枸杞多糖通過誘導巨噬細胞極化抗胰腺癌的研究

楊青，白光，王巍，包翠芬，翟振華

枸杞多糖通過誘導巨噬細胞極化抗胰腺癌的研究

楊青1，白光2△，王巍2，包翠芬1，翟振華2

目的探討枸杞多糖（LBP）通過誘導巨噬細胞極化成一型巨噬細胞（M1）抗小鼠胰腺癌細胞LTPA的功效。方法構建小鼠CB-17SCID皮下LTPA成瘤模型，隨機分為荷瘤模型組（10只）及LBP治療組（10只），LBP治療組每日10 mg/kg LBP灌胃，荷瘤模型組每日同等劑量的生理鹽水灌胃。將含有相同數量的小鼠巨噬細胞Raw264.7隨機分為不同LBP濃度的實驗組和對照組，MTT法檢測各實驗組與對照組中Raw264.7的光密度（OD）值；ELISA法檢測LBP質量濃度為100 mg/L的實驗組與對照組中Raw264.7分泌白細胞介素（IL）-12及IL-10的水平；流式細胞儀檢測LBP質量濃度為100 mg/L的實驗組與對照組中Raw264.7表面蛋白CD16/32及CD206的水平。小鼠荷瘤3周后剖瘤稱質量并計算瘤體體積，檢測LBP對皮下腫瘤生長的影響，HE染色和KI-67免疫組化法檢測LBP對瘤組織鏡下的改變及對LTPA增殖的影響。結果100 mg/L LBP對Raw264.7的生長有明顯促進作用（P＜0.01），并使Raw264.7高表達CD16/32，低表達CD206；高分泌IL-12、低分泌IL-10。LBP治療組瘤塊質量、體積及KI-67的表達量顯著低于荷瘤模型組（P＜0.01），鏡下腫瘤壞死區范圍明顯大于荷瘤模型組。結論LBP能夠通過誘導巨噬細胞極化成M1狀態達到抗LTPA的作用。

巨噬細胞；胰腺腫瘤；枸杞多糖；巨噬細胞極化；抗胰腺癌；1型巨噬細胞；2型巨噬細胞

胰腺癌是我國主要的惡性腫瘤之一［1］，具有起病隱匿、手術切除率低、放化療不敏感、病死率高、預后差的特點。因此，亟待尋求一種新的、放化療不良反應小、較高效的治療藥物。枸杞多糖（lycium bar?barum polysaccharide，LBP）是枸杞中重要的有效成分，具有調節免疫、抗腫瘤等作用［2］。雖已有文獻報道LBP具有多種免疫調節作用［3］，且能夠對抗多種腫瘤的生長［4］，但對巨噬細胞Raw264.7極化影響的研究及抗胰腺癌的作用報道尚少。本實驗通過檢測LBP作用于Raw264.7后細胞數量及其極化水平的變化，以及體內LBP抗小鼠胰腺癌細胞LTPA的研究，旨在探討LBP在體內抗LTPA的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑LBP購自上海康州真菌多糖有限公司（檢驗批號：KZ20130916），呈棕黃色粉末，可溶于水。小鼠白細胞介素（IL）-12、IL-10 ELISA試劑盒購自美國R&D公司。PerCP標記的小鼠CD16/32抗體，FITC標記的小鼠CD206抗體均購自Bio Legend公司。抗體KI-67蛋白、PV6001試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。DMEM、RPMI-1640培養基、新生小牛血清購自Gibco、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司。其他實驗試劑均由遼寧醫學院附屬第一醫院腫瘤中心實驗室提供。

1.1.2 細胞株與實驗動物小鼠胰腺癌細胞株LTPA購自上海拜力生物公司。小鼠巨噬細胞Raw264.7購自北京鼎國生物科技有限公司。健康SPF級CB-17SCID小鼠20只，雌雄各半，5周齡，體質量16～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司［許可證號：SCXK（京）2014-0004］。

