雄激素依賴性前列腺癌細胞中雄激素受體上調EphA3表達

刁小偉，李園，皮玉瑞，李同輝，劉平，盧山

細胞與分子生物學

雄激素依賴性前列腺癌細胞中雄激素受體上調EphA3表達

刁小偉，李園，皮玉瑞，李同輝，劉平，盧山△

目的探討雄激素依賴性前列腺癌細胞中促紅細胞生成素產生肝細胞A型受體（EphA）3表達和雄激素受體（AR）信號通路的關聯。方法首先通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和蛋白免疫印跡實驗（Western blot）分別檢測前列腺癌細胞LNCaP和22Rv1中EphA3和AR的mRNA及蛋白水平，然后用雙氫睪酮（DHT）刺激48 h，測定細胞EphA3、AR和前列腺特異抗原（PSA）表達水平的變化。同時，將成功構建的熒光素酶報告基因重組質粒EphA3-Luc（-789～+146）與AR表達質粒pcDNA3.1（+）-AR或AR特異性小分子干擾RNA（siAR）共轉染22Rv1細胞，分析AR對EphA3轉錄活動的影響。結果EphA3在前列腺基質細胞WPMY-1中表達水平極低，但在前列腺癌細胞LNCaP和22Rv1中則明顯升高，與AR表達模式相似。10 nmol/L DHT不僅明顯上調22Rv1細胞中AR、PSA和EphA3表達水平，也顯著升高LNCaP細胞中相關基因和蛋白水平。而且細胞內不同AR表達水平會顯著影響EphA3啟動子活性。結論AR通過提高EphA3啟動子活性上調EphA3表達水平。

促紅細胞生成素產生的肝細胞A型受體3；雙氫睪酮；受體，雄激素；前列腺腫瘤；調節

促紅細胞生成素產生肝細胞（Erythropoietinproducing hepatocellular，Eph）A型受體（Type A recep?tor，A）3是重要受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine ki?nases，RTK）家族中第一個被克隆出來的Eph受體亞族成員［1］，不僅參與調控正常細胞的生理活動［2］，還高表達于多種腫瘤，如胃癌、結直腸癌、黑色素瘤和肉瘤等［3-5］，在與癌癥發生發展相關聯的血管生成、干細胞維持和細胞轉移等方面具有重要作用［2，6］。因此，

近年來被認為是抑制腫瘤細胞生長、治療癌癥的重要靶點［6-7］。然而，在肺癌中卻觀察到EphA3能夠顯著抑制腫瘤細胞生長［8］；在出現衰老特征的人視網膜色素上皮細胞中EphA3被認為是抑癌候選基因［9］。上述研究結論的矛盾性說明EphA3可能針對不同腫瘤在表達及功能上有其特異性，但迄今為止，前列腺癌中有關EphA3的表達與調控，EphA3與前列腺癌發生、發展中起關鍵作用的雄激素受體（Androgen receptor，AR）信號通路的關聯及調控機制鮮見報道。因此，本研究借助分子生物學方法檢測了雄激素非依賴性前列腺癌細胞中EphA3表達水平以及雙氫睪酮（Dihydrotestosterone，DHT）刺激條件下相關基因水平的變化，并構建EphA3啟動子熒光素酶報告基因重組載體與AR表達質粒或AR特異性siRNA（AR siRNA，siAR）共轉染前列腺癌細胞，探討AR對EphA3表達的影響，為前列腺癌的診治提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養將WPMY-1細胞（上海復祥生物科技）、LN?CaP細胞和22Rv1細胞（南京軍區總院王建東博士饋贈）接種于含有100 U/mL青霉素（Hyclone）、100 g/mL鏈霉素（Hy?clone）和10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS，Gibco）的RPMI-1640培養基（Wisent）中，置37℃、5%CO2培養箱里培養。

1.2 DHT刺激待細胞覆蓋率達60%時，換入含有10% Charcoal-stripped FBS（SFBS，HyClone）的phenol-free RPMI-1640培養基（Gibco）。饑餓3 d后，加入不同濃度DHT（北京百靈威科技）刺激48 h。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）RT（HiScript Q RT Su?per Mix for qPCR）和PCR（2×Taq Master Mix）試劑均來自南京諾唯贊生物科技公司。利用Trizol（Invitrogen）提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，再進行PCR擴增。AR［10］、PSA［11］、EphA3［3］和β-actin特異性引物（FW：5′-GAGCTACGAGCT?GCCTGACG-3′；RV：5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′）均由上海捷瑞生物工程公司合成。反應條件為94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個循環；72℃延伸5 min。

