Akt/GSK-3β/eNOS通路在藏紅花酸保護離體大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用

王亞光，王鵬，陶貴周△，黃建華

Akt/GSK-3β/eNOS通路在藏紅花酸保護離體大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用

王亞光1，王鵬2，陶貴周1△，黃建華2

目的研究藏紅花酸（CRO）對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用，探討其與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）/糖原合成酶激酶（GSK）-3β/一氧化氮合酶（eNOS）信號通路的關系。方法SD大鼠40只，隨機數字表法均分為正常（N）組、缺血再灌注（IR）組及5、10、15 mg/L加藥（CRO1、CRO2、CRO3）組，比較再灌注30 min時各組心率（HR），冠脈流量（CF），左心室內壓測定（LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax）。灌流結束TTC心肌染色評估梗死范圍，分光光度法測定肌漿乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK-MB）；Western blot檢測各組心肌組織內Akt、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt）、GSK-3β、磷酸化的糖原合成酶激酶（p-GSK）-3β、eNOS、磷酸化的一氧化氮合酶（p-NOS）。結果IR組再灌注30 min時HR、CF、LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax較N組及加藥組降低，心肌梗死面積較加藥組增大，LDH、CK-MB表達較N組及加藥組增加（均P＜0.05），CRO3組再灌注指標較CRO1組升高，梗死面積降低，LDH、CK-MB表達減少（P＜0.05）。IR組Akt、GSK-3b及eNOS較N組及加藥組的表達差異無統計學意義，但p-Akt、p-GSK-3β及p-NOS與N組及加藥組降低，且CRO3組較CRO1組增加（均P＜0.05）。結論藏紅花酸能夠減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，其作用機制可能與激活Akt/GSK-3β/eNOS通路并影響其磷酸化水平有關。

體外循環；再灌注損傷；蛋白激酶類；糖原合成酶激酶-3β；一氧化氮合酶；氧化磷酸化

目前，心肌缺血再灌注損傷（MIRI）成為阻礙缺血心肌從再灌注療法獲得最佳療效的主要難題［1］。藏紅花是多年生草本植物，可以調節纖維蛋白溶酶原激活劑及其抑制物之間的平衡，改善冠心病、心絞痛患者纖維蛋白的溶解功能，減少血栓形成［2］。王艷艷等［3］動物實驗證實，藏紅花酸（crocetin，CRO）預處理能夠上調凋亡抑制蛋白（Bcl）-2、下調促凋亡蛋白（Bax），從而對損傷的心肌細胞產生保護作用。但有關CRO在體外對心肌缺血再灌注的相關研究少見。本實驗旨在觀察CRO對大鼠絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）、糖原合成酶激酶（GSK）-3β、一氧化氮合酶（eNOS）及其磷酸化形式表達的影響，探討其對再灌注心肌的保護作用，以期為CRO改善MIRI的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料健康清潔級SD大鼠40只，體質量250～300 g，12～14周齡，雌雄不限，購于遼寧醫學院實驗動物中心。灌流裝置購于美國RADNOTI公司，MP150多導生理記錄分析系統購于美國BIAPOC公司，Krebs-Henseleit（K-H）試劑購于sigma公司，左室壓力測定使用泰盟BL-420S生物功能實驗系統，TTC試劑購于北京科博賽而科技有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK-MB）試劑盒購于南京建成生物有限公司，CRO購自濟南浩化實業有限責任公司（批號為20121123）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與模型建立40只大鼠隨機數字表法分為空白對照（N）組、缺血再灌注（IR）組、5 mg/L加藥（CRO1）組、10 mg/L加藥（CRO2）組、15 mg/L加藥（CRO3）組，每組均為8只。大鼠干預前均自由進食，自由飲水。所有大鼠20%烏拉坦（5 μL/g）麻醉，1 000 U肝素靜脈注射，迅速開胸，取出心臟，迅速移至Langendorff灌流裝置，主動脈逆行插管，用KH液80 cm H2O恒壓（1 cm H2O=0.098 kPa），Krebs-Henseleit（K-H）液成分NaCl 118 mmol/L，KCl 4.74 mmol/L，KH2PO41.19 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.19 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L。調pH值為7.4。以體積分數為950 mL/L O2+50 mL/L CO2，水浴維持缺血溫度37℃。心臟掛至灌流裝置后，插入球囊，另一端連接換能器［4］。非循環模式下預灌流20 min后，IR組停灌30 min取K-H液再灌流45 min；CRO1組、CRO2組和CRO3組于再灌注時，灌流液中分別加入CRO 5、10及15 mg/L，余同IR組；對照組連續灌流95 min。凡由大鼠自身心臟結構決定心率（HR）＜200次/min或冠脈流量＜8 mL/min，予以排除［4］。再灌注30 min時測冠脈流量（CF）＞5 mL/min、HR＞170次/min為造模成功。

