復方甘草酸苷對HaCaT細胞表達IL-2、IL-4的影響

尹翠紅，車雅敏

復方甘草酸苷對HaCaT細胞表達IL-2、IL-4的影響

尹翠紅，車雅敏△

目的觀察復方甘草酸苷（CG）對角質形成細胞株HaCaT細胞增殖的抑制作用及其表達白細胞介素（IL）-2、IL-4的影響，探討CG治療銀屑病的作用機制。方法將培養的HaCaT細胞分為4組：空白對照組（不加CG）；低濃度組（1 mL細胞培養液中加入50 μL CG）；中濃度組（1 mL細胞培養液中加入100 μL CG）；高濃度組（1 mL細胞培養液中加入200 μL CG）。采用噻唑藍（MTT）方法檢測24 h后不同濃度CG對HaCaT細胞增殖的抑制作用；雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分析不同濃度CG處理后的HaCaT細胞上清液中IL-2及IL-4的表達水平。結果低、中、高濃度CG干預HaCaT細胞24 h后均可見到明顯的增殖抑制作用。不同濃度CG干預HaCaT細胞24 h后，低濃度組上清液中IL-2的濃度與空白對照組無明顯差異（ng/L：234.51±17.98 vs 225.31±16.23，P＞0.05）；中、高濃度組的IL-2濃度明顯低于空白對照組及低濃度組，且高濃度組低于中濃度組（ng/L：188.99±19.22 vs 208.49±18.40，P＜0.05）；高濃度組培養上清液中IL-4的濃度較其余3組明顯升高（ng/L：45.67±10.29 vs 37.62±3.90、39.68±6.08、43.85± 10.26，P＜0.05）。結論CG可能是通過調節細胞因子IL-2與IL-4的分泌而抑制皮膚角質形成細胞的增殖。

復方甘草酸苷；HaCaT細胞；白細胞介素-2；白細胞介素-4；細胞增殖

復方甘草酸苷（compound glycyrrhizin，CG）因具有抗炎、抗變態反應、調節免疫、抑制病毒增殖等作用，臨床上一直被廣泛應用于病毒性肝炎、肝硬化等疾病的治療，其療效已被公認［1］。近十幾年來，臨床有報道用CG治療T細胞相關性炎癥性皮膚病，如銀屑病、斑禿、扁平苔蘚等，效果較好［2］，進一步研究發

現CG可降低T細胞群的活性，幫助恢復淋巴細胞功能［3］?，F已證實，T細胞異常活化是導致銀屑病發生的重要因素，在銀屑病皮損和外周血中，Th1細胞因子白細胞介素（IL）-2、腫瘤壞死因子（TNF）-α高表達而Th2細胞因子IL-4、IL-10低表達［4-5］，包括T淋巴細胞、樹突細胞和不同的免疫相關細胞因子的活化形成復雜的細胞因子網絡，促進角質形成細胞的過度增殖。近年研究發現CG可能通過調節IL-8、轉化生長因子（TGF）-β等細胞因子的分泌來達到治療銀屑病的目的［6］。但是，關于CG對Th1、Th2主要細胞因子IL-2、IL-4的作用情況尚不清楚。本研究采用不同濃度CG體外干預HaCaT細胞，通過檢測HaCaT細胞增殖變化及培養上清液中IL-2、IL-4的變化，以期為CG治療銀屑病等免疫性疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器DMEM培養基購自北京賽默飛生物有限公司；PBS、胰酶-EDTA消化酶、胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO）均購自北京索萊寶公司；噻唑藍（MTT）購自美國sigma公司；IL-2、IL-4酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自上海慧穎生物科技有限公司。CG注射液是由甘草甜素、甘氨酸及鹽酸半胱氨酸組成的復方制劑（商品名：美能，SNMC），購自日本米諾發源制藥株氏會社，每2 mL復方制劑中分別含甘草甜素、甘氨酸及鹽酸半胱氨酸分別為4、40及2 mg；人永生角質形成細胞HaCaT細胞株由我科實驗室保存；Synergy MX型酶標儀（美國Bio Tek公司）。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測不同濃度CG對HaCaT細胞增殖活性的影響HaCaT細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM培養液于37℃、5%CO2飽和濕度下貼壁培養。待細胞達到80%融合時進行傳代，傳代時去除培養液，使用PBS潤洗細胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化后，將對數生長期的單細胞懸液以1×104個/mL的密度接種在96孔板上，200 μL/孔，次日細胞貼壁后換培養液培養24 h，分為空白對照組、低濃度組、中濃度組與高濃度組，后3組分別加入不同濃度CG（甘草酸苷體積比分別為0.05、0.1、0.2），繼續培養24 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO，于搖床上輕微振蕩10 min，酶聯免疫儀測定各孔在波長490 nm處光密度（OD）值。