1.4 Western blot采用RIPA裂解液（江蘇碧云天）收集細胞總蛋白，并根據本實驗室方法［12］測定蛋白濃度，進行SDSPAGE凝膠電泳、轉膜。然后，分別孵育一抗和二抗，再加入ECL化學發光試劑（上海天能科技），使用化學發光成像系統（上海天能科技）檢測目的蛋白表達水平。β-actin、AR、EphA3、Sp1和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG抗體均購自Santa Cruz公司，PSA抗體則來源于Dako公司。

1.522 Rv1細胞基因組DNA的分離將胰酶消化的細胞收集于40 mL蔗糖裂解液［0.32 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、5 mmol/L MgCl2和1%Triton X-100］中，離心移去部分上清，與重懸緩沖液［0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）和1.5 mmol/L MgCl2］混勻。二次離心后，加入0.5 mL 10×TEN溶液［0.21 mol/L Tris-HCl（pH7.5）、0.29 mol/L EDTA和1 mol/L NaCl］，0.25 mL蛋白酶K（2 g/L）和0.5 mL 10%SDS，37℃放置過夜。再用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、氯仿∶異戊醇（24∶1）、0.4 mol/L NaCl和2倍體積的100%乙醇依次純化基因組DNA，并溶解于雙蒸水中。

1.6 熒光素酶報告基因重組載體的構建利用JASPAR數據庫（Copenhagen，Denmark）分析EphA3啟動子區域［1］，在-615～-601區域發現潛在AR結合位點，即雄激素應答元件（Androgen response element，ARE）。因此，在EphA3啟動子序列的-789～+146區域設計上、下游引物，并添加酶切位點和保護堿基，即分別為F-CCGCTCGAGCTCCCTTCCGTAA?GATGA和R-CCCAAGCTTCTTTGAAGAGCGTGAGCC（下劃線為限制性酶切位點）。以22Rv1細胞的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。用XhoⅠ和HindⅢ酶切PCR產物、割膠純化，與pGL3-Basic線性空載體按比例混合，加入T4 DNA連接酶，過夜后轉化入DH5α，挑取單克隆擴大培養，利用堿裂解法提取質粒DNA。所有重組子均經過酶切及測序分析（生工生物工程公司）。

1.7 瞬時共轉染實驗和雙熒光素酶活性測定AR表達質粒，pcDNA3.1（+）-AR為Dr.Huang Haojie（Mayo clinic）饋贈，siAR［13］由上海英駿生物技術公司合成。選用Lipofectamine 2000（Invitrogen）對種植于24孔板中、覆蓋率達50%左右的22Rv1細胞分為4組進行轉染（n=3）。每孔均加入400 ng熒光素酶重組子和10 ng pRL-TK內參。AR過表達組再加入400 ng AR質粒，對照組為pcDNA3.1（+）空載質粒；AR敲除組則加入20 pmol siAR，對照組為熒光標記的siRNA陰性對照（FAM-siRNA NC）。細胞轉染4 h后，更換新鮮培養基。48 h后，嚴格遵守Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）操作，用Thermo Scientific Luminoskan Ascent分析儀測定細胞裂解液的螢火蟲（firefly）和海腎（Renilla）熒光素酶活性，啟動子的相對活性用兩者比值表示，并經相應對照組結果校正。

1.8 統計學方法每個實驗至少重復2次以上，選取有代表性的實驗結果，以均數±標準差表示。采用Excel和GraphPad Prism 5進行統計分析，2組間的均數比較采用獨立樣本資料t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌細胞中EphA3表達水平與前列腺正常基質細胞WPMY-1相比，EphA3在高表達AR的雄激素依賴性前列腺癌細胞LNCaP和22Rv1中的mRNA和蛋白水平均顯著升高；且EphA3在兩種細胞中的表達模式與AR幾乎一致，見圖1（22Rv1細胞中還存在AR剪切變異體表達的突變蛋白，如圖中箭頭所示）。因此，推測EphA3表達水平可能與AR調節有關。

2.2 DHT刺激上調EphA3表達當加入一定濃度

DHT后，22Rv1細胞中AR、PSA和EphA3的mRNA水平均明顯升高，見圖2A；AR、PSA和EphA3在蛋白水平上也出現顯著增加，見圖2B。同時，LNCaP細胞的AR和PSA蛋白水平也隨著DHT濃度上升而增加，當DHT為10 nmol/L時，EphA3蛋白水平升高2倍左右；此外，以在正常培養基中生長的細胞作為陽性對照，其AR、PSA和EphA3蛋白水平也有一定程度增加，見圖2C。提示雄激素信號通路的激活能夠增加AR表達，提高AR轉錄活性，還誘導了EphA3表達。