1.2.2 灌流期間觀察指標在灌流穩定后缺血再灌流30 min時測各組流出K-H液冠脈流量（mL/min）、MP150測HR、BL-420S生物功能實驗系統測左心室內壓（LVDP）、等容收縮期左心室內壓最大變化率（LV+dp/dtmax）及等容舒張期左心室內壓最大變化速率（LV-dp/dtmax）。

1.2.3 TTC染色及酶譜測定在95 min灌注結束時取各組心臟于-20℃凍存1 h，N組不參與染色，由心尖至心底部橫向均勻切片，1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）37℃染色5 min，后于10%福爾馬林固定10 min，數碼照相機拍照，蒼白色為梗死區。采用圖像分析儀Image pro plus 7.0軟件處理得面積百分比。另取心尖組織0.5 g，制成10%心肌均漿，分光光度法分別在450 nm和340 nm處測定LDH、CK-MB含量。

1.2.4 Western blot取各組左室前壁心肌組織，提取蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。封閉液封閉，抗-Akt單克隆抗體（1∶1 500）、抗p-Akt單克隆抗體（1∶1 000）、抗-GSK-3β單克隆抗體（1∶1 000）、抗p-GSK-3β單克隆抗體（1∶1 000）、抗eNOS單克隆抗體（1∶1 000）及抗p-eNOS單克隆抗體（1∶1 000），以上抗體均為Cell Signaling公司產品，辣根過氧化酶標記的鼠抗兔為二抗，TBST洗膜后成像，Akt、GSK-3β、eNOS的水平以Akt/β-actin、p-Akt/β-actin、GSK-3β/β-ac?tin、p-GSK-3β/β-actin、eNOS/β-actin、p-eNOS/β-actin表示，用圖像分析儀Image pro plus 7.0軟件凝膠圖像分析系統分析灰度值。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0軟件統計分析。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRO對各組中HR、CF、LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax的影響N組、CRO1、CRO2及CRO3組CF、HR、LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax均高于IR組（P＜0.05）。CRO3組各項指標較CRO1、CRO2組升高（P＜0.05），CRO2組、CRO1組差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1Comparison of CF，HR and LVDP during the period of ischemia/reperfusion between five groups表1 各組灌流期間CF、HR及LVDP等比較（n=8，）

Tab.1Comparison of CF，HR and LVDP during the period of ischemia/reperfusion between five groups表1 各組灌流期間CF、HR及LVDP等比較（n=8，）

**P＜0.01；a與IR組比較，b與CRO1組比較，c與CRO2組比較，均P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

組別N組I R組C R O1組C R O2組C R O3組F C F（m L / m i n）9 . 9 ± 0 . 6 a 5 . 2 ± 0 . 5 6 . 3 ± 0 . 2 a 6 . 7 ± 0 . 5 a 7 . 3 ± 0 . 2 a b c 2 5 . 7 6 8 * * H R（次/ m i n）2 6 2 ± 4 a 1 8 1 ± 6 1 9 6 ± 7 a 2 1 0 ± 6 a 2 2 1 ± 6 a b c 2 1 . 4 3 2 * * L V D P（m m H g）7 1 . 8 ± 9 . 9 a 3 3 . 8 ± 1 . 5 4 4 . 2 ± 3 . 0 a 4 5 . 6 ± 2 . 5 a 5 2 . 1 ± 5 . 6 a b c 1 8 . 5 6 4 * * L V + d P / d t m a x（m m H g / s）1 4 8 2 ± 7 6 a 7 1 6 ± 5 9 7 9 2 ± 3 6 a 8 1 2 ± 4 8 a 8 9 8 ± 7 8 a b c 3 3 . 7 4 6 * * L V -d P / d t m a x（m m H g / s）1 1 3 7 ± 4 8 a 5 8 2 ± 5 2 6 9 0 ± 8 3 a 7 2 3 ± 6 8 a 7 7 5 ± 7 9 a b c 1 7 . 8 5 2 * *

