CEUS定量分析L-NAME致兔高血壓性腎損傷的實驗研究

孟祥鹿，張國慧，王文紅，邵紅，郭君，趙效新，顧程，張曉丹

CEUS定量分析L-NAME致兔高血壓性腎損傷的實驗研究

孟祥鹿1，2，張國慧3，王文紅2△，邵紅2，郭君3，趙效新1，2，顧程1，2，張曉丹4

目的應用超聲造影（CEUS）定量評價一氧化氮合成酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）致兔高血壓腎損傷后腎皮質的血流灌注變化。方法建立L-NAME致兔高血壓腎損傷模型，分別于給藥前及給藥后第2、4、6、8周行CEUS檢查及血清胱抑素C（CysC）等生化檢查，將所獲得的時間-強度曲線（TIC）曲線下面積（AUC）等相關參數進行定量分析，并將AUC與血清CysC進行相關性分析。結果兔血清CysC在給藥6周后明顯升高，明顯早于血肌酐（Scr）及血尿素氮（BUN）。給藥后AUC先減小后增大，開始增強時間（RT）延長，峰值強度（PI）減低，平均通過時間（MTT）、峰值減半時間（HPT）及達峰時間（TTP）延長。CEUS所得AUC與血清CysC呈顯著正相關（r= 0.950，P＜0.001）。結論L-NAME致兔高血壓腎損傷模型操作簡單、可重復性好，可用于對高血壓腎損傷臨床前期及臨床期的藥物實驗研究。CEUS結合血清CysC可作為臨床評價高血壓腎損傷患者腎功能異常的良好檢查方法。

高血壓；NG-硝基精氨酸甲酯；兔；高血壓腎損傷；超聲造影；血清胱抑素C；腎血流灌注

長期高血壓將致腎小球長期處于高灌注、高濾過狀態，腎小球濾過膜受損，系膜細胞增殖硬化，局部腎小球及腎小管缺血，直至腎功能損傷，最終導致終末期腎病。因此，及時了解高血壓腎損傷患者不同階段的腎血流灌注異常對臨床醫師根據病程進展及早制定治療方案、準確評估預后有重要意義［1］。本

研究應用超聲造影（contrast-enhanced sonography，CEUS）定量分析大劑量一氧化氮合成酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginin methylester，L-NAME）致兔高血壓腎損傷不同階段的腎血流灌注異常，以期為臨床前期研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料天津醫科大學實驗動物中心提供的新西蘭大白兔11只，質量1.5～2.0 kg，周齡相同，均為雌性（符合國家動物保護協會相關規定）。將L-NAME（美國Sigma公司）溶于15 mL 0.9%NaCl中，按每天每只兔150 mg/kg灌胃，持續8周。灌胃前、灌胃后第2、4、6、8周抽血檢測血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、血清胱抑素C（CysC），并在24 h內行CEUS檢查。并于上述5個時間點，各處死1只兔子，取雙側腎臟送病理檢查。模型建立成功表現為給藥8周后兔血清CysC及收縮壓明顯升高。

1.2 檢查方法采用Philips iU22彩色超聲診斷儀、L12-5高頻超聲探頭。實驗前去除兔腎區體毛，用灰階二維超聲觀察兔腎位置并作標記，用鹽酸氯胺酮（50 mg/kg）及咪達唑侖注射液（1.0 mg/kg）肌內注射麻醉并將其固定，經耳緣靜脈團注超聲造影劑SonoVue混懸液（0.1 mg/kg），同時啟動內置計時器，觀察3 min內一側腎皮質回聲變化，并進行自動序列采集。至少間隔約20 min后，再次注入SonoVue混懸液（0.1 mg/kg），觀察另一側腎臟（諧波發射頻率15 Hz，機械指數0.07，增益90%，聚焦深度3～4 cm）。用Q-LAB軟件進行定量分析，將感興趣區域（region of interest，ROI）置于腎臟中部外側皮質，避開粗大血管，觀察其內各像素及造影劑微泡回聲量的變化。獲得時間-強度曲線（time-intensity curve，TIC）及腎臟血流灌注的相關參數，包括曲線下面積（area under curve，AUC）、達峰時間（time to peak，TTP）、峰值強度（peak intensity，PI）、平均通過時間（mean transit time，MTT）、開始增強時間（rise time，RT）、峰值減半時間（time from peak to one half，HPT）。由2名有經驗的超聲診斷醫師采用雙盲法進行定量分析，取2次檢查結果的平均值。

