腦源性神經營養因子可減輕H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷

王詩才，陳太軍，黃美松，朱少銘

腦源性神經營養因子可減輕H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷

王詩才，陳太軍，黃美松，朱少銘△

目的探討腦源性神經營養因子（BDNF）預處理對H9c2心肌細胞缺氧/復氧（H/R）損傷的影響及其作用機制。方法體外培養H9c2心肌細胞并以缺氧（95%N2+5%CO2）培養4 h后復氧（95%O2+5%CO2）培養12 h建立H/ R模型，并分為Control組、H/R組、不同濃度（1、10、100 μg/L）BDNF預處理后H/R組、酪氨酸蛋白激酶受體B（TrkB）inhibitor組（同時加入100 μg/L BDNF和1∶1 000的TrkB inhibitor預處理后H/R組）。利用MTT方法檢測各組心肌細胞的細胞存活率；并測定各組心肌細胞H/R損傷后乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量及活性；流式細胞術測定各組心肌細胞的凋亡率；Western-blot檢測TrkB、Bcl-2、Bax蛋白表達。結果與Control組相比，H/R組細胞存活率明顯下降，LDH、CK和MDA含量升高，SOD活性降低，細胞凋亡率升高，抗凋亡Bcl-2蛋白表達下降，促凋亡Bax蛋白表達升高（均P＜0.05）。與H/R組相比，不同濃度BDNF預處理H9c2心肌細胞后H/R，各組細胞存活率均明顯上升，CK、LDH、MDA含量逐漸下降，SOD活性升高，細胞凋亡率下降，TrkB和Bcl-2蛋白表達升高，而Bax蛋白表達降低，但BDNF的作用均受到TrkB inhibitor的抑制。結論BDNF預處理能夠提高H9c2心肌細胞H/R損傷的細胞存活率，通過降低細胞凋亡率和提升細胞抗氧化能力而發揮保護作用，并與BDNF-TrkB信號通路有關。

腦源性神經營養因子；肌細胞，心臟；細胞低氧；受體，trkB；氧化性應激；細胞凋亡；缺氧/復氧損傷

臨床和基礎醫學資料表明，心肌組織缺血再灌注（I/R）損傷嚴重影響缺血性心血管疾病的治療，是術后引發死亡的主要原因之一［1］。隨著再灌注治療在臨床的廣泛開展，I/R損傷問題已成為當前臨床研究的焦點。近來研究表明心肌I/R過程中的氧化應激和心肌細胞功能障礙及細胞凋亡參與了I/R損傷的發生［2］。腦源性神經營養因子（brain-derived neu?rotrophic factor，BDNF）是神經營養因子家族的主要成員之一，存在于中樞神經系統和周圍神經系統，具有維持神經元存活和生長的作用［3］。最新研究表明BDNF還廣泛表達于許多非神經組織如血管內皮細胞和心肌組織細胞中，并能夠調節血管損傷修復和促進傷口愈合，說明神經源性因素在心血管系統損傷修復中也能發揮作用［4］。另有研究發現當心肌組織缺血預處理時心肌細胞中BDNF mRNA和蛋白表達會明顯上調，提示BDNF可能會作為神經源性的心肌保護因素之一在心肌I/R中發揮作用［5］，但其具體機制尚少見研究。本研究構建H9c2心肌細胞缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型模擬心肌I/R損傷，觀察BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷的影響，并從抗細胞凋亡和氧化應激方面探討其作用機制及是否通過BDNF-TrkB信號通路發揮作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗試劑H9c2心肌細胞株購自北京中科院細胞資源中心；DMEM/F-12細胞培養基、胎牛血清、0.25% EDTA胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；BDNF、酪氨酸蛋白激酶受體B（TrkB）抑制劑（TrkB-inhibitor）購自美國R&D公司；二苯基溴化四氮唑（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司；FITC-Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京碧云天生物公司；多克隆兔抗鼠TrkB、Bcl-2、Bax抗體購自美國Abcam公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗、ECL化學發光試劑購自北京博奧森生物公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 H/R模型的建立及心肌細胞分組將凍存復蘇的H9c2心肌細胞在10%胎牛血清及含雙抗（青霉素、鏈霉素）的DMEM/F12細胞培養基中培養，并置于37℃、5%CO2培養箱中。待細胞貼壁生長至80%以上時，消化收集細胞進行后續實驗。選用生長狀態良好的H9c2心肌細胞構建H/R損傷模型。先用以95%N2+5%CO2充分飽和的不含胎牛血清的DMEM/F12培養基培養H9c2細胞，并放入含95%N2+5%CO2的混合氣體的培養箱中缺氧培養4 h，后更換含胎牛血清的正常培養基放回含95%O2+5%CO2培養箱中復氧培養12 h，以構建H9c2心肌細胞H/R損傷模型。將培養的H9c2心肌細胞分為以下幾組：（1）正常對照未H/R損傷組（Control組）。（2）H/R組，即缺氧4 h后復氧培養12 h。（3）1 μg/L BDNF+H/R組，即1 μg/L BDNF預處理正常培養24 h后H/ R。（4）10 μg/L BDNF+H/R組，即10 μg/L BDNF預處理正常培養24 h后H/R。（5）100 μg/L BDNF+H/R組，即100 μg/L BDNF預處理正常培養24 h后H/R組。（6）TrkB inhibitor組，即100 μg/L BDNF和1∶1 000的TrkB inhibitor預處理正常培養24 h后H/R組。

