口腔鱗狀細胞癌中FEZ1和HIF-1α蛋白表達及預后研究

張晉弘，劉俊英，劉健，劉月平△

口腔鱗狀細胞癌中FEZ1和HIF-1α蛋白表達及預后研究

張晉弘1，劉俊英2，劉健3，劉月平2△

目的探討抑癌基因FEZ1和缺氧誘導因子（HIF）-1α在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中的表達及其與臨床病理特征及預后的關系。方法選取OSCC組織標本146例，正常黏膜組織標本80例，同時選取新鮮OSCC組織、癌旁組織和正常黏膜組織各30例。免疫組化法檢測146例組織標本和80例正常黏膜組織中FEZ1和HIF-1α表達，分析二者表達與患者臨床病理特征及預后的關系。Western blot檢測30例新鮮OSCC組織及其對應癌旁組織、正常黏膜組織中FEZ1和HIF-1α表達情況。結果146例OSCC組織FEZ1蛋白陽性表達率（30.14%）低于正常口腔黏膜組織（81.25%），HIF-1α蛋白陽性表達率（71.23%）高于正常黏膜組織（12.50%，χ2分別為54.076和71.317，均P＜0.01）。146例OSCC中FEZ1的表達水平與臨床分期、腫瘤直徑、分化程度有關，HIF-1α的表達水平與性別、淋巴結轉移、腫瘤直徑、分化程度有關。FEZ1α蛋白陽性表達與陰性表達患者5年生存率差異無統計學意義，而HIF-1α蛋白陽性表達者5年生存率低于陰性表達患者（P＜0.05）。30例正常口腔黏膜組織、癌旁組織及OSCC組織中，FEZ1表達水平依次降低（P＜0.01），HIF-1α表達水平依次升高（P＜0.01）。結論FEZ1和HIF-1α可能參與了OSCC的發生、發展，檢測FEZ1和HIF-1α表達可作為OSCC生物學行為的參考指標之一。

口腔鱗狀細胞癌；FEZ1；缺氧誘導因子-1α；免疫組織化學；蛋白免疫印跡；臨床特征；生存分析

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔黏膜較常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響人類健康及生活質量。抑癌基因FEZ1（Fascicula?tion and Elongation protein Zeta-1）是食管癌的潛在抑癌基因，位于人類染色體8p22的D8S261位點附近的雜合性缺失區域［1］。研究發現該基因的低表達可促進惡性腫瘤的增殖和進展［2］。缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible Factor-1α，HIF-1α）是在缺氧條件下廣泛存在于人體細胞內的核轉錄因子，在細胞缺氧信號轉導與調控途徑中處于核心地位。目前關于FEZ1和HIF-1α在OSCC中表達研究較少，本文擬通過檢測FEZ1和HIF-1α在OSCC中的表達水平，探討其在OSCC進展中所起作用，為臨床診治提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源選取河北醫科大學第四醫院病理科2009年12月—2011年12月手術切除的OSCC石蠟標本切片146例。其中男80例，女66例；年齡＜50歲42例、≥50歲104例；鱗狀細胞癌分級高、中、低分化分別為51例、63例、32例。所有患者均經手術治療，術前未經任何治療且均有完整的病理資料和隨訪資料，隨訪時間為手術日至末次隨訪日2014年12月31日或死亡日。選取同期80例正常口腔黏膜組織石蠟標本切片作為對照。所有切片均在我院病理專家指導下進行鱗狀細胞癌分級復診。另收集2014年1月—2015年1月手術切除的30例OSCC新鮮組織，同時留取其癌旁組織，并選取30例非癌患者的正常口腔黏膜組織作為對照。

1.2 試劑兔抗人FEZ1、HIF-1α多克隆抗體，通用辣根酶標記抗生物素IgG抗體，β-actin單克隆抗體，PVDF膜均購自美國Santa Cruz公司。考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。SP免疫組化試劑盒、PBS緩沖液、ECL顯色試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色146例OSCC組織和80例正常口腔黏膜組織石蠟標本制成4 μm切片后常規脫蠟至水，抗原修復后按照說明書步驟進行免疫組化染色，顯微鏡下觀察切片。結果判定標準：FEZ1主要定位于胞漿，呈淡黃色至棕褐色顆粒。HIF-1α主要定位于細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒［2-3］。結合陽性細胞著色強度與陽性細胞百分比進行半定量，著色強度：無色計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性細胞百分比≤10%計1分，10%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。兩者得分乘積：0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。（+）、（++）、（+++）判為陽性，若陽性細胞百分比≤10%即判為陰性。

