曲美他嗪降低大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷的研究

王騰飛，楊濤，張威，方振宇，王洪海，劉蕾，張海明，王玉亮

曲美他嗪降低大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷的研究

王騰飛1，楊濤2△，張威2，方振宇2，王洪海2，劉蕾2，張海明2，王玉亮3

目的探討曲美他嗪（TMZ）對自體肝移植大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷的保護作用。方法30只Wistar大鼠喂食高脂飼料誘導脂肪肝模型后，隨機分為假手術（Sham）組、模型（Model）組和TMZ組，每組10只。采用脂肪肝大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷模型，于再灌注6 h后取材，分別觀察血漿丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、肝組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平以及肝組織病理情況。Western blot法檢測肝組織Bcl-2、Caspase-3的表達水平；TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況。結果術后6 h，與Model組相比，TMZ組血漿ALT、AST、肝組織MDA含量明顯降低（P＜0.05），肝組織SOD含量增高（P＜0.05）。TMZ組肝組織中Bcl-2的表達水平明顯高于Model組，而活化的Caspase-3的水平明顯降低（P＜0.05）。肝組織HE染色及TUNEL顯示TMZ組肝細胞水腫、肝竇狹窄及肝細胞凋亡明顯輕于Model組。結論在缺血再灌注時，TMZ減少氧化應激，促進Bcl-2表達，抑制Caspase-3的活化，減少肝細胞凋亡，對大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷起保護作用。

曲美他嗪；脂肪肝；再灌注損傷；細胞凋亡；bcl-2相關X蛋白質；丙氨酸轉氨酶；天冬氨酸氨基轉移酶類；丙二醛；超氧化物歧化酶；caspase-3

我國每年實施肝移植手術約2 000例，而需要肝移植救助的患者數量遠高于此，供肝的相對短缺限制了器官移植的發展［1］。因此，擴大供體來源如脂肪肝應用的研究成為熱點。與正常肝臟相比，脂肪肝對缺血再灌注損傷（IRI）的耐受更差，移植后發生原發性肝無功能的危險更大［2］。大量的臨床及實驗研究顯示，曲美他嗪（Trimetazidine，TMZ）能夠通過降低微循環阻力、維持細胞內環境穩定、優化能量代

謝、抑制氧化應激等多種途徑減輕心肌、腦、腎臟缺血再灌注時實質細胞凋亡及壞死水平，對心肌、腦、腎臟有保護作用［3-5］。本實驗通過向肝臟保存液中添加TMZ預處理，探討TMZ在大鼠脂肪肝IRI中的保護作用，為臨床安全有效利用脂肪肝進行肝移植提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及飼料清潔級健康Wistar大鼠30只，雄性，鼠齡10～12周，體質量（200±10）g，軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-（軍）2012-0004；飼料為缺乏膽堿和蛋氨酸（CMDD）飼料［6］（軍事醫學科學院實驗動物中心提供）。

1.1.2 藥品和試劑UW（the University of Wisconsin solution）液購自美國ViaSpan；TMZ購自美國Sigma公司；丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）測試盒購自南京建成生物研究所；兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體、兔抗鼠β-actin多克隆抗體購自北京中山生物技術公司產品。

1.2 方法

1.2.1 脂肪肝模型的建立30只Wistar大鼠，CMDD飼料喂養14 d后經病理驗證，均出現中度脂肪肝變性。脂肪肝病理診斷標準［7］：脂肪變性的肝細胞＜30%為輕度脂肪肝，脂肪變性的肝細胞＞60%為重度脂肪肝，介于兩者之間的為中度脂肪肝。