1.2.2 MTT方法檢測細胞存活率取生長狀態良好的H9c2心肌細胞，消化離心后收集并用培養基稀釋至5×104個/mL接種于96孔板中，同時設定空白對照孔，即不加細胞按照同步驟處理，等細胞同步化培養貼壁后，按照上述分組分別處理各組細胞。等培養結束后，在每組各細胞孔中加入20 μL

的MTT溶液（5 mg/L），在37℃下繼續正常培養4 h，棄去上清后在每孔中加入150 μL的DMSO溶液，振蕩反應10 min后，在酶標儀上測定各孔在590 nm處的光密度（OD）值。每組同時設置5個重復孔。各組心肌細胞的存活率（%）=（處理組OD-空白對照組OD）/（Control組OD-空白對照組OD）× 100%。

1.2.3 LDH、CK、MDA及SOD含量測定將H9c2心肌細胞接種于24孔板中經相同分組處理后，繼續培養24 h。收集各組細胞的上清液，按照檢測試劑盒說明，利用比色法測定各組H9c2心肌細胞經不同處理H/R后CK、LDH的漏出量變化。同時收集各組處理完畢的細胞，利用RIPA蛋白提取試劑提取各組細胞中總蛋白，并按照試劑盒說明測定細胞內MDA含量及SOD活性變化。

1.2.4 細胞凋亡率檢測各組H9c2心肌細胞經相同分組處理后，用含0.25%的EDTA胰酶消化，離心收集細胞，用PBS洗滌1遍后，用PBS重懸細胞并調整細胞濃度為106個/mL，每組取出200 μL的細胞懸液，先用FITC標記的Annexin-V和PI各5 μL混勻后室溫避光孵育20 min，后用PBS洗滌2遍，低速離心收集細胞，并用150 μL PBS重懸，立即用流式細胞檢測儀上樣檢測各組心肌細胞H/R后的凋亡率變化。