1.4 Western blot取-80℃保存的30例OSCC、癌旁及正常口腔黏膜組織各100 mg放入含PMSF裂解液的研磨器中充分研磨，靜置40 min后4℃離心，取上清，Bradford法測定蛋白濃度。每個樣品取100 μg總蛋白行SDS-PAGE，電泳后轉膜，5%脫脂奶粉于37℃封閉2 h。分別加入兔抗人FEZ1（1∶1 000）和兔抗人HIF-1α（1∶1 000），4℃過夜，以β-actin為內參，次日加入辣根過氧化酶標記二抗（1∶10 000），室溫搖床孵育2 h。TBST洗膜后，ECL化學發光顯色。凝膠成像系統進行灰度值測定及半定量分析。

1.5 統計學方法采用SPSS 13.0進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料以例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗；采用Kaplan-Meier法計算生存率及繪制生存曲線，Log-Rank時序檢驗比較生存率差異，生存時間按年計算，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果FEZ1在OSCC細胞質中呈中等強度表達，其陽性表達率較正常口腔黏膜組織降低（P＜0.01）；HIF-1α蛋白在OSCC細胞核中高表達，其陽性表達率高于正常黏膜組織（P＜0.01），見圖1，表1。

Tab.1The positive rates of FEZ1 and HIF-1α in OSCC and normal oral mucosa表1 不同組織中FEZ1和HIF-1α陽性表達率比較例（%）

2.2 FEZ1和HIF-1α表達與OSCC臨床病理參數間的關系146例OSCC患者中，不同臨床分期、腫瘤直徑、分化程度間FEZ1表達陽性率差異有統計學意義（P＜0.05）。臨床分期越低，腫瘤直徑越小，分化程度越高，FEZ1表達陽性率較高。不同性別、臨床分期、有無淋巴結轉移、腫瘤直徑、分化程度間HIF-1α表達陽性率差異有統計學意義（P＜0.05）。其中男性高于女性，臨床分期越高，存在淋巴結轉移，腫瘤直徑越大，分化程度越低，HIF-1α陽性表達率較高，見表2。

2.3 FEZ1和HIF-1α蛋白表達與OSCC5年生存率間的關系FEZ1表達陽性組5年生存率81.8%（36/ 44）與陰性組69.6%（71/102）差異無統計學意義（χ2= 2.989，P＞0.05）；HIF-1α表達陽性組5年生存率68.3%（71/104）低于陰性組90.5%（38/42），差異有統計學意義（χ2=5.077，P＜0.05）見圖2。

2.4 Western Blot結果正常口腔黏膜組織、癌旁組織和OSCC組織中，FEZ1蛋白表達水平依次降低，HIF-1α蛋白表達水平依次升高，差異有統計學意義（P＜0.05）見圖3、表3。

Tab.2The relationship between expressions of FEZ1 and HIF-1α and clinical pathological features表2 FEZ1和HIF-1α蛋白陽性表達率與臨床病理特征的關系例（%）

Fig.2Kaplan-Meier survival curves of HIF-1α and FEZ1圖2 HIF-1α和FEZ1不同表達情況患者Kaplan-Meier生存曲線分析

Fig.3The expressions of FEZ1 and HIF-1α protein in different tissues圖3 FEZ1和HIF-1α蛋白在不同組織中的表達

Tab.3Comparison of expressions of FEZ1 and HIF-1 protein between different tissues表3 不同組織中FEZ1和HIF-1α蛋白的表達水平比較（n=30）

Tab.3Comparison of expressions of FEZ1 and HIF-1 protein between different tissues表3 不同組織中FEZ1和HIF-1α蛋白的表達水平比較（n=30）