1.3 統計學方法數據分析用SPSS 17.0軟件包完成，計量資料用均數±標準差表示。給藥后各時間點與給藥前兔腎皮質TIC相關參數間比較采用配對資料t檢驗。兔腎皮質AUC與血清CysC的相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 給藥前、后各時間點兔腎皮質TIC相關參數的比較與給藥前相比，RT在給藥后第2周、第8周延長（P＜0.01）；AUC在給藥后第2周、第4周降低，6周后明顯增高，且第6周、第8周與給藥前相比差異均有統計學意義（P＜0.01）；PI在給藥后第6周、第8周下降（P＜0.01）；MTT在給藥后第4周開始延長（P＜0.05或P＜0.01）；HPT于給藥后第2周延長（P＜0.01）；TTP于給藥后第2周逐漸延長，除第4周外，其余各時間點與給藥前相比差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1TIC and HE staining of left renal cortex of rabbits before and after injecting L-NAME圖1 給藥前、后兔左腎皮質TIC和HE染色

Tab.1TIC parameters in renal cortex of rabbits before and after injecting L-NAME表1 給藥前、后兔腎皮質TIC曲線各時間點相關參數比較

Tab.1TIC parameters in renal cortex of rabbits before and after injecting L-NAME表1 給藥前、后兔腎皮質TIC曲線各時間點相關參數比較

t2、t4、t6、t8：分別為給藥后第2、4、6、8周與給藥前比較；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表2同

組別給藥前給藥后t 2 t 4 t 6 t 8 T T P（s）7 . 7 2 3 ± 1 . 9 1 8 8 . 7 2 0 ± 1 . 4 0 8 8 . 5 1 5 ± 2 . 9 7 9 1 1 . 0 3 2 ± 2 . 5 7 6 1 1 . 2 3 7 ± 2 . 5 0 2 2 . 3 5 7＊2 . 1 7 5 7 . 0 4 9＊＊7 . 9 3 1＊＊第2周第4周第6周第8周n（腎數）1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 R T（s）1 . 2 3 7 ± 0 . 5 0 8 2 . 2 7 3 ± 0 . 3 2 4 1 . 7 2 0 ± 0 . 3 0 5 1 . 8 8 3 ± 0 . 4 8 4 3 . 4 4 2 ± 0 . 8 6 4 6 . 7 3 0＊＊1 . 8 4 5 1 . 9 1 5 8 . 8 6 4＊＊A U C（d B · s）3 6 9 . 0 8 7 ± 1 2 9 . 5 1 3 5 4 . 7 6 3 ± 8 6 . 2 0 2 3 3 4 . 8 3 0 ± 9 0 . 5 3 7 3 9 7 . 8 5 7 ± 4 3 . 2 0 0 4 7 2 . 6 6 7 ± 5 4 . 4 5 7 0 . 6 4 8 1 . 7 5 8 3 . 1 6 1＊＊5 . 3 0 1＊＊P I（d B）1 0 . 3 5 1 ± 3 . 7 9 7 9 . 9 3 8 ± 2 . 9 6 1 8 . 5 9 1 ± 2 . 7 5 8 7 . 5 8 8 ± 2 . 7 8 2 6 . 8 5 0 ± 2 . 7 0 9 0 . 5 2 2 2 . 1 3 1 4 . 3 9 4＊＊5 . 1 2 0＊＊M T T（s）1 5 . 1 0 3 ± 4 . 7 1 6 1 8 . 7 7 5 ± 3 . 8 9 4 1 9 . 7 9 2 ± 5 . 9 5 8 2 3 . 8 8 5 ± 5 . 4 9 2 2 8 . 6 3 2 ± 9 . 4 8 8 1 . 6 4 9 2 . 3 9 2＊4 . 6 7 1＊＊5 . 3 3 6＊＊H P T（s）1 4 . 9 7 7 ± 3 . 7 2 2 2 9 . 4 4 3 ± 6 . 6 3 8 2 2 . 8 4 8 ± 5 . 2 3 1 2 1 . 3 4 0 ± 4 . 9 2 5 2 0 . 8 2 3 ± 2 . 8 0 2 5 . 5 6 7＊＊3 . 4 2 5＊＊2 . 6 7 6＊2 . 5 0 6＊

