ZHX3基因沉默對BMSCs中成骨相關因子表達的影響

張苗苗，包翠芬，王艷，閔鶴鳴，秦書儉△

ZHX3基因沉默對BMSCs中成骨相關因子表達的影響

張苗苗1，包翠芬2，王艷3，閔鶴鳴4，秦書儉1△

目的探討鋅指蛋白和同源框3（ZHX3）基因沉默對骨髓間充質干細胞（BMSCs）中smad3、smad4、RUNX2表達的影響。方法構建ZHX3低表達慢病毒載體并轉染大鼠BMSCs（ZHX3沉默組），同時設空載病毒轉染BMSCs（載體對照組）及不做任何處理的BMSCs（空白對照組）。熒光顯微鏡下測定細胞轉染率并采用免疫印跡技術鑒定轉染是否成功；采用免疫熒光化學和免疫印跡技術定性定量檢測ZHX3沉默時smad3、smad4、RUNX2表達情況。結果（1）復蘇培養的細胞具有BMSCs表型。（2）轉染后，ZHX3沉默組和載體對照組均表達綠色熒光，空白對照組不表達熒光，且沉默組ZHX3基因表達顯著低于載體對照組。（3）免疫熒光結果顯示，smad3、smad4的陽性表達位于細胞核和細胞質，RUNX2的陽性表達主要定位于細胞核。3組細胞均可見陽性表達細胞，且空白對照組與載體對照組之間熒光強度未見顯著差異，但ZHX3基因沉默組的熒光強度顯著低于2個對照組。（4）免疫印跡檢測smad3、smad4、RUNX2的條帶于空白對照組和載體對照組中無顯著差異，但均顯著高于ZHX3沉默組（P＜0.05）。結論ZHX3基因沉默后BMSCs體外成骨能力延遲，可能通過下調smad3、smad4、RUNX2來發揮作用。

DNA結合蛋白質類；鋅指；基因，同源盒；轉錄因子；基因沉默；間質干細胞；smad3；smad4；RUNX2；轉錄抑制因子-鋅指蛋白和同源框3

植骨材料不足是臨床骨缺損修復中所面臨的主要問題之一［1］。采用組織工程骨移植是解決植骨材料不足問題的主要方法之一。而植骨種子細胞是該研究的核心內容。目前種子細胞最主要的來源為骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），而BMSCs向成骨細胞的誘導分化是成骨的關鍵因素。研究顯示，誘導分化的關鍵步驟可能取決于早期調控的轉錄因子，其中鋅指蛋白和同源框3（zinc fingers and homeoboxes 3，ZHX3）是近年來發現的成骨分化早期標志物，屬ZHX蛋白家族成員之一，含有2個鋅指結構和5個同源結構域［2-3］。研究顯示，與晚期出現的標志物相比，ZHX3能夠更早、更快地識別干細胞的成骨潛能［3］。最近實驗證明，ZHX3基因過表達可促進BMSCs體外成骨能力［4］。轉化生長因子（TGF）-β/smad通路是BMSCs向成骨細胞誘導分化的主要信號通路之一，而smad3、smad4、RUNX2是該通路中的主要調控因子［5］。ZHX3作為成骨分化早期的標志物，是否通過調控上述通路發揮促進成骨分化作用，有待于深入地探討。

1 材料與方法

1.1 材料ZHX3低表達慢病毒及陰性對照病毒（上海吉凱基因有限公司）；smad3、smad4、RUNX2抗體（Abcam公司）；TRITC標記的熒光二抗（北京中杉公司）；0.25%Trypsin-0.04%EDTA、SD大鼠BMSCs及干細胞培養基、OriCellTM間質干細胞成骨誘導培養基試劑盒（廣州賽業公司）。

1.2 SD大鼠BMSCs的復蘇培養與傳代液氮中取出凍存的BMSCs迅速放入37℃水浴中快速晃動，直至凍存懸液完全融解。將其移入含完全培養基的離心管中，250×g離心5 min，去上清液，向細胞沉淀物加入2～3 mL完全培養基，吹打均勻后，將細胞按（2～4）×104個活細胞/cm2的密度接種到培養瓶中。37℃、5%CO2、80%相對濕度的培養箱中培養。隔日換液。當細胞達80%～90%的匯合度，采用胰酶進行消化和傳代。相差顯微鏡觀察細胞形態及生長情況。