1.2.5 Western-blot檢測TrkB、Bcl-2及Bax表達收集各組處理并培養結束的H9c2心肌細胞，PBS洗滌1次后，利用RIPA強細胞裂解液提取各組細胞中總蛋白，并用BCA試劑盒測定細胞中總蛋白濃度。取每組中30 μg總蛋白進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后半干法轉PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉30 min后，分別孵育多克隆兔抗鼠TrkB、Akt、p-Akt及內參β-actin一抗（均1∶1 000稀釋）于4℃過夜，后TBST洗滌3次，再分別孵育HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）2 h，TBST洗滌3次后，PVDF膜用ECL化學發光法顯影，并放入凝膠掃描系統曝光拍照。運用Quantity One軟件計算分析各目的蛋白條帶和內參蛋白條帶的灰度比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量數據均用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用Turkey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷細胞存活率的影響MTT檢測發現，經不同濃度BDNF預處理能夠提高H9c2心肌細胞H/R損傷后的細胞存活率，與Control組相比，H/R組H9c2心肌細胞的存活率明顯下降（P＜0.05）；而經1、10、100 μg/L BDNF+H/R組，細胞存活率與H/R組相比均上升（均P＜0.05），并具有濃度效應；TrkB inhibitor組細胞存活率低于100 μg/L BDNF+H/R組（P＜0.05），見表1。

2.2 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷CK、LDH、MDA及SOD含量的影響與Control組相比，H/R組H9c2心肌細胞中CK、LDH漏出量和MDA含量均顯著增加，而SOD活性明顯下降（均P＜0.05）；與H/R組相比，1、10、100 μg/L BDNF+H/R組，除1 μg/L BDNF+H/R外各組的CK漏出量，各組的LDH漏出量和MDA含量均顯著下降，SOD活性均顯著上升（P＜0.05）；與100 μg/L BDNF+H/R組比較，TrkB inhibitor組CK、LDH漏出量和MDA含量增高，SOD活性降低（P＜0.05），但與H/R組相比無明顯變化，見表2。

Tab.1The effects of BDNF pre-treatment on the survival rate and apoptotic rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury表1 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷后細胞存活率和細胞凋亡率的影響（n=6，%）

Tab.1The effects of BDNF pre-treatment on the survival rate and apoptotic rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury表1 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷后細胞存活率和細胞凋亡率的影響（n=6，%）

**P＜0.01；a與Control組比較，b與H/R組比較，c與100 μg/L BDNF+H/R組比較，P＜0.05；表2、3同

組別C o n t r o l組H / R組1 μ g / L B D N F + H / R組1 0 μ g / L B D N F + H / R組1 0 0 μ g / L B D N F + H / R組T r k B i n h i b i t o r組F細胞存活率1 0 1 . 2 3 ± 1 . 3 3 5 2 . 4 6 ± 3 . 3 3 a 6 7 . 4 3 ± 2 . 8 9 b 7 5 . 5 4 ± 3 . 2 9 b 8 8 . 5 6 ± 4 . 2 3 b 5 7 . 9 2 ± 4 . 2 4 c 3 3 . 5 7 1 * *細胞凋亡率7 . 6 9 ± 1 . 4 6 4 1 . 9 4 ± 2 . 5 6 a 3 2 . 2 4 ± 2 . 5 2 b 2 2 . 3 7 ± 2 . 9 8 b 1 6 . 3 7 ± 2 . 5 4 b 4 6 . 4 3 ± 3 . 9 6 c 2 4 . 5 2 0 * *

Tab.2The effects of BDNF pre-treatment on the CK，LDH，MDA and SOD levels of H9c2 myocardial cells after H/R injury表2 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷后CK、LDH、MDA及SOD含量的影響（n=6）

Tab.2The effects of BDNF pre-treatment on the CK，LDH，MDA and SOD levels of H9c2 myocardial cells after H/R injury表2 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷后CK、LDH、MDA及SOD含量的影響（n=6）