**P＜0.01；a與正常黏膜組織比較，b與癌旁組織比較，P＜0.05

組別正常黏膜組織癌旁組織O S C C組織F F E Z 1 4 . 6 8 ± 0 . 1 4 3 . 6 3 ± 0 . 1 3 a 1 . 2 6 ± 0 . 2 3 a b 3 0 8 5 . 4 0 3 * * H I F -1 α 0 . 1 2 ± 0 . 0 4 0 . 2 2 ± 0 . 0 3 a 0 . 3 0 ± 0 . 0 4 a b 2 1 1 . 2 4 3 * *

3 討論

目前認為OSCC的危險因素包括強致癌物的持續刺激、口腔黏膜長期病損、口腔常見疾病反復存在及遺傳因素等［4］。了解OSCC的分子水平特征有助于揭示OSCC治療和預后的分子基礎，為探索腫瘤的及早防治提供新的思路。FEZ1為抑癌基因，其主要功能包括抑制腫瘤細胞生長，調節細胞有絲分裂及神經細胞生長，調節參與細胞運輸的驅動蛋白與微管蛋白［5］。研究發現FEZ1在膀胱移行細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝細胞癌及卵巢腺癌組織中表達缺失或下調［6-9］。Zhou等［10］對160例結腸癌患者分析發現，FEZ1表達下調與腫瘤增殖活性升高和患者生存率降低密切相關。本研究發現FEZ1主要表達于OSCC細胞質，其在OSCC中的陽性表達率低于正常口腔黏膜組織，提示FEZ1的表達下調與OSCC發生有一定關系。其蛋白表達水平在正常口腔黏膜、癌旁組織、OSCC中依次降低，說明FEZ1蛋白在正常黏膜到OSCC的癌變過程中存在表達活性降低。

HIF-1α是介導細胞對缺氧微環境進行適應性反應的最關鍵的核轉錄調控因子，在胰腺癌［3］、肺癌和皮膚癌［11］等多種惡性腫瘤中均存在過度表達。HIF-1α的主要生物學效應包括促進血管形成，促進無氧糖酵解、細胞增殖，調節血管張力及機體對放、化療耐受等［12］。羅霞等［13］認為HIF-1α可作為口腔黏膜白斑癌變的重要標志物之一。本研究發現OSCC組織中HIF-1α的陽性表達率高于正常黏膜組織，其表達水平在正常口腔黏膜、癌旁組織、OSCC組織中依次升高，表明HIF-1α在口腔黏膜上皮癌變過程中有一定作用。

研究發現OSCC患者預后與腫瘤分化程度、增殖活性以及術前并發癥有關［14-15］。Wielscher等［16］發現，FEZ1基因上的5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）片段參與了早期乳腺上皮組織的癌變，其表達水平降低可增加乳腺表觀遺傳學癌變的風險。楊大江等［17］認為HIF-1α可能通過上調血管內皮生長因子C（VEGF-

C）表達來誘導機體淋巴管形成，并最終引起OSCC細胞發生區域淋巴結轉移。本實驗發現，FEZ1陽性表達率在Ⅰ-Ⅱ期高于Ⅲ-Ⅳ期患者，腫瘤直徑＜4 cm組高于腫瘤直徑≥4 cm組，高分化組高于中、低分化組；而HIF-1α陽性表達率與FEZ1相反，且無淋巴結轉移組低于轉移組，提示FEZ1在OSCC的浸潤和轉移中有抑制作用，而HIF-1α則起促進作用，說明FEZ1蛋白是一種保護性蛋白，可抑制OSCC的惡性轉化；而HIF-1α可促進OSCC的惡性進展。通過比較FEZ1和HIF-1α表達陽性組和陰性組的5年生存率發現，FEZ1表達陽性組與陰性組差異無統計學意義，而HIF-1α表達陽性組5年生存率明顯低于陰性組，提示HIF-1α可作為判斷OSCC患者生存率的指標之一，而FEZ1尚待擴大樣本進一步深入研究。

綜上，FEZ1和HIF-1α在OSCC發生、發展過程中具有重要作用，檢測FEZ1和HIF-1α表達情況可作為判斷OSCC生物學行為的參考指標之一。

（圖1見插頁）

［1］Ishii H，Baffa R，Numata SI，et al.The FEZ1 gene at chromosome 8p22 encodes a leucine-zipper protein and its expression is al?tered in multiple human tumors［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（7）:3928-3933.doi:10.1073/pnas.96.7.3928.