1.3 BMSCs一般狀態的觀察及檢測細胞按0.5×104個/mL的密度接種于24孔培養板，每天每組細胞各選取3孔，連續測7 d，酶標儀490 nm波長上測定光密度（OD）值，繪制生長曲線［6］。

1.4 慢病毒轉染BMSCs的效率測定及轉染鑒定設置3個不同梯度（10、50和100μL）的病毒添加孔及1個空白對照孔，以確定轉染的最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）。96 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的轉染效果，計算轉染率，轉染率=綠色螢光蛋白（GFP）表達細胞/細胞總數× 100%［7-8］。選擇轉染率在80%以上的孔，此時的滴度為病毒最佳感染滴度。實驗分為空白對照組、載體對照組和ZHX3沉默組。轉染后觀察細胞狀態，24 h后更換新鮮培養基。慢病毒轉染之后Western blot檢測ZHX3蛋白的表達情況，以鑒定是否轉染成功。

1.5 BMSCs的誘導分化取第3代大鼠BMSCs以2×104cells/cm2的細胞密度接種在事先包被0.1%明膠的6孔板中。當細胞融合度達到60%～70%時，小心地將孔內完全培養基吸走，向6孔板中加入2 mL成骨誘導分化培養基，繼續培養［9］。

1.6 免疫熒光法檢測smad3、smad4、RUNX2蛋白表達當病毒轉染細胞達80%～90%的匯合度，胰酶消化，計數重懸細胞于完全培養基中，先在每個孔里滴少量完全培養基，使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，然后放玻片，按照4×104/孔細胞密度種到6孔培養板。24 h細胞貼壁后，棄去完全培養基，加入成骨誘導培養基，24 h后棄去成骨誘導培養基，取出爬片采用免疫熒光檢測smad3、smad4、RUNX2表達情況。爬片棄廢液，PBS沖洗3次，每次3 min，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗，0.5%Triton X-100孵育30 min，PBS沖洗，5%BSA室溫封閉30 min后，PBS沖洗。一抗濕盒孵育4℃過夜，PBS清洗，熒光標記的二抗工作液孵育（濕盒）37℃30 min（注意避光），PBS沖洗，Hoechest33258染液復染細胞核，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察smad3、smad4、RUNX2表達情況。

1.7 免疫印跡法檢測smad3、smad4、RUNX2蛋白表達收集3組細胞，倒掉培養液，3 mL 4℃預冷的PBS洗滌細胞3次。用刮棒將細胞刮于培養瓶的一側，然后用槍將細胞液移至1.5 mL離心管中，整個操作盡量在冰上進行。在4℃下2 000 r/min離心5 min，加400μL含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，后靜置30 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，留取上清液。用BCA法測定蛋白含量，并制樣，-20℃冰箱保存。灌膠與上樣、電泳、轉膜后加入一抗，4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗脫3次，每次5 min；二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗脫3次，每次5 min；ECL發光法顯色；掃描電泳條帶，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子質量和OD值。采用β-actin作為內參。根據目的條帶與內參照條帶OD的比值表示待測蛋白含量。

1.8 統計學方法應用SPSS 17.0統計軟件。計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs的培養細胞于復蘇24 h后貼壁，呈長梭形，排列緊密，整體排列更趨于規律性，呈漩渦狀，見圖1A。傳代后細胞呈成纖維細胞樣形態，以長梭形為主，細胞形態、大小均一，細胞呈典型的BMSCs樣，見圖1B。

2.2 BMSCs一般狀態觀察及檢測3組BMSCs細胞傳代培養后生長狀態良好，培養1 d處于潛伏期，空白對照組2 d后進入對數增殖期，6～7 d后進入平臺期。載體對照組和ZHX3沉默組傳代后3 d進入對數增殖期，時間集中在3～5 d，6 d后進入平臺期，見圖2。

Fig.1The recovery and subculture of BMSCs圖1 BMSCs復蘇和傳代培養（×200）

Fig.2Growth curves of BMSCsin three groups圖2 各組BMSCs生長曲線

2.3 慢病毒轉染BMSCs和轉染效率的測定及鑒定熒光顯微鏡下載體對照組和ZHX3沉默組均觀察到帶有較強綠色熒光的BMSCs，而空白對照組則未見到特異性熒光影像，見圖3。病毒轉染率：結果顯示MOI為10、50、100時，轉染率分別為（43.90± 3.60）%、（92.43±4.33）%、（93.40±2.80）%，轉染效率隨著滴度的增加而增加，差異有統計學意義（F= 182.286，P＜0.05），而MOI 50和MOI 100時轉染率增加差異幅度不大，故選擇MOI 50為細胞最佳感染條件。免疫印跡結果顯示，3組均可見ZHX3陽性表達條帶，但ZHX3沉默組的表達條帶（50.63%± 4.13%）明顯弱于空白對照組（75.83%±4.80%）和載體對照組（71.69%±5.51%），差異有統計學意義（F= 23.334，P＜0.05），提示ZHX3低表達的BMSCs轉染成功，見圖4。

