槲皮素對肝細胞氧化應激損傷的保護作用

沈欽海，秦召敏△，劉麗，岳淑英，呂建華，魯艷芹

槲皮素對肝細胞氧化應激損傷的保護作用

沈欽海1，秦召敏1△，劉麗1，岳淑英1，呂建華1，魯艷芹2

目的探討槲皮素對氧化應激Chang liver細胞損傷的保護作用及其作用的分子機制。方法培養Chang liver細胞，將細胞隨機分為正常對照組、H2O2組及槲皮素低、中、高劑量組。MTT法檢測肝細胞的存活率；流式細胞術檢測細胞凋亡率。2′,7′-二氯熒光素乙二酯（DCFH-DA）細胞內活性氧（ROS）熒光染色后，熒光顯微鏡觀察照相及流式細胞儀檢測細胞內活性氧水平。試劑盒測定細胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及細胞中丙二醛（MDA）的含量。采用Western blot法檢測Nrf2蛋白的表達。結果H2O2組較正常對照組細胞存活率、SOD、GSH-Px、CAT活性降低（P＜0.05），凋亡率、平均熒光強度（MFI）及MDA升高（P＜0.05）。不同劑量槲皮素組細胞存活率及細胞內SOD、GSH-Px、CAT活性高于H2O2組（P＜0.05），MDA、凋亡率、MFI水平低于H2O2組（P＜0.05）。槲皮素低、中及高劑量組Nrf2蛋白均高于H2O2組（P＜0.05）。結論槲皮素對氧化應激肝細胞損傷具有保護作用，其機制可能與激活Nrf2-ARE通路，進而增強下游抗氧化基因的表達有關。

槲皮素；氧化性應激；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；谷胱甘肽過氧化酶；Chang liver細胞；Nrf2/ARE通路

研究認為，氧化應激與肝臟疾病的發生密切相關［1］。其主要通過啟動膜脂質過氧化、改變生物膜功能、與生物大分子共價結合及破壞酶的活性等引起不同程度的肝損傷［2］。轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）及其誘導的下游靶基因是機體細胞最重要的抗氧化防御機制之一［3］。在氧化應激過程中，Nrf2被激活誘導靶基因保護肝臟［4］。槲皮素（quercetin）是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和茶葉中［5］。研究證實，槲皮素可通過降低脂質過氧化物水平、增加抗氧化系統的能力，從而對氧化損傷的肝

臟發揮保護效應［6］；還可通過增加Nrf2的表達，提高細胞的抗氧化能力［7］。本研究利用H2O2在體外誘導Chang liver細胞建立肝損傷模型，旨在探討槲皮素對肝細胞的保護作用及其抗氧化作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料Chang liver細胞購自中南大學湘雅中心實驗室；2′,7′-二氯熒光素探針（2′,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、槲皮素、H2O2、四甲基偶氮唑藍（MTT）及二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；胰蛋白酶及胎牛血清購自美國Hyclone公司；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；Nrf2、β-actin抗體均購于美國Santa Cruze公司；RPMI-1640細胞培養基、硝酸纖維素膜購于美國Gibco公司。

1.2 細胞培養及分組Chang liver細胞培養于含10%優質胎牛血清RPMI-1640培養液中，加入1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，于37℃、5%CO2中培養，每2～3 d用0.25%胰酶消化傳代，直至細胞處于對數生長期。細胞隨機分為正常對照組、H2O2組、槲皮素低劑量組、槲皮素中劑量組及槲皮素高劑量組。正常對照組僅用無血清培養基培養細胞，不加任何藥物處理；H2O2組用無血清培養基預培養24 h，換液后加入含400 μmol/L H2O2的無血清培養基繼續培養12 h；槲皮素各濃度組分別用含20、40、80μmol/L槲皮素的無血清培養基預培養24 h。

1.3 MTT檢測細胞活力取對數生長期Chang liver細胞，以5×104個/孔的濃度接種于96孔板，200 μL/孔，每組3個復孔，各組處理時間終止時去除培養基，分別加入MTT，終濃度為0.5 g/L，37℃繼續培養4 h后終止培養，吸棄孔內培養液；每孔加入150 μL DMSO，搖床上震蕩10 min，使結晶物充分溶解；在酶標儀上490 nm波長處測定各孔光密度（OD）值。求出各實驗組的細胞存活率。細胞存活率=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡峰及凋亡率細胞接種于6孔培養板，按上述要求給予不同因素的處理后，收集各組肝細胞，離心，PBS洗滌3次，70%冰乙醇固定，制成5×106個/L細胞懸液，加樣入流式細胞儀檢測凋亡峰及凋亡率。