2.2 TTC染色梗死面積比較IR組、CRO1組、CRO2組及CRO3組的梗死面積分別為（48.7±9.8）%、（32.7± 4.2）%、（29.1±2.7）%、（21.7±4.5）%（F=34.264，P＜0.01），其中IR組較CRO1組、CRO2組及CRO3組增

大，CRO3組較CRO1組減小（均P＜0.05），見圖1。

Fig.1TTC staining showing infarction area in different groups圖1 各組梗死心肌TTC染色比較

2.3 各組LDH、CK-MB表達水平比較IR組較N組、CRO1、CRO2及CRO3組的LDH、CK-MB含量升高（P＜0.01）；CRO3組LDH、CK-MB含量較CRO1組降低（P＜0.05），CRO3組LDH含量較CRO2組降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2The expressions of LDH and CK-MB in myocardial homogenate表2 心肌均漿LDH、CK-MB的檢測結果（n=8，）

Tab.2The expressions of LDH and CK-MB in myocardial homogenate表2 心肌均漿LDH、CK-MB的檢測結果（n=8，）

**P＜0.01；a與IR組比較，b與CRO1組比較，c與CRO2組比較，均P＜0.05

C K -M B（U · L -1）2 1 9 ± 1 2 a 6 2 1 ± 3 6 5 2 1 ± 4 5 a 3 5 8 ± 5 3 a b 3 3 3 ± 1 9 a b 2 2 . 5 0 8 * *組別N組I R組C R O 1組C R O 2組C R O 3組F L D H（U · g -1）1 4 9 6 . 2 ± 2 0 1 . 5 a 2 2 5 9 . 6 ± 1 7 8 . 3 2 0 3 0 . 8 ± 4 5 6 . 6 a 1 7 5 7 . 8 ± 4 7 6 . 2 a b 1 6 1 3 . 9 ± 3 5 6 . 4 a b c 1 7 . 3 5 2 * *

2.4 Western blot檢測結果IR組與N組、CRO1、CRO2及CRO3組的Akt、GSK-3β、eNOS活性差異無統計學意義（P＞0.05）；IR組較N組、CRO1、CRO2及CRO3組的p-Akt、p-GSK-3β、p-eNOS表達降低（P＜0.05），CRO3組p-Akt、p-GSK-3β、p-eNOS表達較CRO1組增加（P＜0.05），見圖2～4、表3。

Fig.2Comparison of Akt and p-Akt activity between five groups圖2 Akt與p-Akt在不同組內活性的比較

Fig.3Comparison of GSK-3β and p-GSK-3β activity between five groups圖3 GSK-3β與p-GSK-3β在不同組內活性的比較

Fig.4Comparison of eNOS and p-eNOS activity between five groups圖4 eNOS與p-eNOS在不同組內活性的比較