1.2.2 ELISA法檢測不同濃度CG作用HaCaT細胞上清液中IL-2、IL-4的分泌水平取對數生長期的細胞接種于96孔板，加入不同濃度的CG，培養24 h后，收集上清液，離心，采用雙抗夾心ELISA法檢測上清液中IL-2、IL-4水平，嚴格按照試劑盒操作說明進行，建立標準曲線，酶標儀測定450 nm處OD值，根據標準曲線讀取樣品濃度。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件對所得數據進行統計學處理，結果以表示，多組比較用F檢驗，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度CG對HaCaT細胞增殖活性的影響低、中、高濃度CG對HaCaT細胞增殖能力的抑制作用均較空白對照組明顯增強（P＜0.05），見表1。

Tab.1Comparison of proliferation and relative contents of IL-2，IL-4 in HaCaT cells between four groups表1 各組HaCaT細胞增殖活性及IL-2、IL-4相對含量比較（n=10，）

Tab.1Comparison of proliferation and relative contents of IL-2，IL-4 in HaCaT cells between four groups表1 各組HaCaT細胞增殖活性及IL-2、IL-4相對含量比較（n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與低濃度組比較，c與中濃度組比較，P＜0.05

組別空白對照組低濃度組中濃度組高濃度組F O D值0 . 5 0 ± 0 . 0 2 0 . 4 8 ± 0 . 0 2 a 0 . 4 7 ± 0 . 0 3 a 0 . 4 5 ± 0 . 0 3 a 7 . 8 2＊＊I L -2（n g / L）2 3 4 . 5 1 ± 1 7 . 9 8 2 2 5 . 3 1 ± 1 6 . 2 3 2 0 8 . 4 9 ± 1 8 . 4 0 a b 1 8 8 . 9 9 ± 1 9 . 2 2 a b c 1 2 . 4 0＊＊I L -4（n g / L）3 7 . 6 2 ± 3 . 9 0 3 9 . 6 8 ± 6 . 0 8 4 3 . 8 5 ± 1 0 . 2 6 4 5 . 6 7 ± 1 0 . 2 9 a 2 . 8 8＊

2.2 不同濃度CG處理HaCaT細胞對上清液中IL-2、IL-4相對含量的影響低濃度組上清液中IL-2的濃度與空白對照組無明顯差異（P＞0.05）；中、高濃度組IL-2濃度明顯低于空白對照組及低濃度組，且高濃度組低于中濃度組（均P＜0.05）。高濃度組CG作用HaCaT細胞后24 h，培養上清液中IL-4的濃度高于空白對照組（P＜0.05），其余3組間差異均無統計學意義，見表1。

3 討論

CG提純以β體甘草酸為主要成分，輔以甘草酸苷、甘氨酸、半胱氨酸等成分，其化學結構與可的松或醛固酮的類固醇環相似，作用類似于糖皮質激素，但又無糖皮質激素的不良反應，具有藥理作用強、毒性小的優點。研究已證實CG對肝臟類固醇代謝酶△4-5β還原酶有強親和力，阻止可的松和醛固酮的滅活，從而發揮類固醇樣作用，可誘生γ-干擾素（IFN-γ），增強自然殺傷（NK）細胞活性，降低天冬氨酸轉氨酶與丙氨酸轉氨酶，抑制肝細胞變性壞死與肝原纖維增生，促進肝臟膽紅素代謝，提高解毒能力［7］，因此過去的幾十年一直廣泛用于肝損傷相關疾病的治療。后來有些學者發現CG可直接與磷脂酶A2結合，還可作用于花生四烯酸使其產生炎性介質，選擇性阻斷酶的磷酸化，從而抑制前列腺素和白三烯等炎癥介質的產生，抑制補體系統的激活途徑，直接發揮抗炎作用［8］。此外，CG還可活化T細胞，誘導干擾素產生，調節Th1/Th2比值動態平衡，激活