1.5 細胞內活性氧（ROS）的檢測

1.5.1 顯微鏡觀察及檢測細胞內ROS各組處理時間終止后，用PBS洗滌3次，用10 μmol/L DCFH-DA染液于37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5.2 流式細胞儀檢測胞內ROS各組處理時間終止后經PBS清洗2次，收集細胞，加入10 μmol/L DCFH-DA染液于37℃孵育30 min，用PBS洗滌3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，用流式細胞儀以激發波長為488 nm，發射波長525 nm，檢測平均熒光強度（MFI），該值代表細胞內活性氧水平。

1.6 細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量檢測各組處理時間終止后，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的Chang liver細胞，收集各組細胞，將細胞加100 μL細胞裂解液充分裂解后，按照試劑盒說明書檢測細胞中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量。

1.7 Western blot檢測Nrf2的表達各組處理時間終止后，收集細胞，用PBS洗滌3次，加入裂解液充分裂解，冰上裂解1 h。4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液進行蛋白質定量，取30 μg總蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上電泳分離后，轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用稀釋的Nrf2一抗及標準內參β-actin孵育，4℃過夜。洗膜后加稀釋的二抗室溫孵育2 h，滴加電化學發光（ECL）試劑，顯影、定影，結果用灰度比值表示。

1.8 統計學方法采用SAS 6.12軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT檢測細胞存活率H2O2組較正常對照組細胞存活率降低，不同劑量槲皮素組細胞存活率較H2O2組升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1Effects of quercetin on MFI，survival rate and appotosis rate表1 槲皮素對存活率、細胞凋亡率及平均熒光強度的影響（n=3）

Tab.1Effects of quercetin on MFI，survival rate and appotosis rate表1 槲皮素對存活率、細胞凋亡率及平均熒光強度的影響（n=3）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較,b與H2O2組比較，P＜0.05；表2同

組別正常對照組H2O2組槲皮素低劑量組槲皮素中劑量組槲皮素高劑量組F存活率（%）99.06±1.57 51.46±2.82a 63.25±0.85b 87.64±2.06b 91.52±3.27b 241.18＊凋亡率（%）3.37±0.21 25.14±1.35a 13.82±1.73b 6.71±0.29b 4.26±0.95b 275.89＊MFI 20.85±0.69 63.83±1.24a 41.36±0.72b 31.67±0.48b 28.32±0.67b 127.87＊

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率H2O2組較正常對照組凋亡率增高（P＜0.05），且在正常二倍體細胞周期G0/G1峰前出現一個特征性的凋亡峰。不同劑量槲皮素組較H2O2組細胞凋亡率下降（P＜0.05），且凋亡峰變小，見表1、圖1。

2.3 ROS結果H2O2組較正常對照組的MFI增強，不同劑量槲皮素組MFI較H2O2組減弱（P＜0.05），見表1、圖2。

2.4 細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量H2O2組較正常對照組SOD、GSH-Px、CAT活性降低，MDA含量升高；不同劑量槲皮素組較H2O2組SOD、GSH-Px、CAT活性增加，MDA含量下降（P＜0.05），見表2。

Fig.1Results of apoptosis detected by flow cytometry in five groups of cells圖1 各組細胞流式細胞檢測凋亡圖

Fig.2ROS level in Chang liver cells observed under fluorescent microscope（×200）圖2 熒光顯微鏡觀察肝細胞中的ROS生成（×200）

Tab.2Effects of quercetin on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity表2 槲皮素對脂質過氧化及抗氧化酶的影響（n=3,）

Tab.2Effects of quercetin on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity表2 槲皮素對脂質過氧化及抗氧化酶的影響（n=3,）

組別正常對照組H2O2組槲皮素低劑量組槲皮素中劑量組槲皮素高劑量組F SOD（U/mL）19.14±0.93 9.18±0.74a 14.27±1.16b 16.83±0.65b 17.42±1.24b 47.75＊GSH-Px（U/mL）72.13±0.36 47.31±1.72a 56.07±1.36b 61.39±0.84b 69.82±1.92b 166.34＊＊組別正常對照組H2O2組槲皮素低劑量組槲皮素中劑量組槲皮素高劑量組F CAT（U/mg）34.92±1.64 19.53±0.75a 25.06±1.33b 28.16±1.27b 31.71±0.65b 123.29＊＊MDA（nmol/L）4.52±0.63 8.96±1.05a 6.14±0.62b 5.71±0.41b 4.83±0.68b 18.52＊