Fig.1The expression levels of EphA3 and AR in androgen-dependent prostate cancer cells圖1 前列腺癌細胞中EphA3和AR的表達水平

Fig.2The effects of DHT on AR，PSA and EphA3 expressions inhuman androgen-dependent prostate cancer 22Rv1 and LNCaP cells圖2 DHT對前列腺癌細胞LNCaP和22Rv1中AR、PSA和EphA3表達的影響

2.3 EphA3啟動子熒光素酶報告基因重組質粒的鑒定結果熒光素酶的報告基因質粒EphA3-Luc（-789～+146）是在pGL3-Basic載體上插入EphA3啟動子片段，見圖3A。重組質粒的酶切結果顯示，泳道1是限制性內切酶XhoⅠ切割pGL3-Basic載體后獲得的線性質粒DNA全長片段，約5 000 bp，與理論值4 818 bp基本吻合；泳道2是PstⅠ（位于EphA3啟動子-246～-243區域里）單酶切重組質粒獲得的片段，推測長度應為5 753 bp，與圖中6 000 bp位置基本一致；泳道3則是利用PstⅠ和BamHⅠ（位于pGL3-Basic上）共同作用的產物，基本符合3 394 bp和2 359 bp的預期位置，見圖3B。由此，能夠初步確認已完成EphA3啟動子熒光素酶報告基因質粒的構建。對重組質粒進行正反向測序及DNAMAN軟件比對，發現插入片段和EphA3啟動子序列完全一致，證實已成功構建EphA3啟動子的熒光素酶報告基因質粒，見圖4。

Fig.3Construction of luciferase reporter plasmid EphA3 gene promoter圖3 EphA3啟動子熒光素酶報告基因質粒的構建

2.4 AR的表達水平對EphA3啟動子活性的影響EphA3-Luc（-789～+146）與AR表達質粒或siAR共轉染22Rv1細胞的雙熒光素酶活性檢測結果顯示，AR過表達能顯著提高啟動子活性；反之，AR表達受抑制，啟動子活性則顯著下降，見圖5。說明AR能夠影響EphA3啟動子活性，即AR能夠通過影響EphA3轉錄水平來調節EphA3表達水平。

3 討論

3.1 AR對EphA3表達水平的影響有文獻報道前列腺癌細胞LNCaP中EphA3的mRNA高水平表達［14］，本研究不僅證實LNCaP細胞中EphA3的mRNA水平上升，也發現其蛋白水平異常，還在22Rv1細胞中觀察到同樣現象，EphA3表達水平與細胞中AR表達模式相似。同時，EphA3在前列腺癌22Rv1細胞中無論mRNA還是蛋白水平上均能受到DHT誘導表達；而且，EphA3受DHT誘導的變化趨勢與AR作為轉錄因子調控的PSA水平變化相

一致。此外，DHT刺激LNCaP細胞EphA3后蛋白水平也顯著上升。因此，AR能夠上調EphA3表達。最近有文獻報道雄激素誘導的前列腺亮氨酸拉鏈基因（Prostate Leucine zipper gene，PrLZ/PC-1）能夠促進EphA3表達［15］，這也說明AR可能會上調EphA3。但值得注意的是，曾有文獻報道針對來源于LNCaP細胞的雄激素依賴性細胞LNCaP-C33和雄激素非依賴性細胞LNCaP-C81進行的基因芯片分析顯示，EphA3表達水平在后者中顯著升高［16］。盡管LNCaP細胞向雄激素非依賴性轉變的過程中，AR作為轉錄因子調控PSA的作用會受到抑制，但還會涉及到很多其他基因以及信號通路的變化；并且雄激素非依賴性LNCaP細胞中AR表達水平不一定減少；也不能進一步推斷雄激素依賴性細胞LNCaP-C33中敲除AR后EphA3表達就會出現上升。所以，雄激素非依賴性前列腺癌細胞中出現這樣的結果很可能歸因于針對不同前列腺癌進展階段EphA3的表達和調控都有其特異性，也可能還存在其他EphA3調節通路等，需要進一步研究。

Fig.4Sequencing analysis of EphA3 promoter luciferase reporter plasmid圖4 重組EphA3啟動子質粒的測序分析