1.2.2 缺血再灌注模型的建立30只大鼠術前禁食12 h，不禁水。水合氯醛麻醉成功后取腹部正中切口，暴露劍突后，用血管鉗鉗夾拉開腹壁，并用裁剪合適的濕紗布保護腸管。游離右腎上腺靜脈，不予結扎、切斷，然后依次游離肝下下腔靜脈（下腔靜脈位于肝與右腎靜脈之間的一段）、肝動脈、門靜脈、肝上下腔靜脈（下腔靜脈位于肝與膈肌之間的一段），肝動脈和膽管一同游離。分別在肝動脈、腸系膜上靜脈與脾靜脈匯合處和肝下下腔靜脈與右腎靜脈匯合處上微血管夾，用4號針頭刺入門靜脈，勻速緩慢打入肝素鹽水（30 U/mL）2 mL，使肝內血液進入體循環。開始灌注前，分別在肝上及肝下下腔靜脈上微血管夾，注意鉗夾肝上下腔靜脈時盡量少鉗夾膈肌，以免造成呼吸運動障礙；并在肝下下腔靜脈血管夾上方靜脈壁剪開約1 mm作灌注液流出道。以1.5 mL/min的速度經門靜脈穿刺處緩慢持續灌注UW液，使肝全部變為土黃色、流出液清亮示灌注充分，灌注的同時用4℃生理鹽水給肝臟表面物理降溫。灌注完畢前1 min更換乳酸林格液灌注沖凈肝臟中的UW液，灌注完畢后拔出穿刺針，用8-0血管線修補穿刺點和肝下下腔靜脈流出道，檢查確認修補成功后，松開各處微血管夾，結束無肝期，整個缺血過程為30 min，然后逐層關閉腹腔。

1.2.3 動物分組脂肪肝模型建立成功后，采用隨機數字表法將30只大鼠隨機分為3組，每組10只。假手術（Sham）組：麻醉后開腹，分離肝周組織后關腹，不進行IRI處理。模型（Model）組：采用IRI模型，灌洗液為UW液。TMZ組：采用IRI模型，灌洗液為添加了TMZ（TMZ濃度為10-6mol/L［8］）的UW液。

1.2.4 標本處理及病理學檢查再灌注6 h后，從肝下下腔靜脈取血5 mL，靜置30 min后，于常溫下3 000 r/min離心10 min，提取血清，置于-80℃冰箱保存。每只大鼠在肝臟左葉和尾葉的固定部位取2塊組織，其中1塊修剪成約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小置于4%中性甲醛固定，另1塊迅速置于凍存管中液氮速凍，之后-80℃冰箱保存備用。

1.2.5 指標檢測（1）肝功能指標：取保存的血清1 mL用全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）。（2）氧化損傷指標：取肝組織做10%的肝組織勻漿。采用硫代巴比妥法測量肝組織MDA含量；黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量。（3）肝組織病理學檢查：肝組織甲醛固定24 h后，常規石蠟包埋，連續4 μm厚切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察肝組織形態學變化。（4）肝細胞凋亡檢測：采用免疫熒光法。取4%甲醛溶液固定后的肝組織，石蠟包埋、切片，按試劑盒說明操作。每張切片隨機取5個高倍鏡下視野（×400），計算凋亡細胞與正常細胞比例，即凋亡指數（AI），取其平均值。（5）Bcl-2和Caspase-3表達的檢測：用Western blot法檢測，取-80℃保存的肝組織約100 mg，勻漿、離心，取上清液測定蛋白質濃度。進行SDS-PAGE，轉膜后封閉液封閉過夜，加入適當濃度的一抗、二抗，進行增強化學發光（ECL）顯色，觀察Bcl-2和Caspase-3蛋白條帶的表達情況。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差表示，采用One-way ANOVA分析，組間多重比較采用LSD（方差齊）或Dunnett（方差不齊）法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺血再灌注6 h后血清ALT、AST及肝組織SOD、MDA含量的測定與Sham組相比，Model組ALT、AST含量明顯增高。TMZ組與Model組相比，這一增高趨勢明顯受到抑制（均P＜0.05）。Model組和TMZ組肝組織SOD含量較Sham組明顯降低。與Model組比較，TMZ組肝組織SOD水平升高（P＜0.05）。Model組和TMZ組肝組織MDA含量較Sham組明顯升高；與Model組比較，TMZ組肝組織MDA水平降低（P＜0.05）。見表1。

Tab.1Comparison of serum ALT，AST，SOD and MDA in liver tissues between three groups表1 各組血漿ALT、AST及肝組織SOD、MDA水平的比較（n=10）

Tab.1Comparison of serum ALT，AST，SOD and MDA in liver tissues between three groups表1 各組血漿ALT、AST及肝組織SOD、MDA水平的比較（n=10）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，P＜0.05