2.5 Western blot檢測Nrf2蛋白表達正常對照組、H2O2組及槲皮素低、中、高劑量組Nrf2的相對含量分別為0.24±0.02、0.35±0.01、0.46±0.04、0.58± 0.03及0.62±0.05（F=63.94，P＜0.05），其中槲皮素低、中及高劑量組均高于H2O2組（P＜0.05），見圖3。

Fig.3Expression of Nrf2 shown by Western-blot圖3 免疫印跡法檢測細胞中Nrf2蛋白的表達

3 討論

氧化應激是指各種原因導致機體組織或細胞內氧自由基生成增加和（或）清除能力降低，導致ROS在體內或細胞內蓄積而造成組織、細胞損傷的一種狀態。ROS包括過氧化物、H2O2、羥自由基以及需氧反應中產生的各種有害產物［8］。本實驗采用H2O2作用于Chang liver細胞，成功復制氧化應激模型，結果顯示，不同劑量槲皮素組較H2O2組存活率增加，凋亡率減少，表明槲皮素能明顯提高細胞存活率，減少細胞凋亡。

ROS能夠使細胞膜上的脂類氧化，產生MDA，從而造成細胞損傷并引發凋亡。研究表明，槲皮素在體外可通過與金屬離子結合、清除ROS等自由基及抑制DNA損傷等發揮抗氧化作用［9］。本研究顯示，H2O2組較正常對照組MFI增強，MDA上升，不同劑量槲皮素組較H2O2組MFI減弱，MDA降低，提示槲皮素能夠降低H2O2對肝細胞造成的損傷。SOD、

GSH-Px及CAT均屬于內源性的抗氧化酶，能夠直接清除ROS。本研究結果表明，H2O2處理可使正常肝細胞胞內SOD、GSH-Px及CAT活性降低，而槲皮素預處理后可明顯增加H2O2處理后細胞內SOD、CAT和GSH-Px活性。Nrf2屬于Cap′-n′-Collar（CNC）家族的轉錄因子［10］。通常情況下，Nrf2與其特異性受體——Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Ke?apl）偶聯結合于胞漿而使Nrf2活性處于相對抑制狀態。當氧化應激發生時，Keapl的某些半胱氨酸殘基的疏基形成二硫鍵，從而改變了其構象，使Nrf2與Keapl解耦聯，轉入細胞核內［11］。轉入核內的Nrf2與抗氧化反應元件（ARE）結合，調節下游包括HO-1、γ-GCS、NQ01等多種抗氧化基因的表達［12］。當細胞受到毒物或者氧化物質作用時，Nrf2蛋白發生磷酸化解偶聯，進入細胞核內啟動細胞內源性抗氧化應激蛋白基因等多種細胞內自我防御基因的表達，從而增強細胞的抗氧化應激能力［13］。另外，各組肝細胞Nrf2蛋白的表達結果顯示，氧化應激中Nrf2蛋白的表達上調，表明氧化應激可激活Nrf2-ARE通路，啟動內源性保護機制，即通過調控的第Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表達而達到抗氧化應激作用。槲皮素各組Nrf2表達高于H2O2組,表明槲皮素本身能夠增加Nrf2的表達，與文獻［7］結果一致，提示為提高細胞的抗氧化能力,在加入H2O2后可進一步增加Nrf2蛋白的表達。

綜上所述，經槲皮素預處理可抑制細胞凋亡，提高細胞存活率，保護體外培養的肝細胞，這種保護作用可能與Nrf2-ARE通路的激活，進而增強體內抗氧化性應激系統、清除氧自由基、抗脂質過氧化、降低細胞凋亡有關。

［1］Cederbaum AI,Lu Y,Wu D.Role of oxidative stress in alcohol-in? duced liver injury［J］.Arch Toxicol,2009,83（6）:519-548.

［2］Poli G.Pathogenesis of liver fibrosis:role of oxidative stress［J］.Mol Aspects Med，2000,21（3）:49-98.

［3］Myers CR.The effects of chromium（VI）on the thioredoxin system: Implications for regulation［J］.Free Radic Bio Med,2012,52（10）: 2091-2107.

［4］Bataille AM，Manautou JE.Nrf2：a potential target for new therapeutics in liver disease［J］.Clin Pharmacol Ther,2012,92（3）:340-348.