2.2 給藥前、后各時間點兔血Scr、BUN及CysC的比較與給藥前相比，給藥后各時間點，兔血BUN均無明顯改變，差異無統計學意義；兔血Scr于給藥后第8周升高（P＜0.05）；兔血清CysC自給藥后第6周即明顯升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2Comparison of BUN，Scr and CysC of rabbits before and after injecting L-NAME表2 給藥前、后各時間點兔血BUN、Scr及CysC比較

Tab.2Comparison of BUN，Scr and CysC of rabbits before and after injecting L-NAME表2 給藥前、后各時間點兔血BUN、Scr及CysC比較

B U N（m m o l / L）8 . 2 2 5 ± 1 . 7 7 9 7 . 3 6 2 ± 3 . 6 0 8 8 . 2 4 3 ± 0 . 9 3 4 8 . 7 4 2 ± 0 . 8 7 6 9 . 5 4 7 ± 0 . 5 9 0 0 . 7 2 3 0 . 0 2 6 0 . 4 1 7 1 . 7 8 8組別給藥前n（兔只數）給藥后t 2 t 4 t 6 t 8第2周第4周第6周第8周6 6 6 6 6 S c r（μ m o l / L）5 0 . 6 6 7 ± 4 . 6 3 2 4 9 . 3 3 3 ± 6 . 6 2 3 5 4 . 8 3 3 ± 4 . 6 2 2 6 3 . 1 6 7 ± 9 . 5 1 7 6 9 . 1 6 7 ± 7 . 6 7 9 0 . 2 1 6 2 . 0 8 8 2 . 1 5 7 3 . 0 8 3＊C y s C（μ g / L）1 . 2 0 4 ± 0 . 1 1 8 1 . 2 1 8 ± 0 . 1 1 8 1 . 2 3 1 ± 0 . 1 7 7 1 . 3 0 9 ± 0 . 1 3 3 1 . 4 6 1 ± 0 . 0 8 6 0 . 3 4 3 1 . 5 0 4 2 . 6 2 9＊5 . 0 4 8＊＊

2.3 給藥前、后各時間點兔腎皮質AUC與血清CysC相關性分析給藥前、后各時間點兔左腎皮質AUC平均為（383.241±53.280）dB·s，血清CysC平均為（1.285±0.107）μg/L，腎皮質AUC與血清CysC呈正相關（r=0.950，P＜0.001）。

3 討論

腎臟是高血壓最常損傷的靶器官之一，長期高血壓會導致腎臟小動脈損傷，這種腎微血管的損傷會造成腎血流灌注下降，且隨腎臟受損程度加重，腎血流減少更加明顯，而持續性腎缺血性改變最終會導致腎衰竭。因此，早期發現、準確評估高血壓腎損傷對臨床及時采取防治措施、延緩病情進展有重要的臨床意義［2］。國內外文獻有利用L-NAME建立動物高血壓腎損傷模型的報道［3-4］。L-NAME是腎功能介質一氧化氮合成酶的選擇性抑制劑，可造成一氧化氮缺乏性血壓升高，且具有劑量依賴性。本研究顯示連續大劑量給予L-NAME，可成功建立兔高血壓腎損傷模型，操作簡單、狀態穩定、具有可重復性，且能與不同程度腎損傷的病理改變相對照，有助于臨床動態觀察及評估腎臟損傷程度，對腎灌注異常病變臨床前期及臨床期的藥物實驗研究有重要意義。

CEUS是近年來迅速發展的一項評價微循環及組織灌注情況的新技術［5］。腎臟豐富的血供及特殊的微血管分布模式為CEUS提供了非常有利的條件。常規超聲檢查雖可清晰顯示腎臟的解剖結構及形態變化，但無法評估腎功能異常。CEUS所用造影劑為血池造影劑，正常情況下不會進入組織細胞間隙，只隨血液分布到全身各組織器官，能夠清晰顯示腎臟的血供情況［5］。CEUS通過接收造影劑微泡產生的諧波信號，實時動態觀察腎血流灌注，特別是分側腎的血流灌注異常，并能定量分析腎組織的血流動力學變化［6-7］。董怡等［7］對41例早期腎功能損傷患者行CEUS定量分析，結果顯示CEUS能敏感地評價腎臟血流動力學的改變，提示腎功能的早期損傷，并可以分別衡量左、右側腎的灌注情況。Ma等［8］對23例糖尿病腎損傷患者的研究發現，CEUS可實時、動態、準確評估患者腎微循環灌注，PI、TTP和AUC等參數對早期腎損傷的診斷有重要意義。本研究顯示給藥后第6周PI下降，MTT、HPT和TTP延長，AUC明顯增加，說明CEUS檢查對腎血流灌注的早期變化靈敏度較高，與文獻報道一致［7-8］。