NK細胞，調節T細胞活性，因此臨床上大量應用于T細胞介導的炎癥性皮膚病，如銀屑病、天皰瘡等［3］。大量研究已證實銀屑病是一種多基因遺傳背景下，由多種免疫相關性細胞、細胞因子、炎癥介質相互作用的免疫相關性疾??；以角質形成細胞過度增殖和異常分化及炎性細胞浸潤為主要特征［9］。銀屑病受累皮損的發生、發展和活化T細胞的歸巢受體表達有關，它可以促進活化T細胞向皮膚遷移［10］，在銀屑病皮膚受損處受到了活化T細胞及其釋放的細胞因子網的復雜作用，包括IFN-γ、TNF-α、細胞因子（IL-1、IL-2、IL-6等）與多種趨化因子水平的升高［11］，共同影響角質形成細胞的增殖狀態。為研究CG治療銀屑病的作用機制，張汝芝等［12］用不同濃度CG作用于體外培養的角質形成細胞，發現50～200 μL/mL濃度的CG抑制HaCaT細胞增殖的同時，促進角質形成細胞表達CXCR2和TGF-β1分泌。郭波等［13］研究CG對HaCaT細胞表達AQP3的影響，結果發現62.5～125 μL/mL CG可抑制HaCaT細胞生長，同時促進HaCaT細胞表達AQP3。宋璐璐［14］探討CG對體外銀屑病皮損模型的作用及機制，結果顯示CG可以減少銀屑病皮損組織細胞IL-17的含量，同時增加IL-10的含量。銀屑病患者Th1細胞的細胞因子（IL-2、TNF-α、IL-8等）升高導致Th1/Th2細胞因子失衡，因此多數學者認為，銀屑病是Th1細胞為主的免疫性疾病。其中IL-2是重要的促炎癥性細胞因子，能促進Th1型的免疫反應，其可以通過與IL-2受體的結合，活化T細胞，促進角質形成細胞增殖，產生炎癥級聯反應而加重銀屑病。它亦能增強細胞毒性T細胞的細胞毒活性，誘導IL-2受體表達，促進細胞移動，增強細胞間的接觸和誘導細胞分泌細胞因子。IL-4是Th2型細胞主要的細胞因子，是一種免疫負調節因子，可抑制微環境中的Th1細胞及其細胞因子IL-22、IFN-γ等，誘導免疫耐受的作用［15］。但國內外尚鮮見CG對HaCaT細胞分泌IL-2、IL-4影響的報道。本實驗通過不同濃度CG體外干預HaCaT細胞后檢測上清液IL-2、IL-4的分泌水平，結果發現低至高濃度CG對HaCaT細胞相對活性有一定影響，抑制角質形成細胞的增殖，并且隨著藥物濃度的增加，細胞的相對活性逐漸降低，抑制作用更明顯；在檢測濃度范圍內，隨著濃度的增加，IL-2分泌量明顯降低，IL-4分泌量逐漸升高。結合CG的藥理作用，筆者推測CG治療銀屑病的作用機制是通過調節作用于活化T細胞分泌的細胞因子，主要是調節Th1型細胞因子的分泌來糾正外周血Th1/Th2平衡失調，減少炎癥介質釋放，達到改善銀屑病癥狀的效果。

細胞因子在銀屑病的發生、發展過程中具有重要的作用，抑制某些細胞因子的合成或阻斷其生物活性是生物制劑治療銀屑病的重要研究內容。由于我們的工作僅限于CG對角質形成細胞部分細胞因子影響的研究，至于各細胞因子之間、角質形成細胞與T細胞之間的相互影響和相互作用機制，還需要進一步全面、系統地探討。

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（2015-04-01收稿 2015-06-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects of glycyrrhizin on the expressions of IL-2 and IL-4 in HaCaT cells

YIN Cuihong，CHE Yamin△
Department of Dermatology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China△

ObjectiveTo observe the effect of glycyrrhizin（CG）on the proliferation and the expressions of interleukin（IL）-2，IL-4 in human keratinocytes cell line HaCaT cells，and to investigate the therapeutic mechanism of CG in the patients with psoriasis.MethodsThe HaCaT cells were divided into four groups:blank group（without CG），low concentration group（50 μL CG/mL cell supernatant），medium concentration group（100 μL CG/mL cell supernatant）and high concentration group（200 μL CG/mL cell supernatant）.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate the proliferation of HaCaT cells that were treated with CG at different concentrations respectively for 24 hours.The contents of IL-2 and IL-4 in HaCaT cells were examined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsCompared with the blank group，there were obviously inhibitory effects in the proliferation of HaCaT cells treated by low，medium and high concentrations of CG for 24 hours.There was no significant difference in IL-2 level between low concentration CG group and blank group（ng/L：234.51±17.98 vs 225.31±16.23，P＞0.05）.After 24 hours of intervention with CG of medium and high concentrations，the expression levels of IL-2 was significantly lower in HaCaT cells than that in blank group and low concentration group.The IL-2 level was significantly lower in high concentration group than that in medium concentration group（ng/L: 188.99±19.22 vs 208.49±18.40，P＜0.05）.At the same condition，the secretion of IL-4 in HaCaT cells was significantly upregulated in high concentration group than that in other three groups（ng/L:45.67±10.29 vs 37.62±3.90，39.68±6.08，43.85± 10.26，P＜0.05）.ConclusionGlycyrrhizin may suppress the proliferation of human skin keratinocytes by regulating secretion of cytokines IL-2 and IL-4.

compound glycyrrhizin；HaCaT cell；interleukin-2；interleukin-4；cell proliferation

R751

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.005

中華醫學會皮膚性病學分會美能皮膚病學研究基金（SNMC-201201）

天津醫科大學總醫院皮膚科（郵編300052）

尹翠紅（1981），女，碩士在讀，主要從事銀屑病的發病機制與治療的研究

△通訊作者E-mail：lily_alan@sohu.com