［2］Chen L，Zhu Z，Sun X，et al.Down-regulation of tumor suppressor gene FEZI/LZThS1 in breast carcinoma involves promoter methyla?tion and associates with metastasis［J］.Breast Cancer Res Treat，2009，116（3）:471-458.doi:10.1007/s10549-008-0147-6.

［3］Lyu HF，Ma BQ，Zhang S，et al.Stat3，HIF-l alpha and VEGF ex?pression and significance of Pancreatic cancer［J］.Qilu Med J，2014，29（3）:196-201.［呂海鋒，馬炳奇，張順，等.胰腺癌組織Stat3、HIF-1α與VEGF表達及意義［J］.齊魯醫學雜志，2014，29（3）: 196-201］.doi:10.13362/j.qlyx.201403003.

［4］Mirjalili N，Kheirollahi K.Correlation between chronic inflamma?tion and oral squamous cell carcinoma（OSCC）［J］.Oral Oncology，2014，50（10）:52.doi:10.1016/j.oraloncology.2014.07.005.

［5］Watanabe Y，Khodosevich K，Monyer H，et al.Dendrite develop?ment regulated by the schizophrenia-associated gene FEZ1 in?volves the ubiquitin proteasome system［J］.Cell Rep，2014，24，7（2）: 552-564.doi:10.1016/j.celrep.2014.03.022.

［6］Lin-Tsai O，Taylor JA，Clark PE，et al.Progress made in the use of animal models for the study of high-risk，nonmuscle invasive blad?der cancer［J］.Curr Opin Urol，2014，24（5）:512-516.doi:10.1097/ MOU.0000000000000087.

［7］Ma RH，Huang QY，Liu CG，et al.Study on correlation between FEZ1/LZTS1 gene and primary hepatocellular carcinoma［J］.Hainan Med J，2013，19（2）:148-151.［馬瑞宏，黃穎秋，劉彩剛，等.FEZ1/ LZTS1基因與原發性肝癌相關性研究［J］.海南醫學院學報，2013，19（2）:148-151］.doi:10.13210/j.cnki.jhmu.2013.02.039.

［8］Califano D，Pignata S，Pisano C，et al.FEZI/LZTS1 protein expres?sion in ovarian cancer［J］.Cell Physiol，2010，222（2）:382-386.doi: 10.1002/jcp.21962.

［9］Ono K，Uzawa K，Nakatsuru M，et al.Down-regulation of FEZ1/ LZTS1 gene with frequent loss of heterozygosity in oral squamous cell carcinomas［J］.Int J Oncol，2003，23（2）:297-302.doi:10.3892/ ijo.23.2.297.

［10］Zhou W，He MR，Jiao HL，et al.The tumor-suppressor gene LZTS1 suppresses colorectal cancer proliferation through inhibition of the AKT-mTOR signaling pathway［J］.Cancer Letters，2015，360（1）:68-75.doi:10.1016/j.canlet.2015.02.004.

［11］Mavrofrydi O，Mavroeidi P，Papazafiri P，et al Comparative assess?ment of HIF-1α and Akt responses in human lung and skin cells ex?posed to benzo［α］pyrene:Effect of conditioned medium from preexposed primary fibroblasts［J］.Environ Toxicol，2015，2（10）: 22119.doi:10.1002/tox.22119.

［12］Guo Y，Meng X，Ma J，Zheng Y，et al.Human papillomavirus 16 E6 contributes HIF-1α induced Warburg effect by attenuating the VHL-HIF-1α interaction［J］.Int J Mol Sci，2014，15（5）:7974-7986.doi:10.3390/ijms15057974.

［13］Luo X，Zhou JX，Chen HZ.Study on relationship between HIF-1a and malignant transformation of oral leukoplakia［J］.China Modern Doctor，2014，52（5）:28-30.［羅霞，周景喜，陳華志.HIF-1α與口腔白斑癌變的相關性研究［J］.中國現代醫生，2014，52（5）:28-30］.

［14］Kono T，Takahashi Y，Kawamura K，et al.Size change and Ki67-positive rate of latent-metastatic nodes in OSCC［J］.Oral Surgery，Oral Medicine，Oral Pathology and Oral Radiology，2013，116（3）: 200.doi:10.1016/j.oooo.2013.05.039.