Tab.3Comparison of protein expression between five groups表3 各組蛋白表達結果的比較（n=8，）

Tab.3Comparison of protein expression between five groups表3 各組蛋白表達結果的比較（n=8，）

**P＜0.01；a與IR組比較，b與CRO1組比較，P＜0.05

組別N組I R組C R O 1組C R O 2組C R O 3組F A k t 2 . 3 0 ± 0 . 1 2 2 . 2 9 ± 0 . 2 1 2 . 3 1 ± 0 . 1 7 2 . 3 4 ± 0 . 2 0 2 . 2 7 ± 0 . 1 8 0 . 9 2 1 p -A k t 1 . 0 3 ± 0 . 2 6 a 0 . 6 7 ± 0 . 1 2 1 . 0 4 ± 0 . 1 8 a 1 . 1 1 ± 0 . 1 6 a 1 . 1 9 ± 0 . 1 3 a b 1 5 . 3 7 2 * * G S K -3 β 1 . 9 5 ± 0 . 2 1 1 . 9 4 ± 0 . 2 3 1 . 9 5 ± 0 . 2 2 1 . 9 7 ± 0 . 2 1 1 . 9 6 ± 0 . 2 6 0 . 7 6 9組別N組I R組C R O 1組C R O 2組C R O 3組F p -G S K -3 β 0 . 9 2 ± 0 . 1 9 a 0 . 4 8 ± 0 . 1 6 0 . 9 6 ± 0 . 1 8 a 1 . 0 6 ± 0 . 2 3 a 1 . 2 1 ± 0 . 2 1 a b 1 3 . 2 6 7**e N O S 3 . 5 9 ± 0 . 2 3 3 . 5 7 ± 0 . 3 3 3 . 6 0 ± 0 . 2 8 3 . 6 1 ± 0 . 3 1 3 . 5 4 ± 0 . 2 8 0 . 8 2 1 p -e N O S 1 . 8 9 ± 0 . 2 6 a 0 . 8 7 ± 0 . 1 8 1 . 9 2 ± 0 . 1 7 a 2 . 1 3 ± 0 . 2 1 a 2 . 5 6 ± 0 . 2 8 a b 1 7 . 3 2 1**

3 討論

藏紅花是一種傳統的中藥材，CRO是其主要的活性成分之一。孫經武等［5］證實，CRO預處理在心肌缺血再灌注損傷中可以通過負性調節腫瘤壞死因子（TNF）-α，正性調節白細胞介素（IL）-10來減輕炎癥反應并抑制心肌細胞的凋亡，發揮心肌保護作用。李玲等［6］研究證實，通過CRO對大鼠的預處理能夠減輕缺血再灌注對心肌細胞的損傷，其作用機制與缺氧誘導因子-1α、血管內皮生長因子的表達有關。

本研究采用體外循環灌流裝置，去除體液、神經及心臟前后負荷對再灌注的影響。結果顯示，IR組與N組、各加藥組比較，再灌流期間CF、HR、LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax降低，TTC染色梗死面積較各加藥組增大，心肌勻漿LDH、CK-MB的表達較N組、各加藥組增加，表明缺血再灌注可導致心肌受損，也表明造模成功，提示CRO可以減輕離體大鼠心肌梗死模型的MIRI。再灌注期間CRO3組各項指標較CRO1、CRO2組升高，而CRO2組、CRO1組差異無統計學意義，CRO3組較CRO1組梗死面積及LDH、CK-MB的表達降低，表明高劑量的CRO發揮作用更明顯，而抑制心肌細胞凋亡可能有助于CRO對心臟缺血再灌注保護作用。

細胞凋亡是組織損傷繼發于缺血再灌注損傷的重要機制，心肌組織在缺血后再灌注的開始時，多種心肌保護手段均能夠主動募集信號轉導通路，其中Akt/GSK-3β/eNOS信號轉導通路是最重要的途徑之一，具有顯著的抗心肌細胞凋亡、保護再灌注心肌的

作用［7］。葉強等［8］通過觀察辛伐他汀對心肌梗死后心肌細胞凋亡的影響顯示，辛伐他汀可改善心肌梗死后心功能，認為其可能是通過激活Akt/GSK-3β通路，抑制心肌細胞凋亡實現。劉馨駿等［9］研究表明，紅景天苷可增加缺血再灌注心肌中Akt/GSK-3β的蛋白表達及磷酸化，增強對缺血再灌注損傷心肌保護作用。AKT激活后形成p-Akt，可進一步作用于相關底物發揮抗凋亡作用［10］。眾多具有心肌保護作用的激酶如PKA、PKB/Akt、PKC都匯合于GSK-3β通路，導致GSK-3β磷酸化失活，最終通過抑制線粒體死亡來減輕細胞凋亡［11］。eNOS可產生NO，通過舒張血管、減輕炎癥細胞及減少血小板聚集、浸潤，改善冠脈血供，對心肌內皮細胞起保護作用［12］。eNOS的翻譯后修飾有著復雜的模式，而磷酸化和去磷酸化網絡是調節eNOS活性的主要的翻譯后修飾［13］。