2.4 免疫熒光檢測smad3、smad4、RUNX2的表達情況熒光顯微鏡下可見，smad3、smad4的陽性表達位于細胞核和細胞質，可見明顯的紅色熒光，3組細胞均可見陽性表達細胞，且空白對照組與載體對照組之間熒光強度未見顯著差異，但ZHX3沉默組的熒光強度顯著低于2個對照組。熒光顯微鏡下可見，RUNX2的陽性表達主要定位于細胞核，可見明顯的綠色熒光。3組細胞均可見陽性表達細胞，且空白對照組與載體對照組之間熒光強度未見顯著差異，但ZHX3沉默組的熒光強度顯著低于2個對照組，見圖5。

Fig.3Virus transfection of BMSCs in three groups圖3 各組細胞病毒轉染情況

Fig.4The expression of ZHX3 protein in three groups圖4 各組細胞ZHX3蛋白表達情況

Fig.5Expressions of smad3，smad4 and RUNX2 in three groups of cells（immunofluorescence staining，×400）圖5 各組細胞smad3、smad4、RUNX2的蛋白表達（免疫熒光染色，×400）

2.5 免疫印跡檢測smad3、smad4、RUNX2蛋白表達smad3、smad4、RUNX2的條帶于空白對照組和載體對照組中差異無統計學意義（P＞0.05），但均顯著高于ZHX3沉默組（P＜0.05），見圖6、表1。

Fig.6The expressions of smad3，smad4 and RUNX2 in three groups of cells圖6 3組細胞smad3、smad4、RUNX2的表達

Tab.1The Comparison of expressions of smad3，smad4 and RUNX2 between three groups of cells表1 各組細胞smad3、smad4、RUNX2表達量比較（n=3，）

Tab.1The Comparison of expressions of smad3，smad4 and RUNX2 between three groups of cells表1 各組細胞smad3、smad4、RUNX2表達量比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與ZHX3沉默組比較，P＜0.05

組別空白對照組載體對照組Z H X 3沉默組F s m a d 3 2 9 . 3 1 ± 0 . 9 9 a 3 0 . 8 3 ± 1 . 0 5 a 1 9 . 2 6 ± 3 . 2 5 2 8 . 2 1 1＊＊s m a d 4 5 7 . 4 0 ± 4 . 5 2 a 5 3 . 1 7 ± 1 . 6 9 a 2 8 . 6 6 ± 0 . 6 6 9 1 . 3 4 0＊＊R U N X 2 1 1 . 1 9 ± 1 . 2 3 a 1 0 . 1 5 ± 1 . 3 7 a 3 . 9 4 ± 1 . 5 2 2 4 . 2 1 8＊＊

3 討論

種子細胞誘導分化為成骨細胞的關鍵可能取決于早期調控的轉錄因子。ZHX3作為2003年新克隆的轉錄抑制因子［2］，是成骨分化早期的標志物。Suehiro等［3］研究發現，采用siRNA技術敲減ZHX3基因，轉染至BMSCs內，誘導后6～21 d的成骨能力（堿性磷酸酶含量、骨基質礦化情況）均呈明顯的減弱和延遲現象，此研究結果提示ZHX3在成骨分化過程中起著重要的作用，可能是BMSCs從未分化階段向成骨分化過程的轉換開關。ZHX3作為成骨分化早期的標志物，與晚期出現的標志物相比能夠更早、更快地識別干細胞的成骨潛能。

smad3和smad4是TGF-β1信號轉導通路中的重要因子，在成骨細胞分化過程中發揮重要作用。smad3受體磷酸化后與smad4結合，將TGF-β1信號直接由細胞膜轉導入細胞核內，誘導對TGF-β1信號的轉錄應答［10］，進一步發揮促成骨作用。研究發現，野生型smad3基因能夠抑制BMSCs增殖，通過非細胞外信號激酶通路促進BMSCs向成骨方向分化和成熟［11］。既往研究證實，smad3的缺少導致成骨標志物降低［12-13］。說明smad3不僅是促進骨形成的成分，而且在介導TGF-β1調控骨形成、成骨分化過程中發揮關鍵作用。smad4復合物通過影響RUNX2的表達，從而影響成骨靶基因轉錄［14］。通過siRNA干擾smad4表達使重要成骨細胞分子標志物和調節分子表達水平下調［15］。RUNX2是成骨細胞特異性轉錄因子，直接參與調控Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白成骨相關基因的表達，刺激成骨細胞分化。此外，smad4作用于與堿性磷酸酶表達有關的RUNX2基因，外源性smad4可以促進表達RUNX2的C2C12細胞的堿性磷酸酶活性，但該基因突變后，堿性磷酸酶活性也檢測不出，說明smad4與RUNX2之間有協同作用。