組別C o n t r o l組H / R組C 0 1 1 μ g / L B D N F + H / R組1 0 μ g / L B D N F + H / R組1 0 0 μ g / L B D N F + H / R組T r k B i n h i b i t o r組F K（U / m L）. 7 9 ± 0 . 1 2 . 6 9 ± 0 . 2 2 a 1 . 3 3 ± 0 . 1 4 1 . 1 4 ± 0 . 1 9 b 0 . 8 9 ± 0 . 2 1 b 1 . 8 7 ± 0 . 1 8 c 8 . 3 3 3 * * L D H（U / m L）0 . 1 8 ± 0 . 0 4 0 . 7 6 ± 0 . 0 3 a 0 . 6 1 ± 0 . 0 4 b 0 . 4 6 ± 0 . 0 5 b 0 . 3 3 ± 0 . 0 4 b 0 . 6 8 ± 0 . 0 4 c 1 9 . 5 8 8 * *組別C o n t r o l組H / R組1 μ g / L B D N F + H / R組1 0 μ g / L B D N F + H / R組1 0 0 μ g / L B D N F + H / R組T r k B i n h i b i t o r組F M D A（m m o l / g p r o）2 . 4 7 ± 0 . 7 9 8 . 1 0 ± 1 . 1 5 a 6 . 5 9 ± 0 . 6 6 b 5 . 4 7 ± 0 . 4 8 b 4 . 1 2 ± 0 . 8 8 b 7 . 4 4 ± 0 . 9 2 c 1 1 . 5 5 9 * * S O D（U / m g p r o）1 6 3 . 4 8 ± 1 0 . 2 3 4 4 . 3 1 ± 1 3 . 4 8 a 7 6 . 4 5 ± 8 . 9 4 b 1 0 2 . 5 2 ± 6 . 9 7 b 1 4 3 . 5 8 ± 7 . 5 9 b 5 5 . 6 8 ± 9 . 2 2 c 2 9 . 8 9 3 * *

2.3 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷細胞凋亡率的影響與Control組相比，H9c2心肌細胞

H/R后細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與H/R組相比，1、10、100 μg/L BDNF+H/R組，細胞凋亡率卻逐漸降低（均P＜0.05）；TrkBinhibitor和100μg/L的BDNF同時作用后H/R，細胞凋亡率未見明顯下降，但明顯高于100μg/LBDNF+H/R組（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 The cell apoptosis of H9c2 myocardial cells tested by flow cytometry圖1 流式細胞術檢測H9c2心肌細胞凋亡

2.4 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷細胞TrkB、Bcl-2及Bax表達的影響與Control組相比，H/R組TrkB表達未見明顯變化，Bcl-2表達明顯下降，Bax表達明顯升高（均P＜0.05）；1、10、100 μg/L BDNF預處理H9c2心肌細胞后H/R，TrkB、Bcl-2表達升高，Bax表達下降（均P＜0.05）；與100 μg/L BDNF+H/R組比較，TrkB inhibitor組TrkB、Bcl-2表達降低，Bax表達升高（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2The expression of TrkB，Bcl-2 and Bax tested by Western blot assay圖2 Western-blot檢測TrkB、Bcl-2和Bax表達

Tab.3The effects of BDNF pre-treatment on expressions of TrkB，Bcl-2 and Bax protein in H9c2 myocardial cells after H/R injury表3 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷后TrkB、Bcl-2和Bax表達的影響（n=6，）

Tab.3The effects of BDNF pre-treatment on expressions of TrkB，Bcl-2 and Bax protein in H9c2 myocardial cells after H/R injury表3 BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷后TrkB、Bcl-2和Bax表達的影響（n=6，）