［15］Xiao R，Li H，Xi Q，et al.Influence of age and preoperative compli?cations on occurrence of postoperative complications in elderly pa?tients with oral cancer［J］.Med J Chin PLA，2015，40（1）:56-59.［肖瑞，李華，席慶，等.年齡及術前合并癥對口腔癌患者術后并發癥的影響［J］.解放軍醫學雜志，2015，40（1）:56-59］.doi:10.11855/j. issn.0577-7402.2015.01.12.

［16］Wielscher M，Liou W，Pulverer W，et al.Cytosine 5-hydroxymethyl?ation of the LZTS1 gene is reduced in breast cancer［J］.Transl On?col，2013，6（6）:715-721.doi:10.1593/tlo.13523.

［17］Yang DJ，Hao XM，Yang XH.HIF-1α expression correlates with VEGF-C expression and lymphangiohenesisis in OSCC［J］.Oral Sci?ence Research，2014，30（2）:159-162.［楊大江，郝曉鳴，楊新華.口腔鱗狀細胞癌組織中HIF-1α，VEGF-C的表達及與淋巴管生成的關系［J］.口腔醫學研究，2014，30（2）:159-162］.

（2015-04-06收稿 2015-06-22修回）

（本文編輯 胡小寧）

Expressions of FEZ1 and HIF-1α protein in oral squamous cell carcinoma and its prognosis

ZHANG Jinhong1，LIU Junying2，LIU Jian3，LIU Yueping2△
1 Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China；2 Department of Pathology，the Fourth Affiliated Hospital，Hebei Medical University；3 Department of Stomatology，the Fourth Affiliated Hospital，Hebei Medical University△

ObjectiveTo investigate the expressions of tumor suppressor gene FEZ1 and hypoxia inducible factor（HIF）-1α in oral squamous cell carcinoma（OSCC），and their correlation with clinicopathological features and prognosis. MethodsA total of 146 specimens of OSCC and 80 normal oral mucosa were used to detect the expressions of FEZ1 and HIF-1α by immunohistochemistry.Thirty specimens of fresh OSCC tissues，30 samples of the paracancerous tissues and 30 normal mucosa tissues were also included in the study.The relationship between the expressions of FEZ1 and HIF-1α，the clinicopathological features and the prognosis of the patients were analyzed.Western blot assay was used to detect the expres?sions of FEZ1 and HIF-1α in 30 fresh OSCC tissues，30 samples of the paracancerous tissues and 30 normal mucosa tissues. ResultsIn OSCC tissues，the positive rate of FEZ1 protein（30.14%）was significantly lower than that in normal oral muco?sa（81.25%），and the positive rate of HIF-1α protein（71.23%）was significantly higher than that in normal mucosa（12.50%，χ2=54.076 and 71.317，P＜0.01）.There was a correlation between the expression of FEZ1 and clinical stage，tumor size and differentiation.The expression of HIF-1α was correlated with gender，lymph node metastasis，tumor size and differentiation. There was no significant difference in 5-year survival rate between positive and negative FEZ1 expression groups.The 5-year survival rate was significantly lower in HIF-1α positive expression group than that of HIF-1α negative expression group（P＜0.05）.The expression level of FEZ1 was decreased by the sequences in normal oral mucosa，paracancerous tissue and OSCC（P＜0.01），but the expression level of HIF-1α was increased in turn（P＜0.01）.ConclusionFEZ1 and HIF-1α may be involved in the occurrence and progress of OSCC.The expressions of FEZ1 and HIF-1α can be used as a reference for the biological behavior of OSCC.

oral squamous cell carcinoma；FEZ1；hypoxia inducible factor-1α；immunohistochemistry；Western blot；clinical features；survival analysis

R782

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.024

河北省衛生廳科研基金項目（項目編號20100281）

1河北醫科大學第一醫院口腔科（郵編050031）；2河北醫科大學第四醫院病理科；3河北醫科大學第四醫院口腔科

張晉弘（1975），男，碩士，主治醫師，主要從事口腔頜面外科研究

△通訊作者E-mail：annama@163.com