［5］Wach A,Pyrzynska K,Biesaga M.Quercetin content in some food and herbal samples［J］.Food Chem,2007,100（2）:699-704.

［6］Kukongviriyapan U，Sompamit K，Pannangpetch P,et al.Preventive and therapeutic effects of quercetin on lipopolysaccharide-induced oxidative stress and vascular dysfunction in mice［J］.Can J Physiol Pharmacol,2012,90（10）:1345-1353.

［7］Hou W,Liu S,Yao P,et al.Potential molecular mechanisms of qner?cetin-induced heme oxygenase-1 in rat primary hepatocytes［J］. Chin J Hepatol,2013,21（11）:865-868.［侯偉,劉爽,姚平,等.槲皮素誘導大鼠肝細胞I型血紅素氧化酶表達的分子機制［J］.中華肝臟病雜志,2013,21（11）:865-868］.

［8］Kisseleva T,Brenner DA.Role of hepatic stellate cells in fibrogene?sis and the reversal of fibrosis［J］.J Gastraenterol Hepatol,2007,22（1）:S73-78.

［9］Li Y，Deng Y，Tang Y，et al.Quercetin protects rat hepatocytes from oxidative damage induced by ethanol and iron by maintaining inter?cellular liable iron pool［J］.Hum Exp Toxicol,2014,33（5）:534-541.

［10］Zhu J,Wang H,Ji X,et al.Differential Nrf2 expression between gli?oma stem cells and non-stem-like cells in glioblastoma［J］.Oncol Lett,2014,7（3）:693-698.

11］Copple IM,Goldring CE,Kitteringham NR,et al.The Nrf2-Keapl defense pathway:role in protection against drug-induced toxicity［J］. Toxicology，2008,246（1）:24-33.

［12］Lee JM,Li J,Johnson DA,et al.Nrf2,a multi-organ protector［J］？FASEB J,2005,19（9）:1061-1066.

［13］McMahon M,Thomas N,Itoh K，et al.Dimerization of substrateadap?tors can facilitate cullin-mediated ubiquitylation of proteins by a“tetllering”mechanism：a two-site interaction model for by a“tetller?ing”mechanism：a two-site interaction model for theNrf2-keapl complex［J］.J BioI Chem,2006,281（34）:24756-24768.

（2015-02-16收稿 2015-04-07修回）

（本文編輯 陸榮展）

Protective effects of quercetin on hepatic cell damage induced by oxidative stress

SHEN Qinhai1,QIN Zhaomin1△,LIU Li1,YUE Shuying1,LYU Jianhua1,LU Yanqin2
1 Shandong Medical College，Jinan 250002，China；2 Shandong Medicinal Biotechnology Centre△

ObjectiveTo explore the protective effects of quercetin on damage induced by oxidative stress and to clari?fy its molecular mechanism.MethodsChang liver cell cultures were randomly divided into control groups,H2O2group and 3 doses of quercetin groups.Cell survival rate was detected with MTT.Cell apoptotic rate was measured by FACS（Fluores?cence-activated cell sorting）.Intracellular reactive oxygen species（ROS）level in Chang liver cells were tested by flow cy?tometer.The DCF fluorescence intensity of DCFH-DA-stained intracellular ROS was observed by fluorescence microscope. The levels of malondialdehyde（MDA）,superoxide dismutase（SOD）,catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GSH-Px）were determined in liver cells using commercial available kits.The expression of Nrf2 were detected by Western blot.ResultsCompared with control,cell survival rate and levels of SOD,CAT and GSH-Px decreased significantly in H2O2group（P＜0.05）,while cell appotosis rate,content of MDA and mean fluorescence intensity（MFI）increased in H2O2group（P＜0.05）.In comparison with H2O2,expression of Nrf2 protein was higher in all three quercetin treatment groups（P＜0.05）.ConclusionQuercetin protected Chang liver cells from H2O2-induced oxidative stress,which may be caused by the increased ex?pressions of down stream antioxidant genes via activating the Nrf2-ARE signaling pathway.

Quercetin；oxidative stress；superoxide dismutase；catalase；glutathione peroxidase；Chang liver cell；Nrf2/ ARE pathway

R965；R657.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.004

山東省衛生廳醫藥衛生發展計劃項目（2011HZ099）

1山東醫學高等專科學校（郵編250002）；2山東省醫藥生物技術研究中心

沈欽海（1966），男，醫學博士，副教授,主要從事肝病的發病機制的相關研究及治療

△通訊作者E-mail:sdyzqzm@126.com