1.1.3 主要儀器及設備超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），高速冷凍離心機（Sigma公司），流式細胞儀（BD FACS Verse），酶標儀（Bio-Rad美國），光學顯微鏡、石蠟切片機（Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥將處于對數生長期的LTPA調成1×107個/mL的單細胞懸液，75%乙醇消毒小鼠左腋窩下1 cm處皮膚并于該處皮下種于0.2 mL細胞懸液。隨即將20只小鼠按隨機數字表法分為荷瘤模型組和LBP治療組，每組10只。接種24 h后LBP治療組每天以10 mg/kg［2］LBP的劑量灌胃0.5 mL，荷瘤模型組則每日灌胃0.5 mL生理鹽水，連續21 d，第22天處死小鼠后實驗。

1.2.2 MTT法檢測LBP對Raw264.7生長的影響取對數生長期的Raw264.7，用DMEM完全培養液將細胞調成2× 105/mL懸液，向96孔板中加入細胞懸液100 μL/孔，待細胞附壁，棄去上清液后隨機分為實驗組和對照組，向實驗孔順次加入過濾無菌的LBP質量濃度為10、50、80、100、150、200 mg/L的DMEM完全培養液100 μL，構成不同LBP質量濃度的實驗組，向對照孔加入相同體積的DMEM完全培養液，構成

對照組。每個劑量設置4個復孔。常規培養48 h后加入10 μL的MTT溶液（5 g/L），重置培養箱培養4 h后，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，于490 nm波長處測取光密度（OD）值。

1.2.3 LBP對Raw264.7分泌及表面蛋白的影響將Raw264.7接種到6孔板后（1×106個/孔），隨機分為實驗組及對照組，待細胞附壁后，棄去上清液，實驗組加入含100 mg/L LBP的DMEM完全培養液，對照組加入同等體積的DMEM完全培養液，常規培養48 h。（1）48 h后，取2組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定IL-10及IL-12含量。（2）48 h后，收集2組貼壁細胞，經預冷PBS洗滌，2%多聚甲醛室溫固定，PBS復洗后調整每組細胞數為1×106個/流式管，加入相應熒光標記抗體，室溫避光孵育，用含1%血清的PBS洗滌后流式細胞儀檢測表面蛋白的變化。

1.2.4 LBP對皮下腫瘤生長的影響將小鼠頸椎脫臼處死，鈍性分離皮下腫瘤，用生理鹽水洗凈瘤塊，濾紙吸干后稱取瘤質量，游標卡尺測算體積，計算抑瘤率。瘤塊體積=1/2×瘤塊長徑A（mm）×瘤塊橫徑B（2mm）。抑瘤率（%）=（［模型對照組平均瘤質量-LBP治療組平均瘤質量）/模型對照組平均瘤質量］×100%。

1.2.5 瘤塊組織病理學檢查切取部分瘤塊組織，用體積分數為4%的多聚甲醛固定過夜，常規石蠟包埋后行HE染色。

1.2.6 免疫組化法檢測瘤塊中KI-67的表達切取LBP治療組、荷瘤模型組瘤塊，經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片機切片（5 μm），二甲苯脫蠟，高壓加熱修復抗原，過氧化氫（H2O2）封閉及PBS沖洗后于每張切片中滴加適當比例稀釋的KI-67抗體，經4℃孵育過夜后，滴加適量二抗，最后行DAB顯色，鏡下控制反應時間，自來水終止顯色，蘇木素復染，乙醇梯度脫水后封片、固定。用已知的陽性標本作為陽性對照，PBS替代一抗作為陰性對照。采用CIAS圖像分析系統檢測陽性蛋白表達的平均灰度。

1.3 統計學方法實驗數據用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，各指標用表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組之間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LBP對Raw264.7生長的影響經不同濃度的LBP作用48 h后，各實驗孔Raw264.7數量較對照組均有所提升，但100 mg/L LBP組細胞數量較對照組差異明顯（n=5，F=3.073，P＜0.05）。見圖1、2。

Fig.1The influence of different concentrations of LBP in the growth of Raw264.7圖1 不同質量濃度LBP對Raw264.7生長的影響