本研究結果顯示IR組與N組及各加藥組比，Akt、GSK-3β、eNOS蛋白總量未有明顯變化，但其p-Akt、p-GSK-3β、p-eNOS較N組及各加藥組表達量減少，CRO3組p-Akt、p-GSK-3β、p-eNOS表達較CRO1組增加，表明CRO保護心肌缺血再灌注損傷的作用機制可能與激活Akt/GSK-3β/eNOS通路有關，但不影響Akt、GSK-3β、eNOS總量的表達，而通過影響其磷酸化水平來發揮作用，與葉強等［8］研究相一致，且高劑量的CRO發揮作用更明顯。因此，抑制細胞凋亡可能是CRO保護心肌、對抗缺血再灌注損傷的機制之一，證實Akt/GSK-3β/eNOS信號轉導通路在MIRI保護作用中發揮重要作用，其活性調控呈現出一個復雜而精密的調控網絡。目前，由于不同氨基酸殘基的磷酸化對其活性調控的機制亦各異，中藥及其有效活性成分在這些方面的深入研究尚較少。

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（2015-03-13收稿 2015-06-25修回）

（本文編輯 陸榮展）

The effect of crocetin on Akt/GSK-3β/eNOS signaling pathway in myocardial ischemiareperfusion injury of isolated rat hearts

WANG Yaguang1，WANG Peng2，TAO Guizhou1△，HUANG Jianhua2
1 Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2 Key Laboratory of Tissue Engineering，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou△

ObjectiveTo study the protective effects of crocetin on myocardial ischemia-reperfusion injury，and their correlation with the signaling pathway of serine/threonine protein kinase（Akt）/glycogen synthase kinase（GSK）-3β/nitric ox?ide synthase（eNOS）.MethodsForty healthy SD rats were divided into normal group（N），ischemia reperfusion group（IR）and 5，10 and 15 mg/L of crocetin groups（CRO1，CRO2and CRO3）by random number table method.The values of heart rate（HR），coronary flow（CF）and left ventricular pressure measurement（LVDP，LV+dp/dtmax，LV-dp/dtmax）30 minutes after reperfusion were compared between five groups.TTC staining was used to detect the infarct volume.Spectrophotometric method was used to determinate the expression of lactate dehydrogenase（LDH）and creatine kinase（CK-MB）.The levels of Akt，the phosphorylation of Akt（p-Akt），GSK-3β，phosphorylation of GSK-3β（p-GSK-3β），eNOS and phosphorylation of eNOS（p-NOS）were detected by Western blot assay.ResultsThe HR，CF，LVDP，LV+dp/dtmax and LV-dp/dtmax were significantly lower 30 min after reperfusion in IR group than those of N group and crocetin groups（P＜0.05）.The myocardial infarction area was bigger in IR group than that of crocetin groups.The expression levels of LDH and CK-MB were signifi?cantly higher in IR group than those of N group and crocetin groups（P＜0.05）.The reperfusion index was higher in CRO3group than that of CRO1group.The infarction area，LDH and CK-MB expressions were significantly decreased in CRO3group than those of CRO1group（P＜0.05）.There were no significant differences in expressions of Akt，GSK-3β and eNOS between IR group，N group and crocetin groups.But p-Akt，p-GSK-3β and p-NOS were significantly decreased in IR group than those of N group and crocetin groups.The p-Akt，p-GSK-3β and p-NOS were significantly increased in CRO3group than those of CRO1group（P＜0.05）。ConclusionCrocetin has protective effects on myocrdial ischemia reperfusion injury in rats，which may be involved in the enhancing the phosphorylation of signalling pathway of Akt/GSK-3β/eNOS.

extracorporeal circulation；reperfusion injury；protein kinases；glycogen synthase kinase 3β；nitric oxide synthase；oxidative phosphorylation

R965.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.021

1錦州，遼寧醫學院附屬第一醫院心內科（郵編121001），2院組織工程重點實驗室

王亞光（1990），男，碩士研究生，主要從事冠心病的診斷與治療研究

△通訊作者E-mail:tgz56789@163.com