本實驗通過BMSCs慢病毒轉染，建立ZHX3低表達模型，進一步觀察ZHX3低表達時對成骨誘導通路中smad3、smad4、RUNX2的調控作用。免疫熒光、免疫印跡實驗結果顯示，當ZHX3基因沉默時，smad3、smad4、RUNX2的表達強度呈明顯的減弱趨勢，顯著低于未經處理的BMSCs，由此筆者推測當ZHX3基因含量表達下降時，可引起TGF-β1/smad通路中的smad3、smad4的表達下調，進一步引起下游轉錄因子RUNX2的表達下降，從而影響BMSCs的成骨分化能力，導致成骨分化能力延遲。但是，ZHX3基因究竟處于TGF-β1/smad通路的何種位置，究竟是ZHX3基因沉默直接抑制了smad3、smad4的表達，還是ZHX3基因沉默后通過負反饋方式抑制了兩者的表達，即ZHX3究竟是位于smad3、smad4的上游還是下游，還需進一步深入研究來證實。

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（2015-08-11收稿 2015-09-15修回）

（本文編輯 魏杰）

Effects of ZHX3 gene silence on the expression of osteoblast-related factors in BMSCs

ZHANG Miaomiao1，BAO Cuifen2，WANG Yan3，MIN Heming4，QIN Shujian1△
1 Department of Human Anatomy and Histology and Embryology，2 Key Lab of Molecular Cell Biology and New Drug Development，3 Department of Neurology，First Affiliated Hospital of Jinzhou City；4 Department of Cell Biology，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China△

ObjectiveTo investigate the effects of zinc fingers and homeoboxes 3（ZHX3）silence on expressions of smad3，smad4 and RUNX2 in bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）.MethodsZHX3 low expression vector（ZHX3 silent group）was constructed and was transfected to rat BMSCs.Empty vector was transfected into BMSCs and was used as vehicle control group，and wild type BMSCs was used as the control group.The cell transfection rate was measured under a fluorescence microscope，and then the successful transfection was identified.The immunocytochemistry and immunoblotting methods were used to detect the expression levels of smad3，smad4 and RUNX2.Results（1）Cells with BMSCs phenotype can be obtained by recovery culturing.（2）After transfection，the green fluorescent protein was found in ZHX3 silence group and vehicle control group.Blank control group showed no significant fluorescence.The expression level of ZHX3 was significantly lower in ZHX3 silence group than that of vehicle control group.（3）Results of immunofluorescence asssay showed that the positive expressions of smad3 and smad4 were located in nucleus and cytoplasm，the positive expression of RUNX2 was mainly located in nucleus.Positive cells were observed in three groups.There was no significant difference in fluorescence intensity between the control group and the vehicle control group，but the fluorescence intensity was significantly lower in ZHX3 gene silence group than that of two control groups.（4）There were no significant differences in expressions of smad3，smad4 and RUNX2 betweem control group and the vehicle control group，but they were significantly higher than those of ZHX3 silence group（P＜0.05）.ConclusionZHX3 gene silence can delay vitro osteogenesis of BMSCs，which may play a role by the down-regulated expression levels of smad3，smad4 and RUNX2.

DNA-binding proteins；zinc fingers；genes，homeobox；transcription factors；gene silencing；mesenchymal stem cells；smad3；smad4；RUNX2；zinc fingers and homeoboxes 3

R392.12

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.004

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10.13418/j.issn.1001-165x.2014.02.014.

國家自然科學基金資助項目（31170930，81202783）

1錦州，遼寧醫學院人體解剖與組織胚胎教研室（郵編121000）；2遼寧省高校分子生物與新藥開發重點實驗室；3遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科；4遼寧醫學院細胞生物學教研室

張苗苗（1989），女，碩士在讀，主要從事骨組織工程方面研究

△通訊作者E-mail:mianyizuhua@aliyun.com