國內外研究報道血清CysC是反映腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）早期變化的特異性標志物［9］，其水平不受年齡、性別、飲食、藥物、肝臟疾

病等因素干擾。當腎功能早期損傷時，GFR下降，血清CysC隨之升高［10］。本研究顯示CEUS檢查所得AUC和血清CysC呈正相關，給藥后第6周，AUC增加，血清CysC顯著增高，較BUN和Scr敏感，可以反映腎臟早期損傷后腎功能的改變。血清CysC檢測方法簡便、費用低，缺點是其無法觀察并評估腎形態學改變及分側腎功能變化。單光子發射體層成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）腎動態顯像是目前臨床上評估雙腎及分側腎GFR的首選檢查方法，不僅可以計算出雙腎及分側腎的GFR，還可以獲得其灌注曲線和功能曲線，相對直觀地觀察雙腎的形態、大小、血流灌注及排泄等情況［11］。但其圖像分辨率較低，難以清晰顯示腎臟皮、髓質等解剖細節，存在一定的放射性污染和腎毒性，費用相對較高，臨床應用受到一定限制。

CEUS可用于定量評估高血壓早期腎功能，特別是分側腎功能的變化，操作簡單、費用低廉、能清晰顯示腎實質內的微小血管，不存在放射性污染和腎毒性，易于隨訪，特別是對于糖尿病腎損傷、高血壓腎損傷等慢性腎臟疾病患者，具有重要的臨床意義［12］。但是CEUS也有其自身的局限性。首先，CEUS選取的研究對象是一個切面，不能完全代表整個腎臟的血流情況，且會隨患者的呼吸運動發生細微變化，可能會使分析結果存在一定誤差；其次，心動周期對患者腎臟血流灌注的影響亦會對所測參數造成一定影響［8］。

綜上所述，CEUS結合血清CysC可作為評價高血壓腎損傷患者腎臟血流灌注及濾過的重要指標，是一種檢測高血壓早期腎損傷的可靠方法。

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（2015-06-02收稿 2015-08-20修回）

（本文編輯 李國琪）

Quantitative analysis of renal injury using CEUS in hypertensive rabbits model induced by L-NAME

MENG Xianglu1，2，ZHANG Guohui3，WANG Wenhong2△，SHAO Hong2，GUO Jun3，ZHAO Xiaoxin1，2，GU Cheng1，2，
ZHANG Xiaodan41 Tianjin Medical University Graduate School，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Union Medicine Centre；3 Ultrasound Department，Aero Space Center Hospital；4 Ultrasound Department，Affiliated Hospital of Hebei Medical University△

ObjectiveTo assess the value of contrast-enhanced ultrasound（CEUS）on quantitative analysis of renal cortex perfusion in hypertensive rabbits model.MethodsHypertensive rabbit modal（n=10）were established by injecting N-nitro-L-arginin methylester（L-NAME）.CEUS and Cystatin C（CysC）serum level analysis were performed at different time points:before and the 2nd，4th，6thand 8thweek after injecting L-NAME.Time-intensity curve and area under curve（AUC）were analyzed quantatively while correlation of AUC and CysC were also analyzed.ResultsSerum level of Cys C increased significantly at the 6thweek after L-NAME administration which is earlier than the increase of serum levels of Scr and BUN.AUC decreased at first then increased after L-NAME administration.Upon addition of L-NAME，rise time（RT）and peak intensity（PI）decreased while mean transit time（MTT），time from peak to one half（HPT）and time to peak（TTP）increased.Our study confirmed a positive correlation between AUC and Cys C（r=0.950，P＜0.001）.ConclusionSetting up rabbits model by L-NAME is convenient and reproducible，which is an useful tool in experimental study of preclinical and clinical phase of hypertensive renal injury.CEUS combining with CysC serum level analysis is considered as an effective technology for evaluating renal function in hypertensive patients.

hypertension；NG-nitroarginine methylester；rabbits；hypertensive renal injury；contrast-enhanced sonography；cystatinC；renal perfusion

R445.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.013

天津市衛生局基金資助項目（2011KZ52）

1天津醫科大學研究生院（郵編300070）；2天津市人民醫院；3北京，航天中心醫院超聲科；4河北大學附屬醫院超聲科

孟祥鹿（1989），女，碩士在讀，主要從事腹部疾病的研究

△通訊作者E-mail:wangwenhong2014@126.com