組別S h a m組M o d e l組T M Z組F M D A（μ m o l / g）1 . 8 0 ± 0 . 3 1 2 . 3 8 ± 0 . 3 2a2 . 0 9 ± 0 . 2 0ab9 . 4 5 7＊＊A L T（U / L）9 2 . 6 8 ± 2 9 . 6 2 5 1 1 . 8 0 ± 1 5 6 . 5 0a2 7 7 . 3 0 ± 4 5 . 6 2ab2 8 . 9 2 9＊＊A S T（U / L）3 4 . 9 0 ± 1 1 . 5 3 5 8 1 . 1 0 ± 9 3 . 4 3a4 4 5 . 7 8 ± 7 2 . 1 4ab1 0 3 . 5 3 2＊＊S O D（U / m g）4 9 . 0 1 ± 5 . 8 8 3 8 . 1 8 ± 3 . 7 7a4 2 . 0 6 ± 4 . 1 7ab1 2 . 3 9 5＊＊

2.2 缺血再灌注6 h后肝臟組織病理學變化Sham組肝細胞腫大，細胞內充滿大小不等的脂肪空泡，肝竇被擠壓變窄。缺血再灌注6 h后Model組可見肝組織結構紊亂，肝細胞腫脹變性，肝竇狹窄更加明顯，并伴有肝細胞凋亡。TMZ組上述情況明顯減輕。見圖1。

2.3 缺血再灌注6 h后肝細胞凋亡情況光鏡下觀察，Sham組大鼠肝細胞僅有少許凋亡，Model組及TMZ組肝細胞凋亡明顯增加，見圖2。Sham組、Model組及TMZ組AI分別為（6.7±2.1）%、（36.6± 7.3）%、（23.0±5.2）%，Model組高于Sham組，TMZ組低于Model組，但高于Sham組。

2.4 缺血再灌注6 h后Bcl-2和Caspase-3表達情況Model組和TMZ組肝組織Bcl-2表達較Sham組明顯降低；與Model組比較，TMZ組肝組織Bcl-2表達增高。Model組肝組織Caspase-3表達較Sham組明顯增高；與Model組比較，TMZ組Caspase-3表達降低；TMZ組與Sham組差異無統計學意義。見圖3。

Fig.3Comparison of the expression levels of Bcl-2 and Caspase-3 between three groups圖3 各組Bcl-2、Caspase-3表達水平的比較

Fig.2Comparison of hepatocellular apoptosis between three groups（TUNEL，×400）圖2 各組肝細胞凋亡情況的比較（TUNEL，×400）

3 討論

3.1 脂肪肝等邊緣供肝的臨床應用肝移植是挽救終末期肝病患者安全且有效的手段。但供肝相對短缺已成為阻礙此類肝功能衰竭患者獲得肝移植治療的瓶頸。因此，越來越多的邊緣供肝被用于臨床，如高齡供肝、脂肪肝供肝等。脂肪肝由于存在微循環損害、脂質過氧化增加以及能量代謝障礙等因素，對缺血再灌注損傷更敏感，移植后易出現原發性移植物無功能及早期移植物功能延遲恢復。

3.2 TMZ對減輕脂肪肝IRI的作用肝臟缺血再灌注損傷的機制十分復雜，涉及到氧自由基、鈣超載和細胞凋亡等。缺血再灌注過程中，肝臟通過產生氧自由基，引發脂質過氧化反應，損傷肝細胞。氧自由基清除劑SOD及脂質過氧化代謝產物MDA是目前公認的能較好反映體內氧自由基水平及脂質過氧化損傷程度的指標［9］。本實驗肝臟缺血再灌注6 h

后，Model組和TMZ組肝功能指標均明顯升高，而TMZ組同Model組相比，肝功能指標明顯好轉，肝組織MDA水平低、SOD含量高；HE染色也顯示TMZ組肝細胞水腫、肝竇淤血輕于Model組。因此，筆者認為缺血再灌注時，可通過激活體內氧化系統、抑制抗氧化系統，增加脂質過氧化反應，損傷肝細胞。而灌注添加了TMZ的UW液能拮抗這一過程，明顯降低脂質過氧化的程度，對脂肪肝缺血再灌注損傷起到保護作用。