Fig.2The influence of 100 mg/L LBP in the growth of Raw264.7圖2 100 mg/L LBP對Raw264.7生長的影響

2.2 LBP對Raw264.7分泌IL-12及IL-10的影響經100 mg/L LBP作用48 h后的Raw264.7較對照組能夠顯著提高IL-12水平［（83.00±4.01）μg/L vs（50.06±6.74）μg/L，t=9.420，P＜0.01］，但IL-10的分泌水平較對照組顯著下降［（407.13±12.02）μg/L vs（633.67±19.09）μg/L，t=22.456，P＜0.01］。

2.3 LBP對Raw264.7表面蛋白CD16/32及CD206表達的影響經100 mg/L的LBP作用48 h后的Raw264.7較對照組高表達CD16/32，而較低表達CD206，見圖3。

Fig.3The influence of LBP in surface proteins of Raw264.7圖3 LBP對Raw264.7表面蛋白的影響

2.4 LBP對皮下腫瘤生長的作用LBP治療組皮下瘤體質量及體積明顯小于荷瘤模型組［（1.14± 0.23）g vs（2.06±0.19）g，t=9.871，P＜0.01；（181.50± 13.05）mm3vs（386.10±14.09）mm3，t=33.680，P＜0.01］，LBP抑瘤率為44.7%，見圖4。

Fig.4The influence of LBP in subcutaneous tumor growth圖4 LBP對皮下腫瘤生長的影響

2.5 瘤塊組織病理學檢查荷瘤模型組腫瘤細胞密度較大，排列緊密，增長旺盛，異型性明顯。LBP治療組腫瘤細胞密度不同程度的減小，腫瘤壞死程度較荷瘤模型組亦較明顯，同時部分區域可見淋巴細胞、單核細胞浸潤及纖維組織增生。見圖5。

2.6 LBP對腫瘤組織中KI-67表達的影響KI-67

蛋白主要表達于細胞核，呈棕黃色顆粒。荷瘤模型組腫瘤組織中KI-67的陽性細胞較多，表達率為60%；LBP治療組KI-67的陽性細胞明顯減少，表達率為20%。見圖6。

3 討論

3.1 LBP對Raw264.7的作用本研究顯示，當質量濃度為100 mg/L的LBP于體外作用于Raw264.7細胞48 h后，Raw264.7的細胞數量顯著多于對照組，表明LBP具有促進Raw264.7分裂增殖的作用。研究表明巨噬細胞按照其表型及分泌的細胞因子可分為經經典途徑激活的巨噬細胞（M1）和經替代途徑激活的巨噬細胞（M2）［5-6］。具有特異性表面蛋白標志物CD16/32的M1［7-8］，抗原呈遞能力強，能夠分泌大量的IL-12［9］。IL-12能夠在介導Th1免疫效應中發揮作用，從而刺激輔助T細胞的增殖，發揮抗炎抗腫瘤的作用［10-11］。而具有特異性表面蛋白標志物CD206的M2［7-8］，抗原提呈能力弱，能夠分泌大量的IL-10［9］。IL-10能抑制單核細胞主要組織相容性復合體（MHC）Ⅱ依賴的抗原提呈、Th1免疫效應細胞因子的合成和T淋巴細胞的合成，造成Th1細胞及其細胞因子比例減少，常導致腫瘤細胞免疫逃逸，致使腫瘤發生［11-12］。巨噬細胞在特定的組織環境下可處于M1和M2的任一中間階段，而巨噬細胞向M1及M2分化的過程稱為極化（polarization），該極化過程具有可逆性及可調節性［13］。本研究顯示，當質量濃度為100 mg/L的LBP作用于Raw264.7細胞48 h后，Raw264.7表面蛋白CD16/32的表達量及IL-12的分泌水平較對照組明顯增加，而CD206的表達量及IL-10的分泌水平較對照組則明顯降低，表明LBP能夠促進巨噬細胞由M2的極化狀態向M1的極化狀態轉變，進而有助于促進巨噬細胞發揮抗炎及抗腫瘤的作用。