組別C o n t r o l組H / R組1 μ g / L B D N F + H / R組1 0 μ g / L B D N F + H / R組1 0 0 μ g / L B D N F + H / R組T r k B i n h i b i t o r組F T r k B / β -a c t i n 0 . 2 8 ± 0 . 0 4 0 . 2 5 ± 0 . 0 3 0 . 4 7 ± 0 . 0 5 b 0 . 7 5 ± 0 . 0 5 b 0 . 8 8 ± 0 . 0 4 b 0 . 3 3 ± 0 . 0 6 c 5 . 2 3 5 * * B c l -2 / β -a c t i n 0 . 6 8 ± 0 . 0 4 0 . 2 6 ± 0 . 0 3 a 0 . 3 5 ± 0 . 0 3 b 0 . 4 7 ± 0 . 0 4 b 0 . 6 4 ± 0 . 0 5 b 0 . 3 8 ± 0 . 0 4 c 9 . 2 5 3 * * B a x / β -a c t i n 0 . 1 7 ± 0 . 0 3 0 . 5 2 ± 0 . 0 4 a 0 . 3 8 ± 0 . 0 3 b 0 . 2 5 ± 0 . 0 4 b 0 . 1 5 ± 0 . 0 5 b 0 . 5 4 ± 0 . 0 4 c 1 1 . 5 5 5 * *

3 討論

缺血性心臟病是心血管系統中發病率及死亡率較高的疾病，臨床上多開展血管成形術、冠狀動脈介入術等進行治療，但恢復冠狀動脈血流灌注后，常引發心肌組織I/R損傷［6］。因此，如何有效保護缺血心肌細胞，減輕心肌細胞I/R損傷是目前研究的重點。近年研究表明BDNF能夠在心肌損傷后改善心肌微循環方面起到重要作用［7］，但其具體機制及能否在心肌組織I/R損傷修復保護中發揮作用尚未知。有研究顯示I/R觸發細胞內產生大量活性氧自由基，誘導心肌細胞凋亡，是I/R損傷的主要原因之一［8］。本研究利用H9c2心肌細胞構建H/R損傷模型模擬心肌缺血再灌注，研究發現BDNF預處理H9c2心肌細胞后H/R能夠提高其細胞存活率并具有濃度效應，說明BDNF預處理能夠減輕心肌細胞H/R損傷。

目前認為，心肌組織I/R損傷與其抗氧化應激系統受損有關，I/R過程誘導氧自由基的產生使細胞中過氧化物增多，可使細胞結構和功能受損，甚至發生凋亡［9］。CK作為心肌細胞胞內酶，其漏出量反映心肌細胞受損程度［10］，而LDH也可作為心肌細胞受損傷的指標，反映細胞功能變化和細胞膜的受損程度［11］。本研究中H9c2心肌細胞H/R損傷后，CK和LDH漏出量均明顯增加，說明H/R能夠損傷心肌細胞，影響細胞功能和膜結構完整性。當BDNF預處理后H/R，細胞內CK、LDH漏出量均降低，說明BDNF能夠對H9c2心肌細胞發揮保護作用，并維持H/R損傷后心肌細胞的膜結構完整性和功能。MDA作為機體脂質過氧化反應終產物，能夠反映心肌細胞受氧自由基損傷的程度，而SOD作為抗氧化酶，其活性高低反映機體抗氧化能力［12］。本研究中H9c2心肌細胞H/R損傷后，細胞中MDA含量上升而SOD活性下降，表明心肌細胞H/R損傷后其抗氧化系統嚴重受損導致抗氧化能力下降。而不同濃度

BDNF預處理H9c2心肌細胞后再H/R，細胞內MDA含量能夠逐漸下降，SOD活性逐漸上升，說明BDNF能夠通過提升心肌細胞抗氧化和清除氧自由基的能力以減輕H/R損傷。

