出的重名細菌較多，平均次數為2～4次，這些細菌可能是2類蔬菜中的優勢菌。加強對這些優勢菌殺滅特性的研究，可為開發蔬菜除菌抑菌技術奠定基礎［14］。

2.3 環境樣品微生物指標和可培養細菌種類

新鮮果蔬產品的生長環境，如土地狀況、有機肥使用及灌溉水源是蔬菜中食源性致病菌污染的關鍵因素［9，15］。據文獻報道，沙門氏菌（Salmonella）和李斯特菌（Listeria）能在農田灌溉的污水污泥或有機肥污染的土壤中存活數月，并可以污染生菜和西芹的地上部分，甚至一直存活到蔬菜收獲期［16-17］。因而，監測菜園中土壤、有機肥和灌溉水中食源性致病菌，對保障新鮮蔬菜的微生物質量安全具有重要意義。本文采集蔬菜地的農田灌溉水、有機肥和農田土壤樣品各5份，測定大腸菌群數量和4種食源性致病菌。結果表明，灌溉水、有機肥和農田土中大腸菌群較豐富，數量遠遠超過被檢蔬菜（表1和4）。所以，農田土、灌溉水和有機肥可能是蔬菜中大腸菌群的潛在來源。另外，灌溉水、有機肥和農田土中分別檢測到沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌（表4）。雖然蔬菜樣品和環境樣品并非采自同一地點，但是這一結果也表明，蔬菜中食源性致病菌可能來源于受污染的土壤、水源或者肥料等環境。因而，采取有效的農田管理措施并保證投入品的微生物安全對于防止蔬菜致病菌污染至關重要。另外，采用選擇性平板分離法，挑取疑似菌落或其他可培養菌落，分離純化后，由VITEK II全自動快速微生物鑒定系統分析，得到可培養的部分細菌種類（表5）。其中，腸桿菌屬、庫克菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、沙門氏菌屬、大腸桿菌屬在生菜或香菜中都有檢出。所以，菜園土壤、有機肥和灌溉水中的“微生物大本營”是蔬菜中微生物污染的潛在來源。對于土/肥/水中檢測到的其他菌種，如沙雷菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和泛菌屬等在其他果蔬中也有檢出，且其也是潛在致病菌，對蔬菜微生物質量安全存在威脅［13-14］。

表4 環境樣品微生物學檢測結果

表5 樣品中部分可培養細菌VITEK II鑒定結果

3 小結

蔬菜微生物污染情況。供試蔬菜細菌總數和大腸菌群數均較高，數值分別在102～104g-1和240～1 100 g-1。2個指標數值均符合以下規律:香菜＞生菜＞小蔥＞豆苗＞番茄＞黃瓜；香菜和生菜中可培養的細菌種類存在部分差異，相似菌屬包括葡萄球菌屬、微小桿菌屬、庫特菌屬、氣單胞菌屬、腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬和檸檬酸桿菌屬，部分菌屬是條件致病菌；從香菜中分離到1株疑似沙門氏菌，生菜中分離到1株疑似大腸桿菌O157，經VITEK系統鑒定，置信度分別為98%和99%。故生食生菜和香菜可能存在安全風險，食用前需經嚴格的消毒處理。

環境樣品微生物污染情況。分析農田土、有機肥和灌溉水中可培養的細菌種類發現，部分細菌種類與香菜和生菜中分離到的細菌種類相似，如腸桿菌屬、庫克菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、沙門氏菌屬、大腸桿菌屬等。另從農田土、有機肥和灌溉水中分別檢測到大腸桿菌、李斯特菌和沙門氏菌。故污染的農田土、有機肥或灌溉水可能是蔬菜中食源性致病菌的重要來源。

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（責任編輯：張瑞麟）

表4 不同殺菌強度對產品的影響

2.5 藍莓草莓混合果醬質量標準

2.5.1 感官指標

醬體呈鮮紅色，表面有光澤，無析水現象。

2.5.2 理化指標

總糖（以轉化糖計）:50%～60%；總酸（以檸檬酸計）:0.5%～1.2%；鉛（Pb計）:≤1 mg· kg-1；總砷（以As計）:≤0.5 mg·kg-1；錫（以Sn計）:≤250 mg·kg-1。

2.5.3 微生物指標

符合商業無菌要求。

2.5.4 保質期

保質期為18個月。

3 小結

通過試驗，綜合確定藍莓草莓混合果醬的加工工藝如下:藍莓、草莓鮮果打漿后按照1∶1的比例混合，添加0.1%異抗壞血酸鈉和0.05%檸檬酸，以保持混合果漿較好的口感，并保護其色澤；黃原膠和海藻酸鈉復合使用（1.25%∶1.25%，m/m）以發揮最佳的增稠效果；正交試驗優化后的配方是復合果漿用量60%、果葡糖漿用量45%、復合增稠劑用量2.5%，醬體加熱至80℃灌裝封蓋后，在80℃下殺菌25 min即可達到商業無菌要求，且產品質量符合相關國家標準。

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（責任編輯：高 峻）

TS 255.7

A

0528-9017（2015）03-0396-06

10.16178/j.issn.0528-9017.20150336

2014-10-28

中國熱帶農業科學院院本級基本科研業務費專項資金（1630052014010）

馬 晨（1986-），女，江蘇徐州人，助理研究員，博士，研究方向為食品和環境微生物。E-mail:mc19860112@163.com。

文獻著錄格式:馬晨，陳雪華，錢程.海口市市售新鮮蔬菜微生物污染分析［J］.浙江農業科學，2015，56（3）:396-401.