3.2 LBP對皮下LTPA的影響研究表明LBP具有調節免疫及抗腫瘤的作用。本實驗顯示，給予皮下荷LTPA的小鼠以10 mg/（kg·d）的劑量連續灌胃LBP 21 d后，可見皮下瘤塊的體積及質量較荷瘤模型組明顯變小；與荷瘤模型組廣泛的腫瘤壞死區比較，腫瘤細胞的密度也明顯降低；KI-67染色后陽性細胞的數量也較荷瘤模型組顯著減少。表明經LBP灌胃治療后，LTPA的增殖受到了明顯的抑制，腫瘤區壞死范圍明顯增加，起到了抗腫瘤生長的作用。

綜上所述，LBP不僅能夠提升巨噬細胞Raw264.7的數量，而且能夠調定其極化狀態，從而使M1的數量增加，增強了機體的免疫活性，從而達到抗腫瘤生長的作用。LBP通過巨噬細胞的極化達到抗腫瘤的效用可能成為LBP治療腫瘤的一個新靶點而逐步受到重視。

（圖5、6見插頁）

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（2015-3-20收稿 2015-07-06修回）

（本文編輯 李鵬）

Anti-tumor effects of lycium barbarum polysaccharide on pancreatic cancer cells by polarization of macrophages

YANG Qing1，BAI Guang2△，WANG Wei2，BAO Cuifen1，ZHAI Zhenhua2
1 Department of Human Anatomy&Histology and Embryology，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2 The First Affiliated Hospital，Liaoning Medical College△

ObjectiveTo explore the effects of lycium barbarum polysaccharide（LBP）on restraining the mouse pancre?atic cancer cells LTPA by the polarization of macrophages to type 1 macrophages（M1）.MethodsLTPA tumor model of the subcutaneous CB-17SCID mice was constructed.Model mice were randomly divided into tumor-bearing model group（n=10）and LBP treatment group（n=10）.The LBP treatment group was fed 10mg/kg LBP every day，and the tumor-bearing model group was fed the same dose of normal saline.The same amount of macrophages Raw264.7 was randomly divided into the control group and experimental groups（different concentrations of LBP）.MTT assay was used to detect the optical density（OD）of Raw264.7 in experimental groups and control group.ELISA was used to detect the levels of the interleukin（IL）-12 and IL-10 in experimental group（LBP was 100 mg/L）and the control group.Flow cytometry was used to test the levels of the membrane protein CD16/32 and CD206 in experimental group（LBP was 100 mg/L）and the control group.The tumor mass was weighted and the volume was calculated after three weeks.The effects of LBP on the growth of subcutaneous tumor were detected.HE staining and KI-67 staining were used to detect the microscopic changes of tumor and the proliferation of the LTPA.ResultsThe dose of 100 mg/L LBP can promote the growth of the macrophages Raw264.7（P＜0.01），and induced the high expression of CD16/32 and low expression of CD206，high secretion of IL-12 and low secretion of IL-10.The weight，volume of the tumor and the expression of KI-67 were significantly lower in experimental group than those in the con?trol group（P＜0.01）.The microscopic necrosis area range of tumor was larger than that of control group.ConclusionThe LBP has the effect of restraining LTPA by the polarization of macrophages to M1.

macrophages；pancreatic neoplasms；lycium barbarum polysaccharide；the polarization of macrophages；an?ti-tumor about pancreatic cells；type 1 macrophages；type 2 macrophages

R285.5；R735.9

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.018

吳階平醫學基金項目（320.6750.1281）；遼寧省工業企業科技特派員行動項目

1遼寧錦州，遼寧醫學院人體解剖與組織胚胎學教研室（郵編121000）；2遼寧醫學院附屬第一醫院

楊青（1988），男，碩士研究生在讀，住院醫師，主要從事肝膽外科腫瘤方面的研究

△通訊作者E-mail：blueskydavid@163.com