3.3 TMZ對再灌注后肝細胞凋亡的作用本實驗再灌注后，Model組及TMZ組血清AST含量急劇升高，AST是一種線粒體酶，主要存在于線粒體內，血清AST升高提示肝臟線粒體功能受損。另外，脂肪肝缺血再灌注后氧化應激增加也可歸因于線粒體功能的損傷［10］。線粒體功能受損時，線粒體膜腫脹，膜通透性增高，使位于線粒體內的促凋亡分子如細胞色素C（Cyto-c）、凋亡誘導因子（AIF）、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）等的釋放，啟動細胞凋亡機制［11］。細胞凋亡過程受多種基因的調控，其中最重要的是Bcl-2、Caspase-3。Caspase-3是細胞凋亡的最終執行者，一旦被激活，即激發下游的級聯反應，啟動細胞凋亡［12］。而Bcl-2是肝臟缺血再灌注時最重要的抑制肝細胞凋亡的基因［13］。因此本實驗選取再灌注后肝臟標本測其Bcl-2、Caspase-3水平及肝細胞凋亡情況，結果顯示，再灌注后，Bcl-2表達下調，而活化的Caspase-3增加，肝細胞凋亡增多，提示肝臟缺血再灌注過程誘發了肝細胞凋亡；給予TMZ預處理后，Bcl-2的表達上調，Caspase-3的表達下調，可以抑制肝細胞的凋亡，肝組織TUNEL也證實這一結果。因此我們認為TMZ改善脂肪肝缺血再灌注損傷的機制可能與上調Bcl-2、抑制Cyto-c釋放、抑制Caspase-3活化，減少肝細胞凋亡有關。

3.4 TMZ對再灌注后肝細胞損傷的保護作用綜上所述，添加TMZ改良肝臟灌注保存液，通過移植前對脂肪肝預處理，可以減輕脂肪肝的缺血再灌注損傷，并有可能促進移植后肝臟功能的恢復，降低移植術后原發性移植物無功能及早期移植物功能延遲恢復的發生率，為臨床擴大供體器官來源、安全有效地利用邊緣供肝提供了參考方法。

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（2015-08-03收稿 2015-08-21修回）

（本文編輯 李鵬）

Protective effects of Trimetazidine on ischemia-reperfusion injury of fatty liver in rats

WANG Tengfei1，YANG Tao2△，ZHANG Wei2，FANG Zhenyu2，WANG Honghai2，LIU Lei2，ZHANG Haiming2，
WANG Yuliang31 First Central Clinical College of Tianjin Medical University，Tianjin 300192，China；2 Tianjin First Central Hospital；3 Key Laboratory for Critical Care Medicine of the Ministry of Health△

ObjectiveTo investigate the protective effects of Trimetazidine（TMZ）on the ischemia reperfusion injury（IRI）of fatty liver in autotransplantation model.MethodsFatty liver model was established by feeding high fat diet.Male Wistar rats（n=30）were randomized into three groups；Sham group，TMZ group and Model group.Liver was autotransplanted in both TMZ group and Model group.Serum levels of ALT，SOD，MDA，Bcl-2 and activated Caspase-3 were assessed 6 hours after the operation.The pathological performances of liver were also determined.ResultsCompared with the Model group，serum levels of ALT，AST，MDA and SOD levels decreased significantly in the TMZ group（P＜0.05）.Serum level of Bcl-2 was higher while level of activated Caspase-3 was lower in TMZ group than those in Model group（P＜0.05）.Histological assay and TUNEL staining showed reduced hepatocyte swelling and narrowed sinusoid as well as decreased hepatic apoptosis in TMZ group compared with Model group.ConclusionTMZ can reduce oxidative stress，promote the expression of Bcl-2 and inhibit the activation of Caspase-3，which all contribute to its protective effect on fatty liver with ischemia-reperfusion injury.

Trimetazidine；fatty liver；reperfusion injury；apoptosis；bcl-2-associated X protein；alanine transaminase；aspartate aminotransferases；malondialdehyde；superoxide dismutase；caspase-3

R617

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.010

天津市衛生局科技基金資助項目（2011KZ30）；衛生公益性行業科研專項（201302009）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2012AA021001）；國家自然科學基金資助項目（81270554）

1天津醫科大學一中心臨床學院（郵編300192）；2天津市第一中心醫院器官移植中心；3衛生部危重病急救醫學重點實驗室

王騰飛（1988），男，碩士研究生在讀，主要從事肝移植及肝膽外科研究

△通訊作者E-mail：yangtao5588@medmail.com.cn