在對離體灌流大鼠心臟組織研究中發現，再灌注早期會發生心肌細胞的凋亡，而Bcl-2和Bax參與心肌細胞凋亡［13］。本研究顯示BDNF預處理H9c2心肌細胞后H/R，細胞凋亡率明顯降低，即BDNF預處理能夠通過降低細胞凋亡率，減輕H9c2心肌細胞H/R損傷，同時BDNF預處理后H/R，H9c2心肌細胞中Bcl-2表達升高，Bax表達下降，說明BDNF預處理可通過調控Bcl-2和Bax表達發揮降低H/R損傷后凋亡的作用。TrkB是BDNF的功能性受體，BDNF和TrkB結合后，受體通過二聚體化及胞內激酶特異性酪氨酸磷酸化而激活，介導下游信號傳導，發揮各種生理作用［14］。BDNF-TrkB通路不僅在神經系統發育和功能中發揮重要作用，而且能夠介導心臟微血管內皮細胞增殖和存活，在心肌血管新生過程中扮演重要角色［15］。本研究發現，隨著BDNF預處理濃度的升高，H/R后H9c2心肌細胞中TrkB的表達量也隨之升高；當高濃度BDNF作用同時加入TrkB inhibitor，與BDNF單獨作用組相比，其H/R損傷后細胞存活率降低，CK、LDH漏出量和MDA含量均升高，而SOD活性降低，且細胞凋亡率升高，說明BDNF預處理對H9c2心肌細胞H/R損傷發揮的作用可能通過與TrkB受體結合激活BDNF-TrkB信號通路發揮作用。

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（2015-05-18收稿 2015-07-16修回）

（本文編輯 李國琪）

BDNF reduces the hypoxia/reoxygenation injury of H9c2 myocardial cells

WANG Shicai，CHEN Taijun，HUANG Meisong，ZHU Shaoming△
Department of Internal Medicine，Shiyan Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine，Shiyan，Hubei 442000，China△

ObjectiveTo investigate the effects of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）pretreatment on H9c2 myocardial hypoxia/reoxygenation（H/R）injury，and explore its mechanism.MethodsThe H9c2 myocardial cells were cul?tured in vitro and（95%O2+5%CO2）oxygen cultured 12 h after（95%N2+5%CO2）hypoxia cultured 4 h to establish the H/R model.The cells were divided into normal control group，H/R group，different concentrations（1，10，100 μg/L）BDNF pre?

brain-derived neurotrophic factor；myocytes，cardiac；cell hypoxia；receptor，trkB；oxidative stress；apop?tosis；hypoxia/reoxygenation injury

R363

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.011

湖北省十堰市中西醫結合醫院內科（郵編442000）

王詩才（1971），男，副主任醫師，主要從事心血管疾病病理基礎與臨床研究

△通訊作者E-mail：zhusaoming@163.com

treatment in H/R groups and TrkB-inhibitor group（with 100 μg/L BDNF and 1∶1 000 TrkB inhibitor pre-treatment in H/R group）.The cell survival rate was measured by MTT method in different groups.The lactate dehydrogenase（LDH），creatine kinase（CK），malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）content and activity were detected after H/R injury. The apoptotic rate of H9c2 myocardial cells were detected by flow cytometry，and the expressions of TrkB，Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot assay.ResultsCompared with the normal control group，the survival rate of H9c2 myocardial cells was decreased significantly in H/R model group（P＜0.05），LDH，CK and MDA contents were increased and SOD activity was decreased（P＜0.05）.The cell apoptosis rate was increased significantly（P＜0.05）.The anti-apoptosis Bcl-2 protein expression was decreased，pro-apoptosis Bax protein expression was increased in H/R model group（P＜0.05）. Compared with the H/R model group，the cell survival rates of H9c2 myocardial cells were increased after pre-treatment with different concentrations of BDNF（P＜0.05）；LDH，CK and MDA contents were decreased and SOD activity were in?creased respectively（P＜0.05）.The cell apoptotic rates were decreased（P＜0.05）.The expressions of TrkB receptor and Bcl-2 protein gradually increased，while the expression of Bax protein was gradually decreased（P＜0.05）.The role of BDNF was inhibited by TrkB inhibitor.ConclusionBDNF pre-treatment can promote the cell survival rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury，which plays a protective role by inhibiting the cell apoptotic rate and maintaining antioxidant capacity，and associates with BDNF-TrkB signaling pathways.