Fig.5The effects of increasing or reducing AR expressions on EphA3 promoter luciferase activity in 22Rv1 cells圖5 22Rv1細胞中增加或抑制AR表達水平對EphA3啟動子熒光素酶活性的影響

3.2 AR調節EphA3表達的機制AR屬于核受體超家族中的類固醇受體，在前列腺癌中高表達。許多研究已證實AR與前列腺癌發生、發展及其信號通路密切關聯，且阻斷AR的下游信號已成為前列腺癌治療的新策略［17］。AR通常由4個結構域——N端轉錄激活區（NTD）、DNA結合區（DBD）、鉸鏈區和配體結合區（LBD）組成。細胞質內處于失活狀態的AR能夠依賴雄激素等配體的結合而被激活進入核內，再與靶基因啟動子上特異性DNA序列ARE位點相結合來調節靶基因的轉錄活動［18］。對EphA3啟動子區域的分析發現在-615～-601處有潛在的ARE結合位點，啟動子熒光素酶實驗也證實AR表達水平的變化顯著影響EphA3啟動子活性。因此，推測AR很可能通過與ARE位點結合來直接調節EphA3的表達。但AR對下游基因的調控，除了作為轉錄因子結合ARE發揮作用外，也可以作為轉錄輔助因子與其他蛋白結合來調節基因的表達。如AR能與轉錄因子Sp1蛋白形成復合物依賴Sp1結合位點，共同調節下游基因如細胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因p21和血管內皮生長因子（VEGF）［19-20］。因此，EphA3啟動子區域ARE位點是否就是AR作為轉錄因子直接結合區域，還是與其他蛋白共同作用來調節EphA3轉錄水平以及在此調節過程中EphA3核心啟動子區域是否還有其他起關鍵作用的轉錄因子結合位點等，都還有待于深入探討。

AR及其信號通路在前列腺癌的發生發展中發

揮重要的作用，本研究發現雄激素非依賴性前列腺癌細胞高表達EphA3；同時，EphA3的表達水平也能夠隨AR信號通路的激活而增加；而且EphA3啟動子活性能夠應答AR表達水平的變化。這些結果說明了EphA3與前列腺腫瘤重要影響因子AR的關聯。因此，對EphA3在前列腺癌中的作用進行深入研究，能夠為前列腺癌的診治提供新的理論依據。

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（2015-04-14收稿 2015-06-11修回）

（本文編輯 李鵬）

Androgen receptor up-regulates EphA3 expression in androgen-dependent prostate cancer cell lines

DIAO Xiaowei，LI Yuan，PI Yurui，LI Tonghui，LIU Ping，LU Shan△
1 College of Life Science，Nanjing Normal University，Nanjing 210023，China；2 Jiangsu Provincial Key Laboratory of Molecular Medicine，Nanjing Normal University△

ObjectiveTo evaluate the relationship between liver cell type A receptor（EphA）expression and androgen receptor（AR）signaling in androgen-dependent prostate cancer cells.MethodsRT-PCR and Western blot assay were used to determine mRNA and protein levels of EphA3 and AR in prostate cancer LNCaP and 22Rv1 cells，respectively.The variations of EphA3，AR and prostate specific antigen（PSA）expressions were also measured in these cells after dihydrotes?tosterone（DHT）treatment for 48 h.The constructed EphA3-Luc（-789-+146）luciferase reporter plasmid was co-transfect?ed with pcDNA3.1（+）-AR or siAR in 22Rv1 cells to analyze the effects of different AR expression levels on EphA3 tran?scription activity.ResultsThe expression pattern of EphA3 was similar to AR，showing a lower level in prostate stromal cell line WPMY-1 and a higher level in prostate cancer cell lines LNCaP and 22Rv1.When stimulated with 10 nmol/L DHT，the expression levels of AR，PSA and EphA3 were significantly increased in 22Rv1 cells，and the protein levels of these genes were also increased in LNCaP cells.Moreover，AR expression levels markedly influenced the activity of EphA3 pro?moter.ConclusionAR up-regulates EphA3 expression by increasing the activity of EphA3 promoter.

EphA3；dihydrotestosterone；receptors，androgen；prostatic neoplasms；regulation

R737.1，R73-37

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.009

國家自然科學基金資助項目（81172007、81272850）

1南京師范大學生命科學學院（郵編210023）；2南京師范大學江蘇省分子醫學生物技術重點實驗室

刁小偉（1988），男，碩士在讀，主要從事前列腺癌相關基因轉錄調控研究

△通訊作者E-mail:lu